CN107034179A - 一种提高人睾丸精子检出的溶液 - Google Patents

一种提高人睾丸精子检出的溶液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高人睾丸精子检出的溶液，该溶液包括以下组分：氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、乳酸钠、碳酸氢钠、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、2‑羰基丙酸钠、己酮可可碱和咖啡因，为了使溶液的生理环境与体细胞的生理环境类似，方便精子的存活，将溶液的pH值调节到7.2～7.4的范围内，同时为了随时监控溶液是否变质，溶液中还添加有酚红。采用上述溶液，能够明显提高睾丸中精子的运动能力，能轻易将精子与生精上皮细胞区分开来，能直接在显微镜下观察精子是否具有生命。

Description

一种提高人睾丸精子检出的溶液
技术领域
本发明涉及一种精子检出液，具体涉及一种提高人睾丸精子检出的溶液。
背景技术
在治疗男性不育的过程中，由于精液中无精子或排出体外的精子质量不佳，通常会采用穿刺或切开睾丸获取精子，通过单精子卵胞浆内注射技术达到体外受精辅助生育的目的。正常生理状态下睾丸精子不具有自然运动能力，自睾丸中取出的不运动精子混杂于大量各种生精上皮细胞中,对于操作而言辨认难度较大，且不动精子无法直观地通过显微镜下观察来辨认其是否具有生命力。
发明内容
针对上述现状，本发明提供一种提高人睾丸精子检出的溶液，该溶液能有效解决睾丸精子不运动而难以辨别其是否具有生命力的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种提高人睾丸精子检出的溶液，该溶液包括以下组分且其最终浓度为：氯化钠90～110mmol/L、氯化钾3.0～3.5mmol/L、硫酸镁0.3～0.8mmol/L、氯化钙1～5mmol/L、磷酸二氢钠0.01～0.1mmol/L、乳酸钠5～10mmol/L、碳酸氢钠30～35mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5～10mmol/L、丙酮酸钠0.1～0.5mmol/L、己酮可可碱5～10mmol/L、咖啡因1～5mmol/L，其余为超纯水。
进一步，该提高人睾丸精子检出的溶液包括以下组分且其最终浓度为：氯化钠100mmol/L、氯化钾3.2mmol/L、硫酸镁0.5mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、磷酸二氢钠0.053mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠30.9mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸10mmol/L、丙酮酸钠0.25mmol/L、己酮可可碱7.5mmol/L、咖啡因2.5mmol/L，其余为超纯水。
本发明的有益效果是：该溶液中的无机盐组分全面模拟了细胞外液的生理环境，为精子提供了良好的生存环境；溶液中添加丙酮酸钠，能够有效抑制caspase-3而改善细胞凋亡，并增加谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比率，提升细胞的抗氧化能力；溶液中的咖啡因不仅可以影响细胞中线粒体的能量代谢，而且还能够刺激精子获能及自发的顶体反应，从而提升精子的运动能力；溶液中添加的己酮可可碱能够有效激活并增加睾丸精子的活动能力，同时己酮可可碱还可以抑制环腺苷酸的分解，而细胞内cAMP在激活精子运动中扮演着中心角色。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，溶液还包括1％wt的酚红。
采用上述进一步技术方案的有益效果是：酚红是一种很好的pH指示剂，pH不同时，酚红颜色变化明显。本发明溶液正常pH在7.4左右，此时酚红呈粉红色到橙红色，当溶液颜色与此不符时，证明溶液已经变质酸化，不能继续用于实验，避免了溶液变质而带来的风险。
进一步，溶液的pH值为7.2～7.4。
采用上述进一步技术方案的有益效果是：配置溶液的pH值与人体细胞液的pH值处于同一范围，为离体的精子提供类似与人体的生存环境，更加有利于精子的运动。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明的实施例中，提供了一种提高人睾丸精子检出的溶液。本发明的目的是在体外培养采用穿刺或切开睾丸获取的精子，因此所配置的溶液应当与人体细胞液的成分基本类似。为达到上述目的，先进行基础溶液的配制，所述基础溶液包括以下组分，而且每种组分在使用时的最终浓度如下：
氯化钠90～110mmol/L、氯化钾3.0～3.5mmol/L、硫酸镁0.3～0.8mmol/L、氯化钙1～5mmol/L、磷酸二氢钠0.01～0.1mmol/L、乳酸钠5～10mmol/L、碳酸氢钠30～35mmol/L。
基础溶液的配制是将称取好的组分依次溶于超纯水中，在溶解过程中不断搅拌，使各个组分充分混合，需要特别注意的是，碳酸氢钠最后溶解，以免在溶解搅拌过程中发生分解；上述组分溶解完成后，检测溶液的pH值，如果溶液的pH不在7.2～7.4范围内，则用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节pH，直至pH满足要求为止，此时溶液的生理环境与细胞液的生理环境基本类似；要长时间控制恒定的pH范围，还需要向基础溶液中添加缓冲剂，在本发明中，缓冲剂包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，它是一种氢离子缓冲剂，对细胞无毒副作用，与磷酸二氢钠和乳酸钠一同调节溶液pH值，能够在较长时间内保持基础溶液的pH值稳定，本缓冲剂的终浓度在5～10mmol/L的范围内。
配置好的基础溶液能够为从睾丸中取出的精子提供良好的生存环境，但还不能解决精子不运动的问题，为了提高精子的活动能力，还需要在溶液中添加其他的组分。丙酮酸钠能够通过抑制caspase-3而改善细胞的凋亡，除此之外，丙酮酸钠还可以增加细胞内谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比率，具有改善细胞氧化还原状态的作用，使细胞的抗氧化能力大大提高；添加的丙酮酸钠的最终摩尔浓度为0.1～0.5mmol/L。除了添加丙酮酸钠外，还向基础溶液中添加了咖啡因，咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，它可以作用于线粒体能量代谢导致精子运动能力的增加，同时还能刺激精子获能及自发的顶体反应；添加的咖啡因的最终摩尔浓度为1～5mmol/L。细胞中的环磷酸腺苷(cAMP)在精子运动中扮演中心角色，细胞中环磷酸腺苷的浓度直接决定了精子运动能力的强弱；向溶液中添加己酮可可碱，己酮可可碱是一种非特异性磷酸二酯酶(PDE)的抑制剂，它拥有抑制磷酸二酯酶活性的功效，能有效降低第二信使(cAMP或cGMP)的水解，提升细胞内cAMP或cGMP的浓度，从而改善精子的运动能力；添加的己酮可可碱的最终摩尔浓度为5～10mmol/L。
最终成品溶液是采用以下方法制得的：
a.向基础溶液中依次添加称好的丙酮酸钠、咖啡因和己酮可可碱，在添加过程中缓慢搅拌，使上述几种组分充分溶解到基础溶液中。
b.溶解完成后，在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
为了随时监控溶液的质量，避免溶液变质而带来危险，向成品溶液中添加指示剂。由于成品溶液的pH偏碱性，因此可以用pH指示剂。在现有的pH指示剂中，酚红由于其性质稳定、变色灵敏而受到广泛应用。当pH在7.2～7.4的范围时，酚红溶液为粉红色到橙红色，pH小于6.8时为黄色，pH大于8.4时为红色，颜色变化比较明显；本发明溶液的pH在7.2～7.4的范围内，溶液应当呈粉红色到橙红色，如果溶液的颜色明显发生变化，则证明溶液的pH发生变化，溶液已经变质，不再适合继续用于实验，需要另行配置溶液。
下面的实施例只是用于详细说明本发明，并不以任何方式限制发明的范围。
临床上罹患无精子症而需进行睾丸活检的睾丸组织，即采用外科手段如穿刺或切开睾丸获取睾丸组织，完成相关镜检观察后分离细胞悬液用于以下实施例之测试。
(1)实施例一
首先配制基础溶液，基础溶液的组分及它们的最终浓度如下：氯化钠90mmol/L、氯化钾3mmol/L、硫酸镁0.3mmol/L、氯化钙1mmol/L、磷酸二氢钠0.01mmol/L、乳酸钠5mmol/L、碳酸氢钠30mmol/L。上述组分溶解完成后，用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节溶液pH至7.2，再向溶液中添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂，缓冲剂的最终浓度为5mmol/L。然后向溶液中依次添加称好的丙酮酸钠、咖啡因和己酮可可碱，它们的最终浓度分别为丙酮酸钠0.1mmol/L、咖啡因1mmol/L、己酮可可碱5mmol/L。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚红，在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
将取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育5分钟，显微镜下观察辨识并挑选活动的精子。
本实施方式精子的检出结果如下：
(2)实施例二
首先配制基础溶液，基础溶液的组分及它们的最终浓度如下：氯化钠110mmol/L、氯化钾3.5mmol/L、硫酸镁0.8mmol/L、氯化钙5mmol/L、磷酸二氢钠0.1mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠35mmol/L。上述组分溶解完成后，用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节溶液pH至7.2，再向溶液中添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂，缓冲剂的最终浓度为10mmol/L。然后向溶液中依次添加称好的丙酮酸钠、咖啡因和己酮可可碱，它们的最终浓度分别为丙酮酸钠0.5mmol/L、咖啡因5mmol/L、己酮可可碱10mmol/L。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚红，在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
将取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育5分钟，显微镜下观察辨识并挑选活动的精子。
本实施方式精子的检出结果如下：
(3)实施例三
首先配制基础溶液，基础溶液的组分及它们的最终浓度如下：氯化钠100mmol/L、氯化钾3.2mmol/L、硫酸镁0.5mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、磷酸二氢钠0.053mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠30.9mmol/L。上述组分溶解完成后，用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节溶液pH至7.2，再向溶液中添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂，缓冲剂的最终浓度为8mmol/L。然后向溶液中依次添加称好的丙酮酸钠、咖啡因和己酮可可碱，它们的最终浓度分别为丙酮酸钠0.25mmol/L、咖啡因2.5mmol/L、己酮可可碱7.5mmol/L。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚红，在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
将取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育5分钟，显微镜下观察辨识并挑选活动的精子。
本实施方式精子的检出结果如下：
(4)实施例四
首先配制基础溶液，基础溶液的组分及它们的最终浓度如下：氯化钠100mmol/L、氯化钾3.2mmol/L、硫酸镁0.5mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、磷酸二氢钠0.053mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠30.9mmol/L。上述组分溶解完成后，用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节溶液pH至7.2，再向溶液中添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂，缓冲剂的最终浓度为8mmol/L。然后向溶液中依次添加称好的丙酮酸钠、咖啡因和己酮可可碱，它们的最终浓度分别为丙酮酸钠0.25mmol/L、咖啡因2.5mmol/L、己酮可可碱7.5mmol/L。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚红，在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
将取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育10分钟，显微镜下观察辨识并挑选活动的精子。
本实施方式精子的检出结果如下：
(5)实施例五
首先配制基础溶液，基础溶液的组分及它们的最终浓度如下：氯化钠100mmol/L、氯化钾3.2mmol/L、硫酸镁0.5mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、磷酸二氢钠0.053mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠30.9mmol/L。上述组分溶解完成后，用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节溶液pH至7.4，再向溶液中添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂，缓冲剂的最终浓度为8mmol/L。然后向溶液中依次添加称好的丙酮酸钠、咖啡因和己酮可可碱，它们的最终浓度分别为丙酮酸钠0.25mmol/L、咖啡因2.5mmol/L、己酮可可碱7.5mmol/L。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚红，在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
将取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育10分钟，显微镜下观察辨识并挑选活动的精子。
本实施方式精子的检出结果如下：
(6)实施例六
首先配制基础溶液，基础溶液的组分及它们的最终浓度如下：氯化钠100mmol/L、氯化钾3.2mmol/L、硫酸镁0.5mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、磷酸二氢钠0.053mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠30.9mmol/L。上述组分溶解完成后，用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节溶液pH至7.4，再向溶液中添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂，缓冲剂的最终浓度为10mmol/L。然后向溶液中依次添加称好的咖啡因和己酮可可碱，它们的最终浓度分别为咖啡因2.5mmol/L、己酮可可碱7.5mmol/L。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚红，然后在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
将取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育10分钟，显微镜下观察辨识并挑选活动的精子。
本实施方式精子的检出结果如下：
(7)实施例七
首先配制基础溶液，基础溶液的组分及它们的最终浓度如下：氯化钠100mmol/L、氯化钾3.2mmol/L、硫酸镁0.5mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、磷酸二氢钠0.053mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠30.9mmol/L。上述组分溶解完成后，用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节溶液pH至7.4，再向溶液中添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂，缓冲剂的最终浓度为10mmol/L。然后向溶液中依次添加称好的丙酮酸钠和己酮可可碱，它们的最终浓度分别为丙酮酸钠0.25mmol/L、己酮可可碱7.5mmol/L。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚红，然后在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
将取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育10分钟，显微镜下观察辨识并挑选活动的精子。
本实施方式精子的检出结果如下：
(8)实施例八
首先配制基础溶液，基础溶液的组分及它们的最终浓度如下：氯化钠100mmol/L、氯化钾3.2mmol/L、硫酸镁0.5mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、磷酸二氢钠0.053mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠30.9mmol/L。上述组分溶解完成后，用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节溶液pH至7.4，再向溶液中添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂，缓冲剂的最终浓度为10mmol/L。然后向溶液中依次添加称好的丙酮酸钠和咖啡因，它们的最终浓度分别为丙酮酸钠0.25mmol/L、咖啡因2.5mmol/L。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚红，然后在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
将取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育10分钟，显微镜下观察辨识并挑选活动的精子。
本实施方式精子的检出结果如下：
(9)实施例九
首先配制基础溶液，基础溶液的组分及它们的最终浓度如下：氯化钠100mmol/L、氯化钾3.2mmol/L、硫酸镁0.5mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、磷酸二氢钠0.053mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠30.9mmol/L。上述组分溶解完成后，用提前配置好的氢氧化钠和盐酸溶液调节溶液pH至7.4，再向溶液中添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂，缓冲剂的最终浓度为10mmol/L。然后向溶液中添加1％wt的酚红，然后在超净工作台下采用孔径为2.2μm的除菌过滤器对溶液进行过滤除菌，然后分装4℃储存。
将取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育10分钟，显微镜下观察辨识并挑选活动的精子。
本实施方式精子的检出结果如下：

Claims (4)

1.一种提高人睾丸精子检出的溶液，其特征是：所述溶液包括以下组分且其最终浓度为：氯化钠90～110mmol/L、氯化钾3.0～3.5mmol/L、硫酸镁0.3～0.8mmol/L、氯化钙1～5mmol/L、磷酸二氢钠0.01～0.1mmol/L、乳酸钠5～10mmol/L、碳酸氢钠30～35mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5～10mmol/L、丙酮酸钠0.1～0.5mmol/L、己酮可可碱5～10mmol/L、咖啡因1～5mmol/L，其余为超纯水。
2.根据权利要求1所述的提高人睾丸精子检出的溶液，其特征是：所述溶液包括以下组分且其最终浓度为：氯化钠100mmol/L、氯化钾3.2mmol/L、硫酸镁0.5mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、磷酸二氢钠0.053mmol/L、乳酸钠10mmol/L、碳酸氢钠30.9mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸10mmol/L、丙酮酸钠0.25mmol/L、己酮可可碱7.5mmol/L、咖啡因2.5mmol/L，其余为超纯水。
3.根据权利要求1或2所述的提高人睾丸精子检出的溶液，其特征是：所述溶液还包括1％wt的酚红。
4.根据权利要求1或2所述的提高人睾丸精子检出的溶液，其特征是：所述溶液的pH值为7.2～7.4。
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