CN104164401A - 精子洗涤液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精子洗涤液及其制备方法，解决精子清洗时维持精子的活力，降低精子的死亡率等技术问题。它是通过多种溶质溶于超纯净水中进行调配而成的清洗培养液，该溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质；该基础液溶质包括氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、牛磺酸、非必需氨基酸和杀菌剂等；该原液溶质为人血清白蛋白。本发明包含有多种适合精子生存和生长的有机或无机成份，在精子清洗过程中，能维持精子原有活力，并有效地去除精液中的杂物，为试管婴儿的培育或精子的冷冻贮藏提供了保证。

Description

精子洗涤液及其制备方法

技术领域

本发明属于人工辅助生殖技术领域，涉及一种用于精子清洗的化学剂，尤其是一种精子洗涤液及其制备方法。

背景技术

目前人类不孕率提高促使试管婴儿技术的发展。在试管婴儿技术中首先需采集良好的精子，精子的优劣决定试管婴儿的成败。在试管婴儿技术中其精子来源主要有两方面：直接采集人体精子，或从精子贮藏库中提取。无论精子来源如何都必须使用清洗液对精子进行科学地洗涤，以收集活动能力较强、质量良好的精子，使精子获得足够的能量，同时除去精液中有害成份及死精子、炎细胞等。一方面保证冷冻贮藏的精液不变质、质量优良，另一方面在实施试管婴儿时对精液进行洗涤处理和筛选，保证培育优越的婴儿。

目前使用的清洗液(或洗涤液等)品种不统一，效果不明显，且价格昂贵。有些洗涤液中调配的营养不全，在清洗过程中容易造成精子的死亡或清子获能不足活力较低，如在精子活力实验中，精子保持活力的比率较低(同样的实验过程、同批次精液，下同)，其比率接近或低于合格标准(保持活力率≥75％)。有些洗涤液的稠度较高，在精洗过程难以一次性将精液中的有害成份、死精子和炎细胞去除，造成冷冻贮藏的精液质量不能得到保证。

另外，一般精子洗涤液在使用前不能直观地判断有效性的好坏，如果在洗涤液变质后仍继续使用将对实验或临床操作造成不可逆转的结果。

发明内容

本发明主要是解决精子清洗时更好地维持精子的活力、降低精子的死亡率等技术问题，以便更好的冷冻冷藏或为辅助生殖技术提供有力保证，避免风险发生。进而提供一种各项指标均达到体外清洗培养液的标准、有利精子生存、使用安全且易于判断该清洗培养液是否变质的精子洗涤液。

本发明的精子洗涤液，它是对多种溶质溶于超纯净水所配制的清洗培养液进行除菌而成；该多种溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质；该基础液溶质包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸；该原液溶质为人血清白蛋白；该杀菌剂为庆大霉素；该除菌是清洗培养液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜进行过滤的过程。

进一步，该基础液溶质在清洗培养液中的含量如下：氯化钠92.815～102.585mmol/L，氯化钾4.465～4.935mmol/L，硫酸镁0.19～0.21mmol/L，葡萄糖2.66～2.94mmol/L，磷酸二氢钾0.3515～0.3885mmol/L，氯化钙1.9～2.1mmol/L，乳酸钠12.18～13.48mmol/L、丙酮酸钠0.3135～0.3465mmol/L、碳酸氢钠3.8～4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95～1.05mmol/L、牛磺酸0.095～0.105mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)19.95～22.05mmol/L及非必需氨基酸9.5～10.5ml/L；该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为4.75～5.25g/L。

更进一步，该杀菌剂为庆大霉素，其在清洗培养液中的含量为9.5～10.5mg/L.

再进一步，该清洗培养液中还具有用以判断该清洗培养液pH值的指示剂；该指示剂为酚红，在清洗培养液中的含量为9.5～10.5mg/L。

进一步，该清洗培养液的pH值为7.20～7.40；该清洗培养液的渗透压为260～290mOsm/Kg。

更进一步，该非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸中的一种或者几种。

本发明的一种如上所述的清子洗涤液的制备方法，它包括以下步骤：

(1)、清洗培养液的配制：

a、先按照各溶质的含量和配制容量要求称取或量取各溶质，并分开放置；同时准备好带刻度调制容器和超纯净水，并将称量好的超纯净水加入调制容器中；

b、将除碳酸氢钠外的各基础液溶质按先固体后液体的顺序溶于调制容器内的超纯净水中；

c、向上述步骤b所得溶液中加入所量取的杀菌剂和所称取的NaHCO₃基础液溶质，同时根据需要添加指示剂，得基础液；

d、向上述步骤c所得基础液中加入所称取的人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得原液；

e、检测上述步骤d所得的原液的渗透压和pH值，通过滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液调整其pH值至7.20～7.40，并记录最终渗透压和pH值

(2)、清洗培养液的处理：

a、除菌，将上述的所得清洗培养液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌；

b、分装及冷存，在无菌环境下对上述过滤后的清洗培养液进行分装、封口，并放置于冰箱或冷库内在2～8℃条件下保存，得精子洗涤液；

c、检验，取上述分装好的精子洗涤液进行检测；检测项目包括pH值检测、渗透压检测、细胞毒性检测、皮内刺激反应检测、致敏反应检测、无菌检测、热原检测、细菌内毒素检测、体外鼠胚试验和精子活力试验，以判断该精子洗涤液是否合格。

本发明的精子洗涤液可根据需要添加指示剂酚红，酚红在pH值变化时颜色变化明显，pH值在7.0～7.5范围内酚红溶液为粉红色到橙红色，当pH值小于6.8时为黄色，当pH值大于8.4时为红色，变色比较明显，精子洗涤液的pH值在7.20～7.40范围内溶液为粉红色到橙红色，当精子洗涤液颜色与此不符时，说明该精子洗涤液变质，不能用于实验或临床，从而避免了使用变质精子液而产生的风险。当不添加指示剂时，本发明的洗涤液呈透明、清澈，在有效期内使用能够保证液体不变质。

本发明通过使用抗生素来抑制细菌的生长，如庆大霉素是一种光谱、热稳定性好的抗生素，在精子洗涤液中添加庆大霉素可以有效抑制细菌的生长。

本发明包含有多种适合精子生存和生长的有机或无机成份，在对精子的清洗过程中，能创建适合于精子的生存环境，维持了精子原有活力，同时能有效地去除精液中的杂物，杀死有害细菌等，为试管婴儿的培育或精子的冷冻贮藏提供了保证。

本发明精子洗涤液的原料均是已经证明其安全性的物质，在制备过程中其溶剂采用超纯水，超纯水的总有机碳(TOC)超低，避免了因杂质过多影响测定的结果。

本发明配制工艺操作简单合理，检测严密，能够提供新鲜的培养液供生殖中心或科研院所使用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例一

本发明的精子洗涤液是对多种溶质溶于超纯净水所配制的清洗培养液进行除菌而成。该超纯净水的物理标准为：①流速为0.05Lpm-2.0Lpm、②在25℃时电阻率为18.2MΩ.cm、③在25℃时电导率为0.055μS/cm；化学标准为：热原质＜0.001Eu/ml，微粒≤1/ml，TOC＜5ppb。该超纯净水也可用注射用水替代。所述多种溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质。通过基础液溶质调配创建适合于精子生存的环境。该基础液溶质包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸。该原液溶质为人血清白蛋白，用于提供精子生存的必要的培养物质。该杀菌剂为庆大霉素，用于杀灭溶液中的细菌。

该除菌是清洗培养液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌过程。通过滤膜除去清洗培养液中有关细菌和杂物。

上述基础液溶质在清洗培养液中的含量如下：氯化钠92.815mmol/L(即配制后的清洗培养液中每升含有氯化钠92.815mmol，下同)、氯化钾4.465mmol/L、硫酸镁0.19mmol/L、葡萄糖2.66mmol/L、磷酸二氢钾0.3515mmol/L、氯化钙1.9mmol/L、乳酸钠12.18mmol/L、丙酮酸钠0.3135mmol/L、碳酸氢钠3.8mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95mmol/L、牛磺酸0.095mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)19.95mmol/L及非必需氨基酸9.5ml/L；该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为4.75g/L。具体参见表1的“配方1”一栏。

表1精子洗涤液中物质含量：

物质名称	配方1	配方2	配方3
				氯化钠mmol/L	92.815	97.7	102.585
氯化钾mmol/L	4.465	4.7	4.935
				硫酸镁mmol/L	0.19	0.2	0.21
葡萄糖mmol/L	2.66	2.8	2.94

磷酸二氢钾mmol/L	0.3515	0.37	0.3885
				氯化钙mmol/L	1.9	2	2.1
乳酸钠mmol/L	12.18	12.84	13.48
				丙酮酸钠mmol/L	0.3135	0.33	0.3465
碳酸氢钠mmol/L	3.8	4	4.2
				丙氨酰谷氨酰胺mmol/L	0.95	1	1.05
牛磺酸mmol/L	0.095	0.1	0.105
				HEPES mmol/L	19.95	21	22.05
非必需氨基酸ml/L	9.5	10	10.5
				庆大霉素mg/L	9.5	10	10.5
酚红mg/L	9.5	0	10.5
				人血清白蛋白g/L	4.75	5	5.25

该清洗培养液的pH值为7.20～7.40，以适合于细胞生存。该清洗培养液的渗透压为260～290mOsm/Kg，以适合于细胞的生存。

该清洗培养液中还包具有用以判断该清洗培养液pH值的指示剂，该指示剂为酚红，含量为9.5～10.5mg/L。

该清洗培养液中的杀菌剂为庆大霉素，其在清洗培养液中的含量为9.5～10.5mg/L。

该实施例中采用的非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺和L-天冬氨酸的混合氨基酸，其在清洗培养液中的含量为9.5～10.5ml/L。

本发明精子洗涤液的制备方法(以配制10L洗涤液为基准)包括下面步骤：

(1)清洗培养液的配制

a、先按照各溶质的含量和配制容量要求称取或量取各溶质，并分开放置；同时准备好带刻度调制容器和超纯净水，并将称量好的超纯净水加入调制容器中。按上表1中的“配方1”分别称取氯化钠(NaCl)54.30g(即928.15mmol)、氯化钾(KCl)3.33g(即44.65mmol)、硫酸镁(MgSO₄)0.228g(即1.9mmol)(注：实际操作时使用MgSO₄·7H₂O)、葡萄糖(C₆H₁₂O₆)4.788g(即26.6mmol)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.478g(即3.515mmol)、氯化钙(CaCl2)2.11g(即19mmol)(注：实际操作时使用CaCl₂·2H₂O)、乳酸钠(C₃H₅O₃Na)13.64g(即121.8mmol)(注：实际操作时使用60％乳酸钠溶液)、丙酮酸钠(C₃H₃O₃Na)0.345g(即3.135mmol)、碳酸氢钠(NaHCO₃)3.192g(即38mmol)、丙氨酰谷氨酰胺(C₈H₁₅N₃O₄)2.06g(即9.5mmol)、牛磺酸(NH₂CH₂CH₂SO₃H)0.119g(即0.95mmol)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(C₈H₁₈N₂O₄S)47.48g(即199.5mmol)及人血清白蛋白47.5g，量取非必需氨基酸95ml，并准备庆大霉素95mg，分开放置，待用。同时准备带刻度调制容器(10L以上)和超纯净水10L以上；然后将称量好的少于10L超纯净水(一般采用先加入少于10L的超纯水，如9.0L左右)加入配制用带刻度的调制容器中，待用。

b、将除碳酸氢钠外的各基础液溶质按先固体后液体的顺序溶于调制容器内的超纯净水中。本实施例采用以下顺序先后将各称取的基础液溶质加入已加入超纯净水的调制容器中：氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、葡萄糖、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、乳酸钠及非必需氨基酸。

c、向步骤b所得溶液中加入所量取的杀菌剂和所称取的NaHCO₃基础液溶质，同时根据需要添加指示剂；得基础液。本实施例中杀菌剂选用庆大霉素。将95mg(即9.5mg/L)的庆大霉素加入步骤b所得溶液中后，再向溶液中加入所称取的NaHCO₃基础液溶质，然后加入指示剂酚红95mg(即9.5mg/L)，得基础液。

d、向步骤c所得基础液中加入所称取的人血清白蛋白47.5g，震荡或搅拌混合均匀，得原液。

e、检测步骤d所得的原液的渗透压和pH值，通过滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液调整其pH值至7.20～7.40，并记录最终渗透压和pH值，得清洗培养液。检测步骤d所得原液的渗透压和pH值，并通过滴加HCl溶液或NaOH溶液调整其pH值至7.20～7.40。本实施例中，经检测，该溶液渗透压为280mOsm/Kg，符合要求；溶液为淡红，其pH值为7.10低于标准值。用滴管滴加氢氧化钠溶液至pH值在7.20～7.40，再经检测pH值为7.35；

(2)清洗培养液的处理：

a、除菌，将上述的所得清洗培养液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌；

b、分装及冷存，在无菌环境下对过滤后的清洗培养液进行分装、封口，并放置于冰箱或冷库内在2～8℃条件下保存，得本发明的精子洗涤液，即成品。将上述除菌后的清洗培养液10L装入保存瓶中，装瓶时可采用30ml/瓶或50ml/瓶或100ml/瓶的标准进行装瓶；本实例中采用100ml/瓶标准进行装瓶，上述10L原液装入100个保存瓶中，装瓶后用封口机旋盖后套上封口膜，再用塑封机封紧，放置于冰箱或冷库内，在温度为2～8℃条件下进行保存。

c、检验，取分装好的精子洗涤液(即成品)进行检测，检测项目包括pH值检测、渗透压检测、细胞毒性检测、皮内刺激反应检测、致敏反应检测、无菌检测、热原检测、细菌内毒素检测、体外鼠胚试验和精子活力试验，以判断本发明的精子洗涤液是否合格。

本发明的精子洗涤液的各检测结果参见表2(表2中的“配方1”对应于表1中“配方1”)

表2：精子洗涤液检测结果

本发明的精子洗涤液的具体检测方法、过程及结果如下：

(一)pH值检测

随机抽取上述成品精子洗涤液(即成品)一定量(一般为50ml)用pH计进行检测，经三次随机抽取检测，分别得pH值为7.35、7.40、7.30记录三次的值并取平均值为最终液体的pH值，得pH值为7.35，处于7.20～7.40之间，合格。

(二)渗透压检测

随机取上述成品精子洗涤液10μL滴入渗透压仪(露点渗透压仪)的探头的滤纸片上，将探头推入仪器等待检测值，并记录检测数值。同样方法检测三遍，分别得渗透压275mOsm/Kg、270mOsm/Kg、280mOsm/Kg取平均值得该精子洗涤液的渗透压为275mOsm/Kg，处于260-290mOsm/Kg范围内，合格。

(三)细胞毒性检测

按GB/T 16886.5的规定进行细胞毒性检测，经检测该成品精子洗涤液的细胞毒性，计分为0.3分，小于1分，合格。

(四)皮内刺激反应检测

按GB/T 16886.10的规定，经向20只成年鼠注射该精子洗涤液，20分钟后均无皮内刺激反应，合格。

(五)致敏性检测

按GB/T 16886.10的规定，经向20只成年鼠注射该体外受精液，20分钟后均末见异常，无致敏性反应，合格。

(六)无菌检测

采用中国药典的无菌检测的薄膜过滤法进行检测。将上述的精子洗涤液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜分别在温度为23～28℃的改良马丁细菌培养基内和温度为30～35℃的硫乙醇酸盐真菌培养基内培养14天后，均无菌孢生长，合格。

(七)热原检测

按照中华人民共和国药典2010年版二部附录XI D规定方法进行检测。根据上述规定使用家兔进行试验，其实验结果如下：在初试的3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃；在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔不超过1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下，该供试品的热原检查符合规定。

(八)细菌内毒素检测

采用中国药典细菌内毒素的检测方法中的鲎试剂凝胶法进行检测，检测值小于1.0EU/mL判定为合格。阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品精子洗涤液阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品精子洗涤液符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品精子洗涤液不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。按上述过程和要求对本发明成品洗涤液进行检测，其检测置为0.75EU/mL，合格。

(九)体外鼠胚试验

1.超数排卵

选择6～8周龄雌鼠多个，经腹腔注射PMSG 10 IU/只；48h后经腹腔注射hCG 10 IU/只，注射hCG当日雌鼠与同品系雄鼠合笼过夜。

2.准备培养皿

培养胚胎前在细胞培养皿中制备一定数量30～50μL大小的液体微滴，表面覆盖培养用油，在CO₂培养箱内预平衡4～18小时。

3鼠胚采集

合笼第二天早上检查交配情况，选择见栓小鼠备用。

1-细胞胚胎收集：注射hCG后18至22小时后处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集1-细胞胚胎。将收集到的絮状受精卵团放置到37℃提前预热好的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即转移到精子洗涤液中清洗20分钟，挑选出正常形态的受精胚胎150个，转移到培养微滴中，用于1-细胞鼠胚检测试验。

4体外培养

采用微滴法培养，将收集到的鼠胚随机分成一个阳性对照组、一个阴性对照组和一个供试品组，每组鼠胚数为50个，置于已平衡的培养液中，于37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养。

5试验结果

1-细胞胚胎体外分别培养96小时后记录囊胚数量。

观察指标：囊胚形态观察。

经上述试验，其阳性对照组中具有合格囊胚形态的胚胎数为15个，其阴性对照组中具有合格囊胚形态的胚胎数为45个。

结论：1、阳性对照组的囊胚形成率经统计学分析显著低于阴性对照组；2、阴性对照组的囊胚形成率为90％，大于合格标准80％，产品合格。

(十)精子活力试验

采用上游法，取一个15毫升离心管，将1毫升精液(新鲜或解冻后)加到离心管内，将1ml精子洗涤液添加到离心管内，将离心管内的精液和精子洗涤液充分混合后，在200g离心5分钟。离心机停止旋转，用9英寸巴斯德吸管吸去上清液，注意不要把离心管下面的精子吸入，用5毫升移液管在离心管内加入1毫升的精子洗涤液，用同一个加了液体的移液管上下吸入离心管下面的精子，直到精子与液体完全混匀后盖紧离心管，再放入离心机离心5分钟(200g)，离心机停止旋转，用9英寸巴斯德吸管吸去上清液，注意不要把离心管下面的精子吸入。用1毫升移液管吸取1毫升的精子洗涤液慢慢地添加到离心管内。加入液体时，离心管的角度保持在45度角左右，将离心管盖紧后将离心管倾斜放入100毫升烧杯中，再将烧杯放到无二氧化碳的培养箱内上游75分钟。上游结束后，用9英寸巴斯德吸管吸去上面约0.5毫升液体，这是上游后的精子悬浮液，将精子悬浮液放到另一个试管内。将先前准备的4孔培养皿从培养箱中拿出，添加10微升精子悬浮液到两个培养孔内，再将培养皿放回无二氧化碳的培养箱培养。用剩余的精子悬浮液用上述同样的方法做精子浓度和活力的检查。经过24小时培养后，直接在200倍的显微镜放大倍数下检查精子活力，每个孔计数至少100个精子(活动的和不运动的)，然后从两个孔所得数据获得平均数。

经精子浓度检测得孔中的精子个数为105个，符合试验要求。在培养24小时后，经检测，保持活子的精子数为99个，没有活力的精子数为11个，保持活力的精子比率为90％，远远超过合格标准75％，产品合格。

实施例二

本发明的精子洗涤液是对多种溶质溶于超纯净水所配制的清洗培养液进行除菌而成。所述多种溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质。该实施例中所采用基础液溶质和原液溶质与实施例一相同，其各溶质的含量参见表1的配方2。具体地其基础液溶质在清洗培养液中的含量如下：氯化钠97.7mmol/L、氯化钾4.70mmol/L、硫酸镁0.20mmol/L、葡萄糖2.80mmol/L、磷酸二氢钾0.37mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、乳酸钠12.84mmol/L、丙酮酸钠0.33mmol/L、碳酸氢钠4.0mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.0mmol/L、牛磺酸0.10mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)21.0mmol/L及非必需氨基酸10ml/L。该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为5g/L。

该清洗培养液中的杀菌剂为庆大霉素，其在清洗培养液中的含量为10mg/L。

该清洗培养液中没有添加指示剂，溶液透明、清澈。

该实施例采用的非必需氨基酸为L-天冬氨酸，其含量为10ml。

该清洗培养液的pH值为7.35，渗透压为270mOsm/Kg。

该实施例中的精子洗涤液的制备方法与实施例一基本相同，其区别在于在清洗培养液的配制步骤c中没有加入指示剂。其成品检测方法及过程同实施例一，其检测结果参见表2的“配方2”一栏。

实施例三

本发明的精子洗涤液是对多种溶质溶于超纯净水所配制的清洗培养液进行除菌而成。所述多种溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质。该实施例中所采用基础液溶质和原液溶质与实施例一相同，其各溶质在清洗培养液中的含量参见表1的“配方3”一栏，具体地其基础液溶质在清洗培养液中的含量如下：氯化钠102.585mmol/L、氯化钾4.935mmol/L、硫酸镁0.21mmol/L、葡萄糖2.94mmol/L、磷酸二氢钾0.3885mmol/L、氯化钙2.1mmol/L、乳酸钠13.48mmol/L、丙酮酸钠0.3465mmol/L、碳酸氢钠4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.05mmol/L、牛磺酸0.105mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)22.05mmol/L及非必需氨基酸10.5ml/L。该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为5.25g/L。

该清洗培养液中的杀菌剂为庆大霉素，其在溶液中的含量为10.5mg/L。

该清洗培养液中添加的指示剂为酚红，其在溶液中的含量10.5mg/L。

该实施例采用的非必需氨基酸为甘氨酸和L-丝氨酸，两者的比例为1：1，其总含量为10.5mL。

该清洗培养液的pH值为7.30，渗透压为280mOsm/Kg。

该实施例中的精子洗涤液的制备方法与实施例一相同。其成品检测过程和方法同实施例一，其检测结果参见表2的“配方3”一栏。

Claims (10)

1.一种精子洗涤液，它是对多种溶质溶于超纯净水所配制的清洗培养液进行除菌而成，该多种溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质，其特征在于：该基础液溶质包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸；该原液溶质为人血清白蛋白；该杀菌剂为庆大霉素；该除菌是清洗培养液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜进行过滤的过程。

2.根据权利要求1所述的精子洗涤液，其特征在于：该基础溶质在清洗培养液中的含量如下：氯化钠92.815～102.585mmol/L，氯化钾4.465～4.935mmol/L，硫酸镁0.19～0.21mmol/L，葡萄糖2.66～2.94mmol/L，磷酸二氢钾0.3515～0.3885mmol/L，氯化钙1.9～2.1mmol/L，乳酸钠12.18～13.48mmol/L、丙酮酸钠0.3135～0.3465mmol/L、碳酸氢钠3.8～4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95～1.05mmol/L、牛磺酸0.095～0.105mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸19.95～22.05mmol/L及非必需氨基酸9.5～10.5ml/L；该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为4.75～5.25g/L。

3.根据权利要求2所述的精子洗涤液，其特征在于：该庆大霉素在清洗培养液中的含量为9.5～10.5mg/L。

4.根据权利要求3所述的精子洗涤液，其特征在于：该清洗培养液中还具有用以判断该清洗培养液pH值的指示剂；该指示剂为酚红，在清洗培养液中的含量为9.5～10.5mg/L。

5.根据权利要求4所述的精子洗涤液，其特征在于：该清洗培养液的pH值为7.20～7.40；该清洗培养液的渗透压为260～290m0sm/Kg。

6.根据权利要求2或3或4或5所述的精子洗涤液，其特征在于：该非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸中的一种或者几种。

7.根据权利要求6所述的精子洗涤液，其特征在于：该基础液溶质在清洗培养液中的含量如下：氯化钠92.815mmol/L、氯化钾4.465mmol/L、硫酸镁0.19mmol/L、葡萄糖2.66mmol/L、磷酸二氢钾0.3515mmol/L、氯化钙1.9mmol/L、乳酸钠12.18mmol/L、丙酮酸钠0.3135mmol/L、碳酸氢钠3.8mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95mmol/L、牛磺酸0.095mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸19.95mmol/L及非必需氨基酸9.5ml/L；该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为4.75g/L。

8.根据权利要求6所述的精子洗涤液，其特征在于：该基础液溶质在清洗培养液中的含量如下：氯化钠97.7mmol/L、氯化钾4.70mmol/L、硫酸镁0.20mmol/L、葡萄糖2.80mmol/L、磷酸二氢钾0.37mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、乳酸钠12.84mmol/L、丙酮酸钠0.33mmol/L、碳酸氢钠4.0mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.0mmol/L、牛磺酸0.10mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸21.0mmol/L及非必需氨基酸10ml/L；该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为5g/L。

9.根据权利要求6所述的精子洗涤液，其特征在于：该基础液溶质在清洗培养液中的含量如下：氯化钠102.585mmol/L、氯化钾4.935mmol/L、硫酸镁0.21mmol/L、葡萄糖2.94mmol/L、磷酸二氢钾0.3885mmol/L、氯化钙2.1mmol/L、乳酸钠13.48mmol/L、丙酮酸钠0.3465mmol/L、碳酸氢钠4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.05mmol/L、牛磺酸0.105mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸22.05mmol/L及非必需氨基酸10.5ml/L；该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为5.25g/L。

10.一种如权利要求3～9任意项所述的清子洗涤液的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)、清洗培养液的配制：

a、先按照各溶质的含量和配制容量要求称取或量取各溶质，并分开放置；同时准备好带刻度调制容器和超纯净水，并将称量好的超纯净水加入调制容器中；

b、将除碳酸氢钠外的各基础液溶质按先固体后液体的顺序溶于调制容器内的超纯净水中；

c、向步骤b所得溶液中加入所量取的杀菌剂和所称取的NaHCO3溶质，同时根据需要添加指示剂，得基础液；

d、向步骤c所得基础液中加入所称取的人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得原液；

e、检测步骤d所得的原液的渗透压和pH值，通过滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液调整其pH值至7.20～7.40，并记录最终渗透压和pH值。

(2)、清洗培养液的处理：

a、除菌，将上述的所得清洗培养液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌；

b、分装及冷存，在无菌环境下对过滤后的清洗培养液进行分装、封口，并放置于冰箱或冷库内在2～8℃条件下保存，得精子洗涤液；

c、检验，取分装好的精子洗涤液进行检测；检测项目包括pH值检测、渗透压检测、细胞毒性检测、皮内刺激反应检测、致敏反应检测、无菌检测、热原检测、内毒素检测、体外鼠胚试验和精子活力试验，以判断该精子洗涤液是否合格。