CN109825564B

CN109825564B - 一种slc2a1表达在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用

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Publication number: CN109825564B
Application number: CN201910275767.8A
Authority: CN
Inventors: 金星亮; 季煦; 韩倩倩; 常露; 杨五宁; 杨连增
Original assignee: Nanjing Youer Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Nanjing Youer Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2019-04-05
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2039-04-05
Also published as: CN109825564A

Abstract

本发明公开了一种SLC2A1表达在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用。作为一项评估卵母细胞生理功能的方法，属于细胞学、生物技术领域。其最主要的特性是：1）在卵母细胞中，SLC2A1是葡萄糖转运蛋白家族中表达最多的葡萄糖转运蛋白；2）在卵母细胞中，SLC2A1表达量与其受精能力成正相关；3）未能受精的卵母细胞表现了SLC2A1基因的缺失和显著下降；4）这种卵母细胞受精能力检测试剂盒是通过实时荧光定量反转录多肽链反应（qRT‑PCR）法，检测分析同一卵母细胞中SLC2A家族目前已知的全部成员的表达，发现SLC2A1与卵母细胞质量及其受精能力有关，为辅助生殖技术的质量控制提供了有效的生物学评估手段。

Description

一种SLC2A1表达在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用

技术领域

本发明涉及生殖生物学和生殖医学领域，具体地说涉及一种利用定量检测卵母细胞中葡萄糖转运蛋白SLC2A1的表达量，制备卵母细胞受精能力检测试剂盒，评估卵母细胞质量及其受精能力的新方法。

背景技术

葡萄糖是哺乳动物细胞一种重要的能量来源。葡萄糖代谢直接影响生殖细胞的生殖能力，影响从受精到囊胚(植入前胚胎，PreimplantationEmbryo)各期的胚胎发育及囊胚植入着床能力。卵母细胞成熟包括核成熟和细胞质成熟，能量代谢对其成熟至关重要，卵母细胞通过各种底物，包括碳水化合物、氨基酸和脂肪获得能量。研究表明葡萄糖是卵母细胞成熟必需的底物。一方面，糖类存在于卵泡中，主要是通过围绕在卵母细胞周围的颗粒细胞转化成丙酮酸，然后丙酮酸被传递到卵母细胞内进行羧酸循环和氧化磷酸化，提供所需的能量。更重要的是，哺乳动物卵母细胞直接利用葡萄糖，核成熟过程中MII减数分裂对葡萄糖的需求增加，并且不依赖于其丙酮酸的糖酵解。营养过剩和营养不足问题影响哺乳动物繁殖的整个进程，影响卵泡和卵母细胞发育成熟、排卵、受精以及胚胎植入和早期胎儿的发育。营养不良，其中包括慢性(长期)和急性(短期)的饮食限制，已被证明能显著降低血清中葡萄糖水平，削弱很多生理生殖过程。

葡萄糖是精卵结合所必需的。受精的发生必须需要雄性配子吸收和利用葡萄糖，而不是果糖或其他己糖；培养基中葡萄糖的存在是成功受精所必需的，同时葡萄糖的存在保障了植入前胚胎(PreimplantationEmbryo)的发育能力。

细胞利用葡萄糖主要依靠葡萄糖转运蛋白(GLUTs，又称SLC2A)作为载体，将葡萄糖转运到细胞内。迄今为止，已知SLC2A家族有13位成员，包括：SLC2A1～13。SLC2A蛋白被分成三类：I类包括SLC2A1～4；II类包括SLC2A5、SLC2A7、SLC2A9和SLC2A11；III类包括SLC2A6、SLC2A8、SLC2A10、SLC2A12和SLC2A13。

第一个被鉴定的葡萄糖转运蛋白是SLC2A1(GLUT1)。人类和小鼠的SLC2A1有98％的同源性，其他的SLC2A则有40％的同源性。不同的SLC2A有不同的底物特异性、动力学特征、组织和细胞分布，而且应对不同的细胞外刺激产生作用，说明每个SLC2A发挥了不同的生理作用，从而可以精确调节葡萄糖代谢。SLC2A1广泛存在于各种组织，参与基本的葡萄糖代谢。第一个与SLC2A相关的重要的疾病是葡萄糖转运蛋白1缺陷综合症(GlucoseTransporter Type 1Deficiency Syndrome，De Vivo Disease)，由De Vivo在1991年首先报道。主要表现为婴儿出生后几个月发生癫痫，导致进行性精神功能障碍；另一个重要的特征是发作性运动障碍。然而，葡萄糖代谢在卵母细胞发育、受精及植入前胚胎发育过程中的调控机制尚不明了，特别是参与葡萄糖代谢的葡萄糖转运蛋白有待于更深入研究。本发明报道了SLC2A1是最关键的葡萄糖转运蛋白，直接关系到卵母细胞的质量，是检测卵母细胞的质量的生物学指标。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种SLC2A1表达在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，为辅助生殖技术的质量控制包括优化体外培养条件及优化体外培养液提供了更敏感和有效的手段。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种SLC2A1表达在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，采用基于TaqMan金标准的qRT-PCR方法定量检测小鼠和人卵母细胞中葡萄糖转运蛋白SLC2A1的表达量，方法包括：

1.提取纯化卵母细胞或受精卵的RNA；

2.RNA反转录合成cDNA；

3.基于TaqMan金标准，利用TaqMan探针PCR扩增；

优选地，所述方法1提取纯化卵母细胞或受精卵的RNA。具体方法如下：

1)提取卵母细胞或受精卵的RNA：

a.按常规收集标本；

b.用预冷的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)清洗样本至少三次；

c.用胚胎移植装置将单个受精卵或卵母细胞转移到含2μL的RNA抽提液的PCR离心管中，所述抽提液为1×PCR缓冲液中加入0.1IU RNA酶抑制剂；

d.将离心管放入液氮中冻融，重复三次；

2)纯化卵母细胞或受精卵的RNA：

提取的RNA用DNase酶破坏DNA进一步纯化。每个受精卵或卵母细胞RNA用0.1IUDNase，经过37℃下10分钟，加0.1μL 25mM EDTA终止DNase酶，95℃下孵化1分钟。纯化的RNA可直接用于反转录或储存在零下80℃备用，最长可储备6个月；

优选地，所述方法2RNA反转录合成cDNA。具体方法如下：

1)进行反转录反应，其反应体系如下：

其中，反转录反应条件如下：

2)在该条件下同时进行反转录阴性对照(不加入反转录酶或RNA模板)和阳性对照(以正常组织细胞RNA为模板)；

优选地，所述方法3基于TaqMan金标准的PCR扩增。具体方法如下：

1)反转录反应产物进行实时荧光定量PCR扩增，PCR反应体系如下：

2)本发明使用TaqMan金标准的PCR条件如下：

在该条件下同时扩增阴性对照(不加入cDNA模板)和阳性对照(包括看家基因的表达，如ACTB的表达，以及SLC2A1基因在正常组织细胞中的表达)；

计算出正常组织细胞中SLC2A1基因与看家基因的Ct值差(ΔCt₁)和卵母细胞或受精卵中SLC2A1基因与看家基因的Ct值差(ΔCt₂)，采用相对定量

的方法检测SLC2A1基因的表达量。

有益效果：本发明的一种SLC2A1表达在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，通过检测卵母细胞葡萄糖转运蛋白SLC2A1mRNA的表达，定量评估卵母细胞的质量。卵母细胞的质量反映在两个方面：受精能力和受精率，因此未能受精的卵母细胞SLC2A1表达缺失或显著下降。通过小鼠卵母细胞，可以系统分析葡萄糖转运蛋白SLC2A1在卵母细胞发育以及植入前胚胎各期的表达特征，从而为研究人类卵母细胞和植入前胚胎发育提供基础；通过人类卵母细胞及胚胎研究，特别是发现了未能受精的卵母细胞SLC2A1表达缺失或显著下降，证明了SLC2A1与卵母细胞质量直接相关。本发明可作为体外卵子成熟的观察指标，为辅助生殖技术提供了一种简单易行的敏感的质量控制手段。

附图说明

图1小鼠MII期卵母细胞中12个已知SLC2A基因的表达；

图2小鼠和人类卵母细胞成熟过程中SLC2A1基因的表达；

图3小鼠MII期卵母细胞的受精能力与SLC2A1的关系；受精率及卵母细胞SLC2A1表达率(图3-A)；受精卵和未受精卵SCL2A1表达量对比(图3-B)；

图4小鼠和人类未能受精的卵母细胞中SLC2A1的表达率(图4-A)及表达量(图4-B)。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1

本发明分析了所有已知12种葡萄糖转运蛋白(SLC2A)在小鼠MII卵母细胞的情况。从图1中可发现除SLC2A2外，其它11种SLC2A都表达。SLC2A1是表达最多的葡萄糖转运蛋白，与看家基因ACTB表达相当，而其它表达量都很少。

具体检测流程包括：

1)选择6～8周龄雌鼠，经腹腔注射PMSG，10IU/只。48h后经腹腔注射hCG超排，10IU/只；HCG注射20小时后处死；

2)将在输卵管壶腹部收集到的絮状卵母细胞团放置到经37℃预热的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即转移；

3)显微镜下收集。在预冷PBS漂洗，重复3次。30个卵母细胞移至5微升的RNA缓冲液中；通过3次液氮冻融，收集全部RNA；

4)DNase破坏DNA，以纯化RNA；

5)收集的RNA用DNase破坏DN进一步纯化。每个受精卵或卵母细胞RNA用0.1IUDNase，经过37℃下10分钟，加0.1μL25mM EDTA终止DNase酶活性，95℃下1分钟；

6)反转录合成cDNA是通过随机引物(如Oligo dt)和反转录酶为基础的反转录合成体系；RNA反转录合成DNA，具体方法如下：

进行反转录反应，其反应体系如下：

其中，反转录反应条件如下：

1)利用TaqMan探针的荧光定量分析SLC2A的表达；使用TaqMan金标准的PCR条件如下：

在该条件下同时放大扩增阴性对照(不加入反转录酶或RNA模板)和阳性对照(包括看家基因，如ACTB,和目的基因在已知的组织细胞中的表达)；

计算出组织细胞中检测目的基因与看家基因的阈值差(ΔCt)，和胚胎中检测目的基因与看家基因的阈值差(ΔCt)，采用相对定量

的方法检测目的基因的表达量。

实施例2比较分析小鼠和人类卵母细胞成熟过程中表达SLC2A1基因

从图2中发现，GV期卵母细胞已经检测到SLC2A1mRNA，并随着发育成熟，SLC2A1表达增加(p<0.001)，但小鼠和人类之间无差异(p>0.05)。

具体检测流程包括：

1)选择6～8周龄雌鼠，经腹腔注射PMSG 10IU/只。48h后经腹腔注射hCG 10IU/只超排，HCG注射16-20小时后处死；

2)在输卵管壶腹部收集到的絮状卵母细胞团放置到37℃提前预热好的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即转移；

3)人类卵母细胞来源于辅助生殖中心的自愿捐献的废弃的卵母细胞；

4)显微镜下收集。在预冷PBS漂洗，重复3次。单个卵母细胞移至2微升的RNA缓冲液中；通过3次液氮冻融，收集全部RNA；

5)收集的RNA通过用DNase破坏DNA进一步纯化。每个受精卵或卵母细胞RNA用0.1IU DNase，经过37℃下10分钟，加0.1μL25mM EDTA终止DNase酶活性，95℃下1分钟；

6)反转录合成cDNA是通过Oligo dt随机引物和反转录酶为基础的反转录合成体系；RNA反转录合成DNA，具体方法如下：

进行反转录反应，其反应体系如下：

其中，反转录反应条件如下：

7)利用TaqMan探针的荧光定量分析SLC2A1的表达；每个卵母细胞cDNA的一半用于放大SLC2A1，另一半ACTB。使用TaqMan金标准的PCR条件如下：

在该条件下同时放大扩增阴性对照(不加入反转录酶或RNA模板)和阳性对照(包括ACTB和目的基因在已知的组织细胞中的表达)；

8)计算出组织细胞中检测目的基因与看家基因的阈值差(ΔCt)和胚胎中检测目的基因与看家基因的阈值差(ΔCt)，采用相对定量

的方法检测目的基因的表达量。

实施例3

小鼠MII卵母细胞的受精能力与SLC2A1的关系。受精率及卵母细胞阳性SLC2A1表达率(图3-1)；受精卵和未受精卵SCL2A1表达量对比(图3-2)。

具体检测流程包括：

1)选择6～8周龄雌鼠，经腹腔注射PMSG 10IU/只；48h后经腹腔注射hCG 10IU/只超排，HCG注射并与已经证实有生育能力的公鼠合笼过夜，18至22小时后处死见栓雌鼠；

2)在输卵管壶腹部收集到的絮状卵母细胞团放置到37℃提前预热好的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后，立即转移；

3)显微镜下并检查受精卵母细胞与未能受精的卵母细胞，分别收集；计算出受精率；

4)在预冷PBS漂洗，重复3次。单个卵母细胞移至2微升的RNA缓冲液中；通过3次液氮冻融，收集全部RNA；

5)收集的RNA通过用DNase破坏DNA进一步纯化。每个受精卵或卵母细胞RNA用0.1IU DNase，经过37℃下10分钟，加0.1μL 25mM EDTA终止DNase酶活性，95℃下1分钟；

进行反转录反应，其反应体系如下：

其中，反转录反应条件如下：

1)利用TaqMan探针的荧光定量分析SLC2A1的表达；每个卵母细胞cDNA的一半用于放大SLC2A1，另一半ACTB。使用TaqMan金标准的PCR条件如下：

2)计算出组织细胞中检测目的基因与看家基因的阈值差(ΔCt)和胚胎中检测目的基因与看家基因的阈值差(ΔCt)，采用相对定量

的方法检测目的基因的表达量；

结果如图3-A所示，可以看出，超过80％以上的卵母细胞已经受精，并都检测到SLC2A1；如图3-B通过比较，SLC2A1在受精卵的表达明显超过了未受精的乱母细胞(p<0.001)。

实施例4

在小鼠和人类未能受精卵母细胞表达率(图4-1)及表达量(图4-2)。

具体检测流程包括：

1)小鼠未能受精卵母细胞来源于实施例3所述；

2)人类未能受精卵母细胞来源于辅助生殖中心按规定可以废弃的卵母细胞；

3)显微镜下在预冷PBS漂洗，重复3次。单个卵母细胞移至2微升的RNA缓冲液中；通过3次液氮冻融，收集全部RNA；

4)收集的RNA通过用DNase破坏DNA进一步纯化。每个受精卵或卵母细胞RNA用0.1IU DNase，经过37℃下10分钟，加0.1μL25mM EDTA终止DNase酶活性，95℃下1分钟；

5)反转录合成cDNA是通过Oligo dt随机引物和反转录酶为基础的反转录合成体系；RNA反转录合成DNA，具体方法如下：

进行反转录反应，其反应体系如下：

其中，反转录反应条件如下：

的方法检测目的基因的表达量；

从图4-A可以看出，小鼠和人类未受精的卵母细胞中分别有25％-30％仍可以检测到SLC2A1mRNA；但即使如此，从图4-B可以看出这些未受精的卵母细胞中SLC2A1mRNA的表达量较低(与图3-B受精卵相比较)。

本发明通过分析小鼠及人类卵母细胞受精能力与葡萄糖转运蛋白SLC2A1表达的关系，为检测人类辅助生殖技术的质量控制及生殖医学研究提供了参考标准。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种检测SLC2A1表达的试剂在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，其特征在于：以定量检测卵母细胞中葡萄糖转运蛋白SLC2A1的表达与卵母细胞受精能力的关系为基本标准，检测不同时期的卵母细胞受精能力；具体包括如下步骤：

(1)收集超排的小鼠卵母细胞或其它哺乳类卵母细胞；

(2)在显微镜下收集卵母细胞，用预冷的PBS清洗卵母细胞3次；将单个卵母细胞移至含有1～10μL RNA抽提液的PCR离心管中；将离心管放入液氮中冻融，如此重复3次；

(3)纯化RNA体系是通过DNase降解DNA，每个卵母细胞加0.1IU的DNase；

(4)反转录合成cDNA是利用随机引物和反转录酶为基础的反转录合成体系；

(5)利用基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR法检测分析SLC2A的表达；

(6)计算出SLC2A与看家基因的Ct值差，采用相对定量2^-△△ct的方法检测目的基因的表达量。

2.根据权利要求1所述的一种检测SLC2A1表达的试剂在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述卵母细胞包括GV期、MI期和MII期的卵母细胞。

3.根据权利要求1所述的一种检测SLC2A1表达的试剂在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述抽提液具体为1×PCR缓冲液中加入0.1IU RNA酶抑制剂。

4.根据权利要求1所述的一种检测SLC2A1表达的试剂在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，其特征在于：步骤(3)中，所述纯化RNA体系具体为：每个受精卵或卵母细胞RNA用0.1IU DNase，经过37℃下保温10分钟，加0.1μL 25mM EDTA终止DNase酶，95℃下孵化1分钟，结束后零下80℃存储备用。

5.根据权利要求1所述的一种检测SLC2A1表达的试剂在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，其特征在于：步骤(4)中，所述反转录条件为：

6.根据权利要求1所述的一种检测SLC2A1表达的试剂在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，其特征在于：步骤(5)中，所述实时荧光定量PCR的条件为：

7.根据权利要求1所述的一种检测SLC2A1表达的试剂在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，其特征在于：SLC2A1基因的表达量为检测其mRNA的表达量，检测结果为：

在卵母细胞中SLC2A1表达量与其受精能力成正相关，随着卵母细胞的发育成熟，从GV期到MII期SLC2A1 mRNA表达量逐渐增加；

在未能受精的卵母细胞表现了SLC2A1 mRNA的缺失或明显下降。

8.根据权利要求7所述的一种检测SLC2A1表达的试剂在制备卵母细胞受精能力检测试剂盒上的应用，其特征在于：

所述未能受精的卵母细胞为体内受精的小鼠卵母细胞或人类卵母细胞；

所述SLC2A1 mRNA的缺失或明显下降是指SLC2A1 mRNA未能检测到或比受精卵统计学上显著性下降。