CN109355254A

CN109355254A - 一种提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法

Info

Publication number: CN109355254A
Application number: CN201810439538.0A
Authority: CN
Inventors: 金星亮
Original assignee: NANJING YOUER BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: NANJING YOUER BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2019-02-19

Abstract

本发明公开了一种提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法，属于细胞学、生物技术领域。由4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)为基础的缓冲体系，聚乙烯醇(PolyvinylAlcohol)和氨基酸组成的蛋白质替代物，乳酸钠、葡萄糖和丙酮酸钠为细胞的基本营养成分三大部分组成。用于从各种组织中提取收集不同的活细胞，包括各种间充质干细胞及从生殖道收集的配子细胞等。既能保证细胞所必需的渗透压、营养条件和正常生理环境，又有利于细胞的体外生长、扩增及诱导分化。使这些细胞在体外保持原有的细胞生物学特性，如干细胞的多能性、配子细胞的生殖能力等。为再生医学与生殖发育医学领域中的相关流程操作提供了基本的保证。

Description

一种提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体地说涉及提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法。

背景技术

标准细胞培养基通常是以动物血清(如胎牛血清，FBS)作为营养和其他尚不明确的因子组成。使用血清的技术缺陷包括这些血清本身不确定的自然性质、成分中批次的变异性和污染的风险。即使是无血清的培养基，其中也可能含有未确定的动物源性产品，如血清白蛋白(从血液中纯化)、水解物、生长因子、激素、载体蛋白和附着因子等。这些动物衍生产品含有复杂的污染物，如脂蛋白。

从组织器官中提取收集细胞的流程中需要一系列特殊的试剂。这些试剂必须既无细胞毒性，又能保证在提取收集细胞过程中细胞数量、质量及生物学特性的完整性。其中细胞缓冲液几乎用于每一个交替步骤之间。通常的细胞缓冲液有生理盐水和磷酸盐平衡液(PBS)。而这些以无机盐为主的细胞缓冲液的缺点是不含有维持细胞的基本营养成分，无法保证活细胞所需要的渗透压，并可能引起细胞与细胞之间相互粘连甚至导致细胞损伤破裂。与细胞提取流程相关的液体必须完全没有动物源性成分，既不能含有胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，又必须保证活细胞的活力，维持其原始的生物学特性。为了达到这些目的，本发明的细胞缓冲液在基本无机盐的基础上，以HEPES缓冲剂为缓冲体系，用PVA和非必需氨基酸作为蛋白质替代物，并添加了细胞基本营养成分，保证了提取收集整个流程中细胞生理学特性的稳定，有利于细胞的进一步扩增及生长。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供了提取收集活细胞用的细胞缓冲液，本发明的另一个目的是提供上述细胞缓冲液的配制方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法，由缓冲液体系、蛋白质替代物和细胞基本营养成分组成，其特征在于：

所述缓冲体系由基本无机盐和缓冲剂HEPES组成；

所述蛋白质替代物由PVA和非必需氨基酸组成；

所述细胞基本营养成分由乳酸钠、丙酮酸钠和葡萄糖组成。

对于本发明涉及的HEPES是一种两性有机化学缓冲剂，广泛应用于细胞培养中。与碳酸氢钠缓冲液不同，HEPES并不受二氧化碳浓度的变化而变化，因此能更好地保持了稳定的生理pH值。水的离解常数(pK)随温度的下降而减小，但许多其他缓冲体系的离解常数随温度变化不明显。HEPES就像水一样，它的离解常数随着温度的下降而减小。这使HEPES成为一种更有效的缓冲剂，在低温下能维持酶的结构和功能。

对于本发明涉及的PVA是一种无毒、水溶性高分子聚合物，呈白色粉末状、片状或絮状固体。它和氨基酸组合可以替代血清白蛋白作为培养液的成分。其主要作用是维持培养液渗透压，保护细胞正常生理学特性。

进一步的，对于细胞缓冲液，所述PVA浓度为0.1～0.3毫克/毫升，所述非必需氨基酸包括7种非必需氨基酸：甘氨酸(Glycine)、L-丙氨酸(L-Alanine)、L-天冬酰胺(L-Asparagine)、L-天冬氨酸(L-Asparticacid)、L-谷氨酸(L-Glutamicacid)、L-脯氨酸(L-Proline)和L-丝氨酸(L-Serine)。所述7种非必需氨基酸的浓度都为90～110微摩尔。

进一步的，对于细胞缓冲液，所述HEPES浓度为15～30毫摩尔。

进一步的，对于细胞缓冲液，所述细胞基本营养成分含有18～25毫摩尔乳酸钠、0.3～0.5毫摩尔丙酮酸钠、0.15～0.25毫摩尔葡萄糖。

进一步的，对于细胞缓冲液，所述基本无机盐包括氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁和碳酸氢钠。

具体地说，所述基本无机盐含有90～110毫摩尔氯化钠、4～5毫摩尔氯化钾、0.3～0.5毫摩尔磷酸二氢钾、1.5～2.5毫摩尔氯化钙、0.15～0.25毫摩尔硫酸镁、2～6毫摩尔碳酸氢钠。

作为本发明的最优方案，所述基本无机盐含有102毫摩尔氯化钠溶液、4.6毫摩尔氯化钾、0.45毫摩尔磷酸二氢钾、2.05毫摩尔氯化钙、0.20毫摩尔硫酸镁和4毫摩尔碳酸氢钠。Na⁺/K⁺比例是22.17；Ca⁺⁺/Mg⁺⁺比例是10.25。

作为本发明的最优方案，所述HEPES浓度为21毫摩尔，PVA浓度为0.1毫克/毫升，全部7种非必需氨基酸的浓度均为0.095毫摩尔，乳酸钠浓度为21.4毫摩尔、丙酮酸钠浓度为0.40毫摩尔、葡萄糖浓度为0.20毫摩尔。

一种提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法，配制PVA时先配置50倍的母液，在超净水中逐渐加温至80～90℃，完全溶解，最终工作浓度为0.1毫克/毫升；

一种提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法，配制HEPES时先配置0.154摩尔的母液，并通过酸碱滴定，调节pH值至7.4。最终工作浓度为21毫摩尔。

有益效果：本发明的提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法通过在基本无机盐的基础上加入HEPES缓冲剂，不受CO₂浓度的影响，因此在细胞提取收集的较长时间过程中保持了生理性pH值的稳定性；PVA起到了稳定渗透压的作用，避免了细胞的损伤；并含有细胞基本的营养成分和氨基酸保证了提取收集活细胞过程的基本营养需要。活细胞在含这种优化的缓冲液中保持了高效的细胞生物学活性，有利于活细胞的进一步生长和发挥生理功能。为细胞培养的成功率提供了重要的手段。

附图说明

图1细胞缓冲液pH值和渗透压稳定性研究

新鲜配制的细胞缓冲液的pH值是7.2±0.2，渗透压是290±5.5mOsm/kg，数据代表了共10个批次的细胞缓冲液的统计学分析，每个批次间无显著不同(p>0.05)。将10个批次的细胞缓冲液避光密闭储存于4℃，然后每周检测pH值和渗透压至14周，未发现显著变化(p>0.05)。

图2比较细胞缓冲液与PBS缓冲液对脂肪间充质干细胞细胞活性及生长能力的影响

两组等重量的人脂肪中分别使用细胞缓冲液或PBS缓冲液提取收集间充质干细胞：

(A)产生了不同的细胞数量(p<0.01)和细胞活力(p<0.01)。

(B)进一步以同样细胞密度进行细胞培养，在P0代的细胞生长能力明显不同，即使到P5代以同样细胞密度再进行细胞培养，细胞的生长能力也明显不同。数据代表了10个不同的个体样本。

图3比较细胞缓冲液与PBS缓冲液对脂肪间充质干细胞的生理特性及多能性的影响

(A)使用流式细胞仪分析第5代细胞几个脂肪间充质干细胞特征性生物学标记，使用PBS缓冲液明显比使用细胞缓冲液降低了这些生物学标记的表达率(p<0.01)，数据代表了10个不同的个体样本。

(B)细胞缓冲液提取收集的脂肪间充质干细胞有正常的细胞诱导分化能力。脂肪间充质干细胞可以诱导为：(1)脂肪细胞、(2)软骨细胞和(3)成骨细胞。

图4比较细胞缓冲液、PBS缓冲液与标准的Mod-hTF培养液收集小鼠卵母细胞后对卵母细胞体外受精及胚胎发育的影响

经超排的60只母鼠随机分为三组，分别以PBS缓冲液、细胞缓冲液和标准的Mod-hTF收集卵母细胞：

(A)比较体外受精率、囊胚形成率和囊胚细胞数。*p<0.01，比较细胞缓冲液或标准的Mod-hTF。每组均超过400个卵母细胞。

(B)使用Hoechst33342对囊胚细胞核DNA进行染色检测囊胚细胞数。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1

1.配制0.154摩尔的HEPES母液

a)取6.2毫升1摩尔的氢氧化钠，加入65毫升MilliQ超净水；

b)称取3.67克HEPES，加入至上液，混合，使其充分溶解；

c)用1摩尔的氢氧化钠滴定，调节pH值至7.4；

d)加入29毫升MilliQ超净水，储存于4℃，有效期为一个月。

2.配制5毫克/毫升PVA母液

先配制5毫克/毫升的母液。方法是(以配制50毫升为例)：称取250克PVA加MilliQ水至50毫升，温和加热至可在80～90℃水中，混摇均匀至完全溶解。

3.一种提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法，由基本无机盐、HEPES缓冲液、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖和蛋白替代物(PVA和非必需氨基酸)组成。

基本无机盐含有90～110毫摩尔氯化钠、4～5毫摩尔氯化钾、0.3～0.5毫摩尔磷酸二氢钾、1.5～2.5毫摩尔氯化钙、0.15～0.25毫摩尔硫酸镁、2～6毫摩尔碳酸氢钠。无机盐组分含量的确定根据实际需求而定，pH值维持在7.3～7.5。

本实施例公开的一种配方，具体如表1所示：

表1实施例1细胞缓冲液的配方

实施例1中的细胞缓冲液使用后所提取收集的细胞保持着比其它缓冲液更好的生物学特性和细胞活性。请参考试验例部分的相关试验进行说明。

实施例2

本实施例与实施例1基本相同，其区别在于细胞缓冲液的配方如表2所示：

表2实施例2细胞缓冲液的配方

实施例3

本实施例与实施例1基本相同，其区别在于细胞缓冲液的配方如表3所示：

表3实施例3细胞缓冲液的配方

试验例1

细胞缓冲液pH值和渗透压稳定性研究

新鲜配制的细胞缓冲液的pH值是7.2±0.2，渗透压是290±5.5mOsm/kg。将细胞缓冲液避光密闭储存于4℃，然后每周检测pH值和渗透压至14周未发现显著变化(图1)。

试验例2

比较细胞缓冲液与PBS缓冲液对脂肪间充质干细胞细胞活性及多能性的影响

提取收集脂肪间充质干细胞的基本步骤中使用细胞缓冲液与PBS缓冲液的比较：

1.脂肪切除或吸脂的方法收集人脂肪组织；

2.称取同重量的组织分别由以细胞缓冲液与PBS缓冲液中重复漂洗，用移液管将组织下层的液体吸出，至所吸出的液体清晰为止；

3.加入与组织相同体积的0.1～0.2mg/mLI-型胶原酶，在37℃消化30～60分钟；加入含10％小牛血清(FetalBovineSerum，FBS)的培养液中止消化，以1000×g速度离心15分钟，除去上中层；

4.下层细胞层，用细胞缓冲液或PBS缓冲液洗涤，室温下以离心力300×g离心5分钟，移去上层液，重复三次；

5.去除红细胞：加0～160mMNH₄Cl，混匀，室温下静置10分钟；300×g离心力室温下离心5分钟，去上清；

6.用细胞缓冲液或PBS缓冲液洗涤，室温下以离心力300×g离心5分钟，移去上层液，重复三次；

7.将下层细胞再悬浮于细胞培养液中；

8.取脂肪间充质干细胞样品作细胞计数，进行细胞分子生物学分析(图2A)；细胞缓冲液处理的样本每克脂肪可提取0.5～1×10⁶脂肪间充质干细胞数，活细胞数80％；而PBS缓冲液处理的样本每克脂肪仅可提取0.01～0.03×10⁶脂肪间充质干细胞数，活细胞数40％左右；

9.继续分析两种缓冲液所收集的细胞体外生长能力。以相同的密度在相同的条件下接种作细胞培养扩增，脂肪间充质干细胞典型的形态学特征是梭型，贴壁生长；PBS缓冲液处理的样本的脂肪间充质干细胞的生长速度较慢(图2B)。其中扩增到第5代细胞用流式细胞术检测，分析CD44、CD166、HLA1、CD105和CD73等5个脂肪间充质干细胞分子标志物的表达情况(图3A)。PBS缓冲液处理的样本的脂肪间充质干细胞数，都表达了较低的CD44、CD166、HLA1、CD105和CD73；

10.对其中扩增的第5代细胞进行了定向诱导分化研究，自体脂肪间充质干细胞能在体外定向诱导分化为成成骨细胞和软骨细胞(图3B)。PBS缓冲液处理的样本的脂肪间充质干细胞分化能力较差。

从图2～3中可以看出，本发明的细胞缓冲液较目前常用的PBS缓冲液具有显著增效作用，表现为样本内能分离提取出更多的活力细胞，并保持更强的自我更新扩增能力，干细胞的生理学特性及定向诱导分化能力。

试验例3

分析对小鼠卵子受精能力的影响

本试验例将超排后母鼠体分为三组收集处理卵母细胞，一组用PBS缓冲液，第二组用实施例1的细胞缓冲液，另一组用含白蛋白的标准品Mod-hTF(购于Merck)。卵母细胞在同一种标准的受精液做体外受精(IVF)实验，并继续在同一种标准的胚胎培养液中培养96小时。比较囊胚形成率及囊胚内细胞数。

囊胚细胞计数方法：通过采用2％的福尔马林固定胚胎30分钟，用每毫升10微克Hoechst33342染色，制片，荧光显微镜下检测每个胚胎的总细胞数。

结果如图4所示，可以看出，本发明的细胞缓冲液收集处理的卵母细胞与临床应用的含有白蛋白的标准品产生了相似的受精率、囊胚形成率和囊胚细胞数；PBS缓冲液明显降低了卵母细胞的质量(p<0.001)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种提取收集活细胞用的细胞缓冲液及其配制方法(以下简称细胞缓冲液)，由缓冲体系、蛋白质替代物和细胞基本营养成分组成，其特征在于：

所述缓冲体系由基本无机盐和缓冲剂HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)组成；

所述蛋白质替代物由聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol，简称PVA)和非必需氨基酸组成；

所述细胞基本营养成分由乳酸钠、丙酮酸钠和葡萄糖组成。

2.根据权利要求1中所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：所述基本无机盐包括氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠。

3.根据权利要求2所述的一种细胞缓冲液，其特征在于，所述基本无机盐包括：

氯化钠 90～110毫摩尔；

氯化钾 4～5毫摩尔；

磷酸二氢钾 0.3～0.5毫摩尔；

氯化钙 1.5～2.5毫摩尔；

硫酸镁 0.15～0.25毫摩尔；

碳酸氢钠 2～6毫摩尔；

Na⁺/K⁺比例是21～23；

Ca⁺⁺/Mg⁺⁺比例是9.5～11。

4.根据权利要求1～3中所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：所述缓冲体系的HEPES，其作用是维持细胞缓冲液的酸碱度(pH值)，能用于空气环境，不适用于富CO₂的环境(如CO₂培养箱)。

5.根据权利要求4所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：所述缓冲体系的HEPES的浓度为15～30毫摩尔。

6.根据权利要求1中所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：所述蛋白质替代物中的PVA，用于维持细胞缓冲液的渗透压，发挥血清白蛋白的作用，保持细胞形态学及生物学特性。

7.根据权利要求6所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：每毫升细胞缓冲液含有0.1～0.3毫克PVA。

8.根据权利要求1中所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：所述蛋白质替代物中含有7种非必需氨基酸(如表1)。

表1 细胞缓冲液中非必需氨基酸的浓度

9.根据权利要求1中所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：所述细胞基本营养成分包括乳酸钠、丙酮酸钠和葡萄糖。

10.根据权利要求9所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：所述乳酸钠的浓度为18～25毫摩尔。

11.根据权利要求9所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：所述丙酮酸钠的浓度为0.30～0.50毫摩尔。

12.根据权利要求9所述的一种细胞缓冲液，其特征在于：所述葡萄糖的浓度为0.15～0.25毫摩尔。

13.根据权利要求5所述的HEPES配制方法，其特征在于：

1)先配制0.154摩尔的HEPES母液，方法是(以配制100毫升为例)：

a)取6.2毫升1摩尔的氢氧化钠，加入65毫升MilliQ超净水；

b)称取3.67克HEPES加入至上液，混合，标准室温下(25℃)混摇均匀至完全溶解；

c)用1摩尔的氢氧化钠滴定，调节pH值至7.4；

d)加入MilliQ水至总量100毫升，储存于4℃，有效期为一个月；

2)然后配制细胞缓冲液，工作浓度为15～30毫摩尔。

14.根据权利要求7所述的PVA配制方法，其特征在于：

1)先配制5毫克/毫升的母液，方法是(以配制50毫升为例)：称取250克PVA加MilliQ水至50毫升，温和加热至80～90℃，混摇均匀至完全溶解；

2)然后配成细胞缓冲液，工作浓度为0.1～0.3毫克/毫升。