KR101061293B1

KR101061293B1 - 허혈 예방을 위한 보호 용액

Info

Publication number: KR101061293B1
Application number: KR1020100077083A
Authority: KR
Inventors: 허버트 데 그루트; 우르술라 라우엔; 윌프리드 브룬스; 게르노트 코엘러
Original assignee: 독토르. 프란쯔 쾰러 케미 게엠베하
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2010-08-11
Publication date: 2011-08-31
Also published as: CN1480132A; US9603354B2; EP1859679A1; ES2335145T3; CN100448440C; KR20100093023A; DK1859679T3; AR039819A1; JP2004002418A; KR101014990B1; MXPA03004315A; EP1362511B1; US7977383B2; ES2362867T3; DE10222561B4; JP4603246B2; BRPI0301159B8; KR20030089495A; CA2429097A1; DE10262084B4

Abstract

기관, 또는 독립된 세포 시스템이나 조직 성분에서 관류, 수술, 이식 수술 또는 저온 보관과 뒤이은 재관류에 의한 보관 손상, 국부 허혈 손상 또는 재관류 손상을 방지하기 위한 보호 용액으로, 전해질(electrolyte)로서 알칼리 이온(alkali ion), 경우에 따라서 알칼리 이온 산화물, 완충액 및 폴리올(polyol) 및/또는 당류를 함유하고, 대략 290 mosm/ℓ 내지 대략 350 mosm/ℓ의 삼투질농도(osmolarity) 및 대략 6.8 내지 대략 7.4의 pH-값을 제공하고, 하이드록삼산 및/또는 하나 이상의 하이드록삼산 유도체가 첨가되는 보호 용액이 기술되었다.

Description

허혈 예방을 위한 보호 용액{PROTECTIVE SOLUTION FOR PREVENTION OF ISCHEMIA}

본 발명은 종종 혈액 순환이 되지 않는 허혈증 기관에서 오랜 시간 지속되는 수술을 실행할 수 있도록 주로 심장, 폐, 신장, 췌장 및 혈관 계통의 기관을 보호하고, 이동- 내지 보관 기간 동안 다른 보존 공정과는 대조적으로 조직의 손상을 감소시키며, 이식하기 위한 이런 기관을 보존하고 및/또는 허혈증 기관의 재관류로부터 보호를 위한 용액의 개선된 공정에 관한다. 본 발명은 이를 위하여 적합한 처리뿐만 아니라 GMP-지침의 요구에 따른 생산 공정을 제공한다.

1995년 Melrose에 의한 심장 박동 정지의 도입으로, 외과의들은 허혈 상태의 박동하지 않는 심장의 복잡한 수술을 실행할 수 있게 되었다. 당시의 인위적 심장 정지 처치로 40분 정도만 수술이 진행될 수 있었음에도 불구하고, 선천성 심장 기형을 한 번의 수술로 복원하는 것과 심장판막-보정기의 삽입이 가능해졌다. 1967년 Banard는 최초로 실행된 심장 이식으로 외과 의학의 이정표를 세웠다.

후속 연구의 목적은 지금까지 한정되었던 수술시간을 적합한 처지 및 이에 적합한 사용공정으로 연장하는 것이다. 이미 60년 동안 Bretschneider 연구 그룹은 심장 근육-보호를 개선시키는 새로운 플랜(plan)으로, 국부 허혈 시간을 현저하게 연장시킬 수 있었다. 나트륨을 1회 흡수함으로써 심장 정지가 유발되었고, 세포내 부종이 발생하는 것을 저지하기 위하여 예로써, 국소 마취제, 혈압 강하제, 치과용 국부 마취제와 같은 기질들로 세포막이 보호되었다.

히스티딘과 히스티딘-HCl을 기초로 하는 완충액 시스템으로 특성화되고 그 외에도 나트륨-, 칼륨- 및 마그네슘-이온 및 폴리올(polyol)이나 당류를 함유하는 심장, 신장 및 다른 기관에 대한 보호 용액이 유럽 특허 12272에서 기술되었다. 상기의 보호 용액으로 미처리된 심장에서 얻어지는 시간과는 대조적으로, 인자 8에 의해 허용되는 국부 허혈 시간이 달성된다.

α-케토글루타르트(ketoglutarate) 첨가에 의한 구연산 순환에 긍정적인 영향으로 인하여 보호 용액으로, 대략 8-10분간 지속되는 기관의 관류 동안 호기성 신진대사의 ATP-손실이 축소되는 이런 용액의 추가적인 개선이 유럽 특허 54635에서 기술된다. 이후 여러 해 동안에 Klinker와 다른 생물학자들은 저체온ㆍ저산소혈 기관의 가온과 혈액의 재관류에 의해 종결되고, 기관들이 전체 기능을 다시 회복하는 국부 허혈 종결의 시간적 단계에 주목하였다. 연구는 소위 재관류 단계에서, 재관류 손상(I-R-손실) 개념으로 요약되는 서로 다른 이상 생리학 과정이 진행된다는 것을 보여준다. 특히, 부분적인 원인으로서 가연성 공정의 결과로서 설명되고, 질병발생론에서 반응 산소종이 중요한 의미를 갖는 것처럼 보이는 내피세포의 세포 손상이 나타난다. 게다가, 최근에, 기관을 보호하기 위하여 투입된 냉기가 독립 손상 요소라는 것이 밝혀졌다; 이 당시에 투입된 어떠한 보존 용액도 상기 손상에 대하여 보호를 제공할 수 없었다.

본 발명의 목적은 국부 허혈과 재관류 동안에 아래의 이상생리학적 과정을 방해 또는 축소하는 것이다.

● 허혈 손상

● 냉기 손상(냉기 유발 아폽토시스(apoptosis))

● 재관류 손상

이를 위하여, 특허청구범위 제 1항 또는 선택적으로, 제 8항에서는 앞서 언급된 과제를 이행하는데 사용되는, 기관 보호 용액이 기술된다. 인위적 심장 정지와 기관 보존 시에 세포- 및 조직 손상의 예시된 기전으로부터 기관 보호 용액의 구성이 계속해서 요구되고 있다. 이들 요구를 실현하기 위하여, 특허청구범위 제 1항 및/또는 8항에 따른 새로운 형태의 효과적인 기관보호 용액의 개념을 실현하는 물체가 발견되었다. 용액의 구성은 앞서 언급된 손상 구성요소에 대한 효과적인 보호를 제공하는 방식으로 선택된다. 기전-지향되고, 독성이 아닌 성분에 의해 보존 손상이 분명히 감소될 수 있다. 기관을 가온할 때(우발적으로, 또는 해부시간 동안 발생) 발생하는 알려져 있는 현재 사용되고 있는 보존 용액에서 유독성이 예방된다. 상기 방식으로, 개별 기관 조직의 기능성과 생존력이 개선되고, 국부 허혈- 및 냉각보관 저항력이 높아진다; 그럼으로써, 더욱 긴 기관 보존 시간이 가능해진다. 이는 이식 수술을 위한 기관의 가용성을 개선시켜 물류에도 기여할 수 있다.

하이드록삼산 질소에서 수소 원자가 C₁ 내지 C₂₀을 보유하는 알킬-, 아릴- 또는 알킬아릴-기로 치환된 하이드록삼산 유도체의 이용이 권장된다.

적절하게는, 하이드록삼산 유도체 내에서 하이드록삼산 탄소에서 수소 원자가 C₁ 내지 C₂₀을 보유하는 알킬-, 아릴- 또는 알킬아릴-기로 치환되고, 이때 상기 치환체는 헤테로원자 및/또는 하이드록시-, 아미노-, 메톡시-기를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 하이드록삼산 질소에서 치환체가 하이드록삼산 탄소에서 치환체와 함께 하나의 고리로 봉해질 수도 있다.

본 발명을 위하여, 하기의 그룹으로부터 하나 이상의 화합물 및/또는 염류를 포함하는 용액을 이용할 때 우수한 결과가 달성된다:

아세트하이드록삼산;

아세트-N-메틸하이드록삼산;

N-벤질아세트하이드록삼산;

헥산하이드록삼산;

헥산-N-메틸하이드록삼산;

벤질하이드록삼산;

N-메틸벤즈하이드록삼산;

살리실하이드록삼산;

살리실-N-메틸하이드록삼산;

살리실-N-벤질하이드록삼산;

2-페닐아세트하이드록삼산;

2-페닐아세트-N-메틸하이드록삼산;

3,4-디메톡시벤즈하이드록삼산;

3,4-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;

2,3-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;

2,4-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;

3,5-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;

2,4-디하이드록시벤즈하이드록삼산;

2,3-디하이드록시벤즈하이드록삼산;

3,4-디하이드록시벤즈하이드록삼산;

3,4,5-트리메톡시-벤즈하이드록삼산;

3,4,5-트리메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;

4-하이드록시-3-메톡시-벤즈하이드록삼산;

2-하이드록시-3-메톡시-벤즈하이드록삼산;

2-하이드록시-5-메톡시-벤즈하이드록삼산;

2-하이드록시-3-메틸-이소카보스티릴;

4-클로르-N-메틸-벤즈하이드록삼산;

6-시클로헥시-1-하이드록시-4-메틸-2(1H)-피리돈.

더 나아가, 디페록사민을 상기 용액에 첨가하는 것이 유리하게 고려되는데, 이때 대략 10 mmol/ℓ 농도의 디페록사민이 적절하다.

6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카본산, 바람직하게는, 메틸에스터의 유도체를 상기 용액에 첨가하는 것이 적절하다.

본 발명에서는 또한, 기관, 또는 독립된 세포 시스템이나 조직 성분에서 관류, 수술, 이식 수술 또는 저온 보관과 뒤이은 재관류에 의한 보관 손상, 국부 허혈 손상 또는 재관류 손상을 방지하기 위한 보호 용액으로, 전해질로서 알칼리 이온(alkali ion), 경우에 따라서는 알칼리 이온 산화물, 완충액 및 폴리올(polyol) 및/또는 당류를 함유하고, 대략 290 mosm/ℓ 내지 대략 350 mosm/ℓ의 삼투질농도(osmolarity) 및 대략 6.8 내지 대략 7.4의 pH-값을 제공하고, 하이드록삼산 및/또는 하나 이상의 하이드록삼산 유도체가 첨가되는 보호 용액을 제시한다.

적절하게는, 상기 용액은 N-아세틸히스티딘에 기초한 완충액을 함유한다.

특히 N-아실기의 히스티딘에 기초하고, 경우에 따라서 하나의 유용한 유기 염기(base), 예를 들면, N-글리실히스티딘/N-글리실히스티딘-하이드로클로라이드, 또는 N-아세틸히스티딘-리신 및/또는 -아르기닌 및/또는 -콜린과 조합된 완충액이 유용하다.

상기 용액은 유리한 방식으로, 리신 및/또는 리신 유도체, 특히 리신을 함유한 디펩티드의 양이온 함량뿐만 아니라 경우에 따라서, 아스파라긴산의 음이온 함량을 갖는다.

본 용액에서 하이드록삼산 및/또는 이들의 유도체는 대략 10 mmol/ℓ까지의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 본 용액에서 트롤록스 또는 트롤록스 유도체는 대략 10 mmol/ℓ까지의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

본 용액에서 N-아세틸히스티딘 또는 N-아세틸히스티딘-은 대략 20 mmol/ℓ 내지 대략 265 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

더 나아가, 본 용액에서 전해질로서 대략 10 mmol/ℓ 내지 대략 120 mmol/ℓ 농도의 나트륨이 유용하게 제공될 수 있다.

선택적으로 또는 보충적으로, 본 용액에서 칼륨은 전해질로서 대략 5 mmol/ℓ 내지 대략 25 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것이 적절하다.

더 나아가, 본 용액에서 마그네슘은 대략 3 mmol/ℓ 내지 27 mmol/ℓ의 농도로 포함될 수 있다.

마지막으로, 본 용액에서 칼슘은 대략 0.0001 mmol/ℓ 내지 대략 1.5 mmol/ℓ의 자유 농도(free concentration)로 유용하게 포함될 수 있다.

특히, 본 용액에서 리신(lysin) 및/또는 이의 유도체는 주로, 리신을 함유한 디펩티드로서, 대략 140 mmol/ℓ까지의 농도로 유용하게 포함될 수 있다.

본 용액에서 대략 140 mmol/ℓ까지의 농도로 아스파라긴산(aspartate)이 유용하게 포함될 수 있다.

본 용액에 클로라이드가 포함될 경우, 아스파라긴산이 클로라이드에 비하여 과량으로 제공될 수 있다.

본 용액에서 대략 1 mmol/ℓ 내지 대략 9 mmol/ℓ의 농도로 α-케토글루타르트가 유용하게 포함될 수 있다.

유리한 방식으로, 본 용액에서 삼투질(osmolyte)이 대략 140 mmol/ℓ까지의 농도로 유용하게 포함된다.

앞서 기술된 보호 용액을 제조하기 위하여, 과량의 물에서 필요한 물의 양의 대략 90% 정도로 전해질을 교반하여 유용하게 용해시키고, 완충액 및 후속으로 하이드록삼산 및/또는 이들의 유도체가 첨가되고, pH-값이 조정되고, 몰 농도의 삼투질이 첨가되고, 용액이 물에 의해 원하는 부피로 조정되는 공정이 적절하다.

하이드록삼산 및/또는 이들의 유도체를 제조하기 위하여 저급 알코올, DMF 및/또는 THF가 용액제로서 유용하게 이용될 수 있다.

상기 공정에서 반응은 카본산 에스터(carboxylic acid ester)로 염기 촉매 작용에 의해 특히 효과적으로 수행된다.

본 발명의 보호 용액은 특히, 특허청구범위 제 5항에 따라 심근경색, 뇌졸중, 사고 재해 외과 수술, 또는 수족의 재관류에 따른 허혈 또는 재관류 손상을 완화시키거나 줄이기 위하여 이용될 수 있다. 더 나아가, 철의 과다복용(hyperferrmie)에 기인하는 질병(예, 알츠하이머병) 및 라디칼, 산소 라디칼 또는 H₂O₂에 의한 세포 손상에 기인하는 질병의 치료요법에 본 발명의 보호 용액을 이용하는 것이 적절하다.

철 킬레이트제(iron chelating agent)는 철-의존성 냉각 손상, 또는 냉각 유발된 아폽토시스를 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 세포 손상을 줄이기 위한 화합물로서 모든 복합 형성체가 적합한 것은 아니다. 이런 이유로, 예로써 EDTA, 그리고 Custodiol에 포함된 히스티딘 역시 강한 철 복합체를 형성함에도 불구하고, 이들 리간드는 거의 효력이 없다. 철은 오히려 특정한 방식으로 리간드에 결합되어야 하고, 리간드는 세포내 구획에 빠르고, 그리고 충분한 농도로 도달해야 한다.

디페록사민(deferoxamin)에서 3회 포함되는 하이드록삼산 I 또는 II의 구조요소에 적합한 구조 요소로서, 또는 철에 대한 리간드로서 특별한 의미를 갖는데, 이때 R¹ = C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 알킬아릴은 선형 또는 가지형 헤테로원자 및/또는 OH, -NH₂ 등과 같은 추가의 치환체가 포함될 수 있음을 의미하고, R² = H를 의미하고, 또는 그렇지 않으면 R¹과 같을 수 있고, 이때 R¹과 R²는 하나의 고리로 봉해질 수 있고 및/또는, 예로써 2-하이드록시피리딘-N-산화물과 단지 다른 호변이성 구조를 나타내는 이의 유도체와 같은 추가의 치환체를 포함할 수 있고, 이때 R¹과 R²는 병렬의 이중결합을 가지는 하나의 고리로 봉해질 수 있다. 디페록사민(deferoxamin)과 비교하여 작고 지방에 잘 융해되는 물질로, 강한 철 킬레이트제의 빠른 세포내 처분의 전략이 실현된다.

I II

간단한 하이드록삼산 역시 양성 효과를 나타낸다; 하지만, 좋은 효과를 위하여 특정 친수성/친지성-관계가 요구된다. 그 외에 하이드록삼산 질소에서 알킬-치환된 화합물(R² = 알킬)은 치환되지 않는 화합물(R² = 알킬)보다 보편적으로, 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다. 아래와 같은 화합물 역시 쉽게 철 복합체를 형성함에도 불구하고, R¹이 -CO-R³(R³은 R¹과 같은 동일한 의미를 갖는다)과 같은 강한 전자-당김 그룹(electron-pulling group)이면, 이는 무효능으로 이어진다:

N-하이드록시숙시니미드(hydroxysuccinimid)

3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진.

2가지 샘플 물질의 효과는 도 1과 2에 의해 구체적으로 설명된다.

하이드록삼산 및/또는 유도체는 대략 10 mmol/ℓ까지의 농도로, 유용하게 본 발명에 따른 용액에 포함될 수 있다.

도 1에서는 살리실-N-메틸하이드록삼산에 의한 간 내피세포의 냉각 손상의 억제를 보여준다. 배양된 간 내피세포는 위스콘신 대학(UW)에서 4℃에서 72 h 동안 호기성 조건하에, 1mM 살리실-N-메틸하이드록삼산의 존재와 부재시에 배양되고, 이후 3h 동안 세포 배양 배지 내에서 재가열된다(37℃). 세포 손상의 파라미터로서 시토졸(cytosol) 유산염 탈수소효소(LDH)의 방출이 사용된다.

도 2에서는 3,4-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산에 의한 간 세포의 냉각 손상의 억제를 보여준다. 살리실-N-메틸하이드록삼산 대신에 3,4-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산이 이용되고, 배양 시간이 24 h인 점을 제외하고, 도 1에서와 동일하다.

디페록사민(deferoxamin)은 산화되지 않은 형태에서 여섯 자리(hexadentate) 리간드로서 철에 결합하는 강한 철 킬레이터제이다. 이는 더욱 오랜 냉각 노출 시에 최선의 보호제로서 사용된다. 하지만, 디페록사민은 제한된 비율의 막 투과성을 갖는 상대적으로 큰 친수체 분자이다. 따라서, 디페록사민은 완전한 보호를 제공하기 위하여, 충분한 농도와 속도로 모든 세포내 구획에 도달하지 못한다. 특히, 용액 내에서 대략 10 mmol/ℓ까지의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 기관 보호 용액에 유용하게 첨가될 수 있는 추가의 화합물은 특허청구범위 제 5항과 6항에 표시된다.

본 발명의 구체예에서, 특허청구범위에 따른 용액에 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카본산(트롤록스) 또는 트롤록스-메틸에스터와 같은 이의 유도체가 첨가된다. 상대적 친수체이긴 하지만, 트롤록스 또는 이의 유도체는 냉각 손상과 재산화 손상 시에 발생하는 세포내 라디칼을 저지하기 위해 첨가된다. 트롤록스 또는 이의 유도체는 본 발명에 따른 용액에서 대략 10 mmol/ℓ까지의 농도로 포함된다.

모든 기관 보호 용액은 국부 허혈 동안 산증(acidosis)을 저지하는 완충 물질을 포함한다. 인산염 또는 중탄산염은 이런 목적으로 가장 많이 사용되는 무기물 완충액 시스템이다. 완충 용량과 pH 안정도와 관련하여, Custodiol에 이용된 유기 완충액 시스템, 히스티딘/히스티딘-HCl이 매우 우수한 것으로 증명된다. 예로써, N-아세틸히스티딘과 같은 히스티딘의 유도체가 히스티딘/히스티딘 HCl 대신에 완충액 시스템으로서 앞서 언급된 보호 용액이나 다른 공지된 보호 용액에서 사용되면, 특정한 장점이 생겨난다. 도 3에서는 생리학적 영역에서, 히스티딘/히스티딘 HCl와 비교하여 인자 2로 개선된 N-아세틸히스티딘의 완충 용량을 보여준다. N-아세틸히스티딘으로 대체함으로써, 유익한 완충 용량에 부정적인 영향을 주지 않으면서 히스티딘의 일부 원치 않는 부작용(특히, 예를 들면, 간 세포에서와 같은 일부 세포타입에서 가온 및 냉각 시에 유독성)이 방지된다(도 4 참조).

도 3에서는 히스티딘/히스티딘-HCl과 N-아세틸히스티딘의 중화 곡선을 보여준다. 생리학적 pH-값의 영역에서 이용가능 완충 용량; 소비된 염기 대 기질의 비율에 기초하여 대략 60%의 N-아세틸히스티딘과 대략 30%의 히스티딘.

언급된 완충액 시스템은 본 발명에 따른 용액에서 대략 20 mmol/ℓ 내지 대략 265 mmol/ℓ의 농도로 포함될 수 있다.

도 4에서는 따뜻한 조건하에 히스티딘에 의한 유독성과 히스티딘 유도체에 의한 이러한 유독성의 감소에 대한 한가지 예를 보여준다. 배양된 간 세포는 37℃에서 5h 동안 호기성 조건하에 198 mM L-히스티딘, 또는 198 mM N-아세틸히스티딘의 존재와 부재에서 배양된다. 세포 배양에 자주 사용되는 생리 식염수, 크랩-헨젤라이트-완충용액(KH)이 기초 용액으로서 사용된다; 히스티딘(유도체)-함유 용액은 NaCl 농도가 99 mM 정도로 감소하고 HCl 또는 NaOH의 첨가에 의해 pH-값이 pH 7.2로 조정된다.

이러한 개선은 보존 이후에, 세포 기능의 더욱 나은 보존을 가능하게 한다.

한 가지 양이온으로서 나트륨 이온이 이용된다. 상대적으로 낮은 나트륨 농도는 한편으로, 세포막(심장 박동 정지)의 전기 공학적 디커플링에 유리하고, 다른 한편으로, 산소 결핍-유도된 나트륨 유입의 저지/감소에 기인한 산소 결핍 손상을 감소시킨다. 게다가, 다른 물질(가령, 완충 물질, 아래 참조)에 대한 삼투성 보존(osmotic reserver)이 본래대로 남아있다. 본 용액의 낮은 나트륨 농도에서 항상성(homeostasis)의 빠른 조정이 재관류 단계에서 가능해지는데, 이는 나트륨(140 mM)의 간질성 상승(interstitial increase)이 빠르게 이루어지기 때문이다. 따라서, 본 발명에 따른 용액에서 대략 10 mmol/ℓ 내지 대략 120 mmol/ℓ의 나트륨 농도가 적절하다.

상대적으로 경미하지만 생리학적 세포외 수치를 초과하여 존재하는 칼륨 농도는 세포막(심장 박동 정지)에서 전자공학적 분리를 지지하지만 강한 고칼륨성(hyperkalemic) 용액의 단점을 방지한다(강한 고칼륨성 용액은 빠른 심장 박동 정지를 유도하긴 하지만, 재산소화 단계에서 부정맥 및 경우에 따라서, 더욱 강해진 재관류 손상의 원인이 된다; 재관류 단계에서 간질성 칼륨 농도의 조절이 시간상 지연되고, 이로 인하여 이들 유형의 용액으로 기관의 지연된 최초 기능의 제한이 증가된다). 단지 약간의 고칼륨성 용액은 이식 수술되는 기관으로부터 용액의 용리가 재관류에 앞서 요구되지 않고(이들 용액은 그들의 보호 특성을 허혈 기간의 종결 때까지 나타낼 수 있다) 높은 전신 관용성을 갖는 장점을 가진다. 이런 이유로, 본 발명에 따른 용액에서 칼륨 농도는 대략 5 mmol/ℓ 내지 대략 25 mmol/ℓ가 적절하다.

명백하게 증가된 마그네슘 농도(혈청 표준 값을 초과하여)가 추구되는데, 그 이유는 마그네슘이 수많은 포도당분해 효소 시스템의 보조인자로서 호기성 신진대사를 지지하고, 냉각 국부 허혈 동안에도 ATP의 형성에 기여하기 때문이다. 게다가, 마그네슘은 혈장(plasma) 막의 Na⁺-K¹-ATP아제의 활동력을 유지하는데 기여하고, 따라서 이온 항상성의 변형을 저지한다. 생리학적 Ca² ⁺-길항물질로서 마그네슘은 또한, 세포내 칼슘 축적의 손상 작용을 저지할 수 있다. 재관류 단계에서, 호기성 에너지 신진대사를 자극하기 위하여, 높은 농도의 마그네슘이 요구된다. 마그네슘의 혈관확장 특성은 그 외에도, 재관류 손상의 구조적 효과를 저지한다. 따라서, 본 발명에 따른 용액에서 마그네슘 농도는 대략 3 mmol/ℓ 내지 대략 27 mmol/ℓ이 적절하다.

허혈 조건(이와 연관된 세포내 산증 및 나트륨 항상성의 기능장애)에서 시토졸 칼슘 상승의 위험이 존재한다. 이는 원하지 않는 활성, 예를 들면, 프로테아제와 포스포리파아제 자극의 상승으로 이어지고, 심장에서 높은 ATP-소모를 유발하는 과수축과 결부된다. 따라서 칼슘의 생리학적 기능들은 국부 허혈 동안 광범위하게 억제되고, 이런 이유로 본 용액에서 칼슘 농도는 세포질(cytoplasmic) 농도의 범위 내에 있어야만 한다. 따라서, 본 발명에 따른 용액에서 칼슘 농도는 대략 0.0001 mmol/ℓ 내지 대략 1.5 mmol/ℓ가 적절하다.

염기성 아미노산, 리신과 아르기닌, 또는 글리신을 포함하는 디펩티드(Lys-Gly, Gly-Lys, 또는 Arg-Gly, Gly-Arg)와 같은 이들의 유도체는 염기 등가물의 결핍을 보상하는데 이용될 수 있는데, 그 이유는 양이온 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 그리고 칼슘의 농도와 비율이 앞서 기술된 사실에 근거하여 결정되기 때문이다. 본 발명에 따른 용액에서 리신 및/또는 리신 유도체, 또는 아르기닌 및/또는 아르기닌 유도체의 농도는 각각 대략 140 mmol/ℓ까지 일 수 있다.

생리학적 세포외 음이온 클로라이드는 냉각 허혈 동안 이온 항상성의 붕괴를 감소시키기 위하여, 생리학적 수치와 비교하여 명백하게 낮은 농도로 이용된다. 이는 특히 나트륨과 같은 양이온의 과산소-유발된 유입에 경우에 그러하다. 전기 중립성의 이유에서, 상기 유입은 음이온, 특히 클로라이드의 병렬 유입에 좌우된다. 상이한 저자들의 지시는 높은 클로라이드 농도가 세포내 부종의 정도에 유익하다는 결론으로 이어진다. 따라서 본 발명에 따른 용액에서 클로라이드 농도는 가능한 생리학적 수준 아래, 최대 90 mmol/ℓ까지 유지되도록 한다. 클로라이드와 병행하여, 락토바이오네이트(lactobionate) 역시, 대략 140 mmol/ℓ까지의 농도에서 비침투성 음이온을 첨가할 수 있다.

기관 보호 용액에 이용된 음이온의 농도는 일반적으로, 양이온과 사용된 (무)유기 완충액의 선택에 의해 달성된다. 비침투성 음이온, 예를 들면, 락토바이오네이트를 사용하는 것은 세포내 부종의 발생을 상쇄하기 위한 것이다. 아스파라긴산의 사용으로 더욱 많은 목표가 달성될 수 있기 때문에, 아스파라긴산은 특히 우수한 대안이다:

a) 아스파라긴산은 산의 등가물로서, 이익이 없는 클로라이드를 대체한다.

b) 아스파라긴산은 막에 있어 물질 교환을 능동적으로 지지하고 항상성 복구를 가속한다.

c) 아스파라긴산은 α-케토글루타르트와 결합하여, 재관류의 결정적인 단계에서 호기성 에너지 신진대사, 또는 기관의 재산소화를 지지하고 이의 최초 기능을 가속한다.

구체적으로, 재산소화 단계에서 기관의 증가된 가온으로 에너지 소비가 현저히 상승한다면, 에너지 공급을 가속화하는 것이 필수적인데, 그 이유는 ATP 결핍이 특히 이러한 가온 단계에서 기관의 기능성을 현저히 방해하고 재관류 손상의 정도를 증가시키기 때문이다. 본 발명에 따른 용액에서 아스파라긴산 농도는 대략 140 mmol/ℓ 까지가 적절하다. 본 발명에 따른 용액에서 아스파라긴산은 클로라이드와 관련하여 과량으로 존재하는 것이 적절하다.

아미노산 글리신은 높은 밀리몰(millimolar) 농도로 이용되는데, 그 이유는 글리신이 상기 농도에서 혈장 막의 안정화(확산-지향된 물질 교환의 예방)에 의해 저산소-유도된 나트륨 유입을 방해하고, 게다가 대식세포의 활성화를 저지하기 때문이다. 본 발명에 따른 용액에서 대략 30 mmol/ℓ까지의 글리신 농도가 적절하다.

또한, 냉각 국부 허혈 동안 개별 기관의 에너지 소비가 무의미한 것이 아니기 때문에, 지지를 위한 에너지 제공 기질 또는 에너지 신진대사 촉진 기질이 용액에 첨가된다. 상이한 개념이 추구되는데(상기 아스파라긴산, 그리고 하기 알파-케토글루타르트 참조), 이들 중의 하나가 포도당에 의해 첨가된다.

본 용액에서 생리학적 포도당 농도는 비교적 적은 글리코겐 보관으로 인하여 외인성 포도당 공급에 의존하는 세포, 예를 들면, 내피 세포가 국부 허혈 동안 혐기성 포도당분해를 통한 에너지 획득을 가능하게 한다. 그러나, 포도당 농도는 다른 세포, 특히 간 세포에 의한 지나친 포도당 흡수(극히 높은 포도당 농도를 가지는 기존의 보존 용액에서의 문제점)가 방지되도록 선택된다. 이런 이유로, 본 발명에 따른 용액은 10 mmol/ℓ까지의 포도당을 포함할 수 있다.

α-케토글루타르트는 저산소 조건 하에서/에 따라서 신진대사의 지지를 위하여 아스파라긴산과 함께 사용된다. 적절하게는, 대략 1 mmol/ℓ 내지 대략 9 mmol/ℓ의 농도가 선택된다.

대략 300 mosm/ℓ의 요구된 생리학적 삼투 압력(osmotic pressure)을 달성하기 위하여 필요한 만큼, 본 발명에 따른 용액에 삼투 작용 물질의 첨가가 요구된다. 일반적으로, 폴리올/당류(가령, 만니톨, 라피노즈, 사카로즈), 또는 고분자량 물질(가령, HES, 덱스트란))이 이런 목적으로 사용된다. 후자는 일부 기관에 대하여 충분히 입증되지 않았는데, 그 이유는 HES와 덱스트란으로 발생된 고 점착성의 단점이 보호 품질에 부정적인 영향을 주기 때문이다.

4℃에서 점착성:

Custodiol® 1.8 cP

UW - 용액 4.8 cP

기관에 따라, 삼투질(osmolyte)로서 만니톨, 자일리톨, 소르비톨, 사카로즈 또는 라피노즈가 이용되어야 한다. 삼투질-농도는 본 발명에 따른 용액에서 140 mmol/ℓ까지가 적절하다.

간질성 부종의 방지를 위하여, 일부 기관/조직에서, 예로써 덱스트란-40 또는 덱스트란-70과 같은 콜로이드 삼투 작용 물질을 첨가하는 것이 바람직하다. 이는 기관지와 췌장 보호의 경우에 특히 그러하다.

세포와 조직의 냉동의 경우에, 예로써 디메틸술폭시드(DMSO)와 같은 추가적인 항냉동제(cryoprotectant)의 첨가가 바람직하다.

도 5에서는 과산화수소에 의한 간 세포의 세포 손상 및 다양한 하이드록삼산에 의한 이의 보호를 보여주는데, 상기 도면은 다음에 관련된다:

곡선 1) N4 + 20 mM/ℓ H₂O₂

곡선 2) N4 + 20 mM/ℓ H₂O₂ + 1 mM/ℓ 4-클로로-N-메틸-벤즈하이드록삼산

곡선 3) N4 + 20 mM/ℓ H₂O₂ + 1 mM/ℓ 2-하이드록시-3-메틸-이소카보스테릴

곡선 4) N4 + 20 mM/ℓ H₂O₂ + 1 mM/ℓ 3,4,5-트리메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산

곡선 5) N4 + 20 mM/ℓ H₂O₂ + 1 mM/ℓ 3,4-디메톡시-N-메틸-하이드록삼산

이때, N4는 트롤록스와 하이드록삼산 유도체가 없는, 하기 실례 II에 따른 용액을 의미한다.

도 6에서는 새로운 보존 용액에 의한 간 세포의 냉각 손상의 억제를 보여준다. 배양된 간 세포는 4℃에서 24h 동안 본 발명에 따른 용액(완충액으로서 N-아세틸히스티딘, 트롤록스 1mM/ℓ, 그리고 하이드록삼산 유도체, 베라트릴(veratryl)-N-메틸하이드록삼산 0.5 mM/ℓ 포함)에서, 그리고 비교를 위하여 크랩-헨젤라이트-완충액(Krebs-Henseleit buffer, KH)에서 배양한다. 차가운 배양이 호기성 조건하에 수행된다; 24h후, 세포는 37℃에서 세포 배양 배지에서 재관류의 시뮬레이션을 위하여 다시 가온된다. 세포 손상의 인디케이터로서 시토졸 유산염 탈수소효소(LDH)의 분리가 사용된다.

도 1에서는 살리실-N-메틸하이드록삼산이 간 내포세포의 냉각 손상을 억제하는 것을 보여준다.
도 2에서는 3,4-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산이 간 세포의 냉각 손상을 억제하는 것을 보여준다.
도 3에서는 히스티딘-HCl과 N-아세틸히스티딘의 중화 곡선을 보여준다.
도 4에서는 따뜻한 조건하에 히스티딘에 의한 유독성과 히스티딘 유도체에 의한 이러한 유독성의 감소에 대한 한가지 예를 보여준다.
도 5에서는 과산화수소에 의한 간 세포의 세포 손상 및 다양한 하이드록삼산에 의한 이의 보호를 보여준다.
도 6에서는 새로운 보호 용액에 의한 간 세포의 냉각 손상의 억제를 보여준다.

아래에서는 본 발명에서 청구된 보호범위에 상응하는 용액의 일부 실례를 도시한다.

실례 I:

실례 Ⅱ:

실례 III:

실례 IV:

실례 V:

기관 보호 용액의 기능적 구성요소, 즉 완충액 시스템, 전해질, 보호 작용 물체, 그리고 삼투질에 따라서 본 발명에 따른 용액이 제조된다. 이를 위하여, 완충액 물질은 필요한 물의 양의 대략 90%에서 먼저 희석된다. 이후, 전해질로서 필요한 양이온, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 그리고 칼슘의 중성염이 지시된 생리학적으로 유효한 농도로 첨가되고 용해될 때까지 교반된다. 추가의 구성요소로서, 용액에 보호 작용 물질이 첨가된다. 이후, 용액의 pH-값이 조사되고 경우에 따라서 특허청구범위 제 1항에서 제시된 값으로 조정된다. 최종적으로, 지정된 양의 삼투질이 첨가되고, 용액은 원하는 부피로 희석된다. 적합한 용기 내로 채워진 이후, 본 용액은 살균된다.

시클릭(cyclic) 하이드록삼산, 예를 들면, 2-하이드록옥시피리딘-N-옥시드로부터 유도된 화합물의 제조는 예로써, Organic Synthesis Collektiv Volume V Page 623과 그 다음 페이지에서 기술된다. 카본산 유도체로부터 하이드록삼산을 제조하는 공정은 Houben-Weyl Method of Organic Chemie Page 686과 그 다음 페이지에서 찾아볼 수 있는데, 이때 용해제로서 저급 알코올, DMF, THF가 이용된다. 개별 카본산 에스터를 이용한 반응은 알칼리성 촉매 방식(NaOMe, K₂CO₃, CaO)로 실행될 수 있다. 최종적으로, 시클릭 하이드록삼산을 제조하기 위하여 A. Kleemann, J. Engel, Pharmazeutische Wirkstoffe, Volume 2, Page 206과 그 다음 페이지를 참고한다.

Claims

기관, 또는 독립된 세포 시스템이나 조직 성분에서 관류, 수술, 이식 수술 또는 저온 보관 및 뒤이은 재관류에 의한 보관 손상, 국부 허혈 손상 또는 재관류 손상을 방지하기 위한 보호 용액에 있어서, 전해질로서 나트륨과 칼륨 중에서 최소한 한 가지, 글리실히스티딘을 포함하는 완충액 및 폴리올이나 당류를 함유하고, 290 mosm/ℓ 내지 350 mosm/ℓ의 삼투질농도(osmolarity) 및 6.8 내지 7.4의 pH-값을 제공하며, 하나 이상의 하이드록삼산 유도체가 첨가되고, 상기 하이드록삼산 유도체는 살리실하이드록삼산;
살리실-N-메틸하이드록삼산;
살리실-N-벤질하이드록삼산;
3,4-디메톡시벤즈하이드록삼산;
3,4-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;
2,3-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;
2,4-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;
3,5-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;
2,4-디하이드록시벤즈하이드록삼산;
2,3-디하이드록시벤즈하이드록삼산;
3,4-디하이드록시벤즈하이드록삼산;
3,4,5-트리메톡시-벤즈하이드록삼산;
3,4,5-트리메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산;
4-하이드록시-3-메톡시-벤즈하이드록삼산;
2-하이드록시-3-메톡시-벤즈하이드록삼산; 또는
2-하이드록시-5-메톡시-벤즈하이드록삼산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
삭제
제 1항에 있어서, 마그네슘과 칼슘 중에서 최소한 한 가지를 더욱 함유하는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
기관, 또는 독립된 세포 시스템이나 조직 성분에서 관류, 수술, 이식 수술 또는 저온 보관 및 뒤이은 재관류에 의한 보관 손상, 국부 허혈 손상 또는 재관류 손상을 방지하기 위한 보호 용액에 있어서, 전해질로서 나트륨과 칼륨 중에서 최소한 한 가지 및 마그네슘과 칼슘 중에서 최소한 한 가지, 글리실히스티딘에 기초한 완충액 및 폴리올이나 당류를 함유하고, 290 mosm/ℓ 내지 350 mosm/ℓ의 삼투질농도(osmolarity) 및 6.8 내지 7.4의 pH-값을 제공하며, 3,4-디메톡시-N-메틸-벤즈하이드록삼산과 디페록사민이 첨가되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
삭제
제 1항에 있어서, 디페록사민(deferoxamin)이 첨가되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만(tetramethylchroman)-2-카본산(이하, 트롤록스) 또는 이의 유도체가 첨가되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 기관, 또는 독립된 세포 시스템이나 조직 성분에서 관류, 수술, 이식 수술 또는 저온 보관 및 뒤이은 재관류에 의한 보관 손상, 국부 허혈 손상 또는 재관류 손상을 방지하기 위한 보호 용액은 전해질로서 나트륨과 칼륨 중에서 최소한 한 가지, 글리실히스티딘에 기초한 완충액, 그리고 폴리올이나 당류를 함유하고, 290 mosm/ℓ 내지 350 mosm/ℓ의 삼투질농도(osmolarity) 및 6.8 내지 7.4의 pH-값을 제공하는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 8항에 있어서, 완충액 (N-글리실히스티딘/N-글리실히스티딘-하이드로클로라이드)를 포함하는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 9항에 있어서, 완충액 (N-아세틸히스티딘/리신), (N-아세틸히스티딘/아르기닌), 또는 (N-아세틸히스티딘/콜린)에서 선택되는 완충액이 복합된 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 아스파라긴산의 음이온 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 하이드록삼산 유도체가 최대 10 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 6항에 있어서, 디페록사민(deferoxamin)이 최대 10 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 7항에 있어서, 트롤록스(trolox) 또는 이의 유도체가 최대 10 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 8항에 있어서, 글리실히스티딘이 20 mmol/ℓ 내지 265 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 전해질로서 나트륨이 10 mmol/ℓ 내지 120 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 전해질로서 칼륨이 5 mmol/ℓ 내지 25 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 3항에 있어서, 마그네슘이 3 mmol/ℓ 내지 27 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 3항에 있어서, 칼슘이 0.0001 mmol/ℓ 내지 1.5 mmol/ℓ의 자유 농도(free concentration)로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 10항에 있어서, 양이온으로서 리신, 또는 리신을 함유한 디펩티드(dipeptid)가 최대 140 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 아스파라긴산이 최대 140 mmol/ℓ의 농도로 추가로 더 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 클로라이드가 추가로 더 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 아스파라긴산과 클로라이드가 추가로 더 포함되며, 이때 아스파라긴산이 클로라이드에 비하여 과량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, α-케토글루타르트가 1 mmol/ℓ 내지 9 mmol/ℓ의 농도로 추가로 더 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 삼투질(osmolyte)이 최대 140 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항 또는 제 3항에 따른 보호 용액을 제조하는 방법에 있어서, 과량의 물에서 필요한 물의 양의 90%로 전해질을 교반하여 용해시키고, 완충액 및 후속으로 하이드록삼산 또는 이들의 유도체가 첨가되고, pH-값이 조정되고, 삼투질이 첨가되고, 용액이 물에 의해 원하는 부피로 조정되는 것을 특징으로 하는, 보호 용액 제조 방법.
제 26항에 있어서, 하이드록삼산 또는 이들의 유도체를 제조하기 위하여 저급 알코올, DMF 또는 THF가 용해제로서 이용되는 것을 특징으로 하는, 보호 용액 제조 방법.
제 27항에 있어서, 카본산 에스터로 염기 촉매 작용에 의해 반응이 수행되는 것을 특징으로 하는, 보호 용액 제조 방법.
제 9항에 있어서, 경색 또는 염증 반응 이후 국부 허혈 손상 또는 재관류 손상으로부터 보호에 이용되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 심근경색, 뇌졸중, 사고 재해 외과 수술, 또는 수족의 재관류에 따른 재관류 손상을 완화시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 24항에 있어서, 폴리올 또는 당류로 구성된 군에서 선택되는 삼투질이 최대 140 mmol/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.
제 1항에 있어서, 라디칼, 산소 라디칼 또는 H₂O₂에 의한 세포 손상의 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 보호 용액.