CN103238586B

CN103238586B - 一种心肌脏器保存液制备方法

Info

Publication number: CN103238586B
Application number: CN201310103887.2A
Authority: CN
Inventors: 关屹; 闫冬; 高晓峰
Original assignee: LIAONING MILLION BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Yiling Medical Science and Technology Development Co., Ltd.
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-03-28
Also published as: CN103238586A

Abstract

本发明提供一种心肌脏器保存液HTK液的制备工艺，在市售标准配方基础上，调整配液原料添加顺序，加入充氮步骤，以及对灭菌参数进行优化，工艺简单，操作方便，2-酮戊二酸氢钾含量稳定在95%以上，适合于工业化生产。

Description

一种心肌脏器保存液制备方法

技术领域

本发明涉及医疗器械领域，具体涉及一种心肌脏器保存液HTK液及其制备工艺。

背景技术

HTK液由Bretschneider于1975年研制，是目前应用最广泛的器官保存液，可用作心脏、肾脏、肝脏、胰腺等脏器的保存，临床上大大提高了器官移植的成功率。

一种成功的器官保存液应满足以下要求：减少低温保存导致的细胞水肿；防止细胞的酸化作用；防止细胞灌洗保存过程的细胞间隙膨胀；防止氧自由基的损伤，尤其在再灌洗过程中；提供再生高能磷酸化合物底物；保持细胞内环境稳定。

HTK液具有以下特点(1)含钾量低，故HTK液易于进入受体循环系统．且可反复或持续性原位灌洗无任何副作用及危险性；(2)含组氨酸／组氨酸-盐酸缓冲系统．有较强的缓冲能力．且组氨酸为有效的非渗透性因子，故可防止内皮细胞肿胀；(3)含色氨酸，作为膜稳定剂．可防止组氨酸进入细胞内；(4)含甘露醇，作为羟自由基的清除剂，可防止氧自由基的损伤，同时兼有渗透支持的作用；(5)含酮戊二酸及色氨酸作为高能磷酸化合物的底物；(6)HTK液粘度低．常温下粘度指数为0.8，5℃时粘度指数为3.0，故更易于扩散至组织间隙，也易于在短时间内使器官降温。

目前我国市场上的器官保护液多为进口产品，国内对此项研究日渐增多，但至今仍无一国产器官保存液经国家批准可在医疗市场流通，且进口产品需低温保存，运输成本高，使用不便，其中主要成分之一的2-酮戊二酸氢钾在储存温度达到20℃以上1小时就降解并导致产品失去器官保护作用。因此，制备一种稳定性好、成本低、效果好的多器官保护液显得尤为重要。

我们在研究过程中发现，2-酮戊二酸氢钾与其他成分同时溶解配液后，所得产品稳定性较差，本发明在进口产品配方基础上对制备工艺进行了改进，使有效成分2-酮戊二酸氢钾更加稳定，产品在40℃下放置20天仍可保证含量稳定，避免了全程冷链运输，提高了产品稳定性和安全性，降低了成本，提高了产品收益，适合于工业化生产。

发明内容

本发明在进口产品配方基础上，对工艺进行优化，调整了2-酮戊二酸氢钾的配液顺序，并加入充氮工艺步骤，以及对灭菌参数进行优化，主要成分2-酮戊二酸氢钾含量稳定在95%以上，其他物质含量稳定。工艺简单，易于操作，从而保证了生产工艺的可重复性高，易于控制。

本发明中，HTK液组分包括：氯化钠15mmol，氯化钾9 mmol，六水氯化镁4 mmol，一水一盐酸组氨酸18 mmol，组氨酸180 mmol，色氨酸2 mmol，二水氯化钙0.015 mmol，甘露醇30 mmol ，2-酮戊二酸氢钾1 mmol以及注射用水1000ml。

2-酮戊二酸氢钾与其他组分混合溶解会导致含量降低，分析其可能与其它成分在部分原辅料溶解后形成的某一特定环境下发生反应，因此，本发明着重考察了2-酮戊二酸氢钾的加入顺序，有如下3种方案：

（1）将2-酮戊二酸氢钾最先加入注射用水中溶解后，加入其它成分溶解混匀，即：2-酮戊二酸氢钾，氯化钠，氯化钾，六水氯化镁，一水一盐酸组氨酸，组氨酸，色氨酸，二水氯化钙，甘露醇；

（2）将所有离子物质加入注射用水中溶解后再加入2-酮戊二酸氢钾溶解，待溶解后加入其它剩余物料溶解混匀，即：氯化钠，氯化钾，六水氯化镁，二水氯化钙，2-酮戊二酸氢钾，一水一盐酸组氨酸，组氨酸，色氨酸，甘露醇；

（3）将除2-酮戊二酸氢钾外其它成分均加入注射用水溶解后，再加入2-酮戊二酸氢钾溶解混匀，：氯化钠，氯化钾，六水氯化镁，二水氯化钙，一水一盐酸组氨酸，组氨酸，色氨酸，甘露醇，2-酮戊二酸氢钾。

测试结果：三种方案2-酮戊二酸中间体含量分别为：86.33%，83.43%，96.61%。

由此可知，2-酮戊二酸氢钾在其它原辅料均溶解完全后，再加入溶解，中间体含量不再降低，因此HTK溶液配液顺序确定为，将除2-酮戊二酸氢钾外其它成分均溶解于75%体积注射用水中，再加入2-酮戊二酸氢钾溶解，混匀。

在工艺过程中，保护样品避免被氧化是保证样品有效含量的重要技术，本发明采用充氮技术条件下进行配液、121℃灭菌20min，以组氨酸、色氨酸、2-酮戊二酸氢钾在高温60℃放置10天条件下的稳定性为考察指标，结果表明，HTK溶液在充氮保护条件下，在高温60℃放置过程中，2-酮戊二酸氢钾稳定性可得到显著提高，因此HTK溶液制备工艺中选择进行充氮保护。

表1 充氮条件下样品组分稳定性

从上表可见，经过灭菌的样品中，2-酮戊二酸氢钾的稳定性得到了提高，但含量下降了5%左右，针对上述情况，我们对灭菌温度及时间进行了考察，为保证HTK溶液灭菌后的无菌保证水平不低于10^-6，灭菌温度及时间均符合终端灭菌条件，设定灭菌条件分别为121℃， 20min及115℃， 30min，以灭菌前、后组氨酸、色氨酸、2-酮戊二酸中间体含量为考察指标结果如下：

表2 灭菌条件考察结果

上述结果表明，组氨酸及色氨酸在两种终端灭菌条件下均稳定，2-酮戊二酸氢钾在121℃，灭菌20min条件下降低5%，而在115℃，灭菌30min条件下，其含量无显著变化，且上述两种灭菌条件均能保证F0>8，从而可充分保证HTK溶液的无菌保证水平小于10^-6，综合考察，HTK溶液灭菌条件选择为115℃，灭菌30min。以115℃，30min为灭菌条件，再制备两批HTK溶液进行灭菌，以验证灭菌条件是否可行，经验证，两批样品灭菌后均稳定，F0均大于8。

此外，我们还针对配液温度，活性炭吸附以及过滤膜几项工艺进行了考察。

关于溶解温度，组氨酸及色氨酸溶解时间较长，需要30min以上，在生产环节耗时较长，为了提高生产效率节约成本，对溶解温度进行考察，以溶解时间和稳定性为考察指标。分别选取25℃、40℃、60℃三个温度进行配液，考察组氨酸、色氨酸以及对热不稳定的2-酮戊二酸氢钾得溶解时间和稳定性，结果如下：

表3 配液温度考察结果

上述结果表明，2-酮戊二酸氢钾在25℃、40℃、60℃条件下放置4小时均稳定，含量无明显变化，而在40℃、60℃条件下配液组氨酸、色氮酸溶解时间可明显缩短，配液效率可得到较大改善，因此配液工序选择为在50℃~60℃范围内溶解HTK溶液各组份。

HTK心肌脏器保护液是一种无菌、无热原制剂。活性炭吸附是液体制剂除热原的有效手段之一，也是最常用的方法，但活性炭吸附热原的同时也对主药有一定的吸附，从而使含量降低，因此我们考察合适的活性炭用量来达到即能除掉热原又不降低含量的效果。

表4 活性炭吸附考察结果

由实验结果可以看出，活性炭对组氨酸、氯离子、镁离子、甘露醇、钾离子、钠离子均无吸附；当活性炭用量为0.05%时，可保证热原有效去除，但同时色氨酸、2-酮戊二酸氢钾、钙离子有不同程度的吸附。因此，为保证色氨酸、2-酮戊二酸氢钾、钙离子三组份在HTK溶液中的有效剂量，配液工序中选择将色氨酸高投10%，2-酮戊二酸氢钾高投25%，氯化钙高投30%。

HTK溶液过0.22μm微孔滤膜时，经试验验证，过膜前后组氨酸、色氨酸、2-酮戊二酸氢钾的含量无显著变化。

综上，本发明心肌脏器保护液制备方法包括：

（1）配液：在充氮条件下称量处方量各组分，依次加入盐酸组氨酸、组氨酸、甘露醇、氯化钠、氯化钾、氯化镁搅拌使溶解；将药液温度冷至50～60℃，依次加入氯化钙、色氨酸、2-酮戊二酸氢钾，搅拌使溶解。

（2）吸附过滤：加入0.05%（w/v）用量活性炭，50℃吸附15min后，脱炭；过0.22μm滤膜。

（3）封装灭菌：充氮、灌封；115℃湿热灭菌30分钟后，迅速冷却；样品于2~15℃条件下保存。

本发明制备的心肌脏器保护液在器官移植中的应用，用于心脏、肾脏、肝脏、胰腺等脏器的保存。

具体实施方式

实施例1 HTK心肌脏器保护液的制备

组分	处方量（g）	摩尔质量	用量（mmol）
				一水一盐酸组氨酸	37.733	209.63	18
组氨酸	279.289	155.16	180
				甘露醇	54.651	182.17	30
氯化钠	8.766	58.44	15
				氯化钾	6.710	74.55	9
六水氧化镁	8.132	203.3	4
				二水氯化钙	0.022	147.02	0.015
色氨酸	4.085	204.23	2
				2-酮戊二酸氢钾	1.842	184.19	1
注射用水	适量
				制成	10000ml

制备方法：在充氮条件下配液，量取75%体积注射用水于配液罐中；称量处方量各组分，依次加入盐酸组氨酸、组氨酸、甘露醇、氯化钠、氯化钾、氯化镁搅拌使溶解；将药液温度冷至50～60℃，依次加入氯化钙、色氨酸、2-酮戊二酸氢钾（其中氯化钙按130%投料，色氨酸按110%投料，2-酮戊二酸氢钾按125%投料），搅拌使溶解。

补水定容至全量，加入0.05%（w/v 总体积）用量活性炭，50℃吸附15分钟后，脱炭；过0.22μm滤膜，测定中间体，使色氨酸、2-酮戊二酸氢钾含量均在95.0~105.0%范围内，使pH值在7.05~7.15（25±1℃）范畴内。

充氮、灌封、500ml/支；115℃灭菌30分钟后，迅速冷却；样品于2~15℃条件下保存。如上制备方法小试三批样品进行外观性状和组分含量检测，检测结果：

表5 小试样品外观性状和组分含量检测结果

从验证数据表可知，测定的各项指标均符合质量标准草案规定，且工艺稳定性良好，操作过程简单，重复性高。

实施例2

按照实施例1处方和方法另制几批样品，进行理化指标考察，以市售进口HTK液进行比对。进口产品注册标准YZB/GEM 1746-2006《HTK溶液》中规定：溶液应清亮透明，无可见颗粒；溶液的颜色应不得深于标准比色管G6的颜色。溶液的pH值应为7.02~7.20（ 25 ℃ ± 1℃）。渗透压应为310±20（mOsm/kgH₂O）。干燥残渣应为0.3812~0.4212g/10ml。取样品量2g，按照GB/T 14233.1中6进行试验，检验液中重金属总含量应不超过1μg/ml；按照GB/T 14233.1中7进行试验，镉的含量应不超过0.1μg/ml。溶液应无可见异物。不溶性微粒应符合要求（10μm以上的微粒不得超过25，25μm以上的微粒不得过3）。

表6 与市售对比样品理化指标考察结果

从上可知，自制样品与市售样品理化指标一致，且皆符合规定标准。

实施例3 2-酮戊二酸含量稳定性对比考察

进口产品配方中，2-酮戊二酸氢钾在储存温度达到20℃以上数小时内就降解并导致产品失去器官保护作用，因此，需全程冷链保存，针对这一问题，我们对制备工艺进行了改进。考察自制的器官保存液与进口产品分别在20℃和40℃条件下的含量稳定性。

按照实施例1方法自制一批样品与市售进口产品，置于温度20℃以及40℃中，于0h、5d、10d、20d取样测定2-酮戊二酸氢钾含量（mg/L），并与0d含量进行比较，试验结果如下：

表7 2-酮戊二酸20℃及40℃含量稳定性对比结果

从以上试验结果可以看出，进口对比产品在20℃条件下，5h稳定性尚好，10h时和20h含量已有所下降；40℃5h稍有下降，10h及20h时则含量大大降低，相比之下，自制样品中，2-酮戊二酸的含量在20℃及40℃条件下放置20h无明显下降，稳定性良好。

实施例4 生物学评价

对实施例1制备的心肌脏器保护液进行无菌、内毒素、遗传毒性、皮内刺激、致敏性以及急性全身毒性试验检查。

HTK溶液规定应为无菌溶液，溶液先用薄膜过滤器过滤，取出滤膜分别装入装有硫葡萄糖培养基和装有酪蛋白汁培养基的试管中，在37℃温度下培养10天，检查细菌生长情况。

试验结果：均无菌生长，符合无菌规定。

按照YY/T 0618中规定的方法对自制样品进行细菌内毒素试验，溶液的细菌内毒素符合小于0.5EU/ml规定。按照GB/T 16886.3中规定的方法对自制样品进行遗传毒性试验，按照GB/T 16886.11中规定的方法对自制样品进行急性全身毒性试验，按照GB/T 16886.10中规定的方法对自制样品进行皮内刺激试验，按照GB/T 16886.10中规定的方法对自制样品进行致敏试验。

试验结果：几项检测结果皆符合规定。

实施例5 稳定性考察

根据中国药典2010年版二部附录ⅪⅩ C稳定性试验指导原则中制剂稳定性考察中所列考察项目和HTK溶液质量标准（草案）进行了稳定性试验。

样品：自制心肌脏器溶液，500ml/瓶；

考察指标：外观性状、pH值、可见异物、无菌、各组分含量。

A、加速试验：

将一批模拟上市包装样品，置温度25±2℃、相对湿度为75%±5%的恒温箱中放置7天，于0、7天末取样测定。加速试验结果表明：本品在模拟上市包装条件下，于温度25±2℃、相对湿度为75%±5%条件下保存7天，样品的外观性状、pH值、可见异物、无菌及各组分含量等主要考察指标与0天相比无明显变化，质量稳定，结果如下：

表8 加速试验考察结果

B、长期稳定性试验

将一批模拟上市包装样品，置于留样室（温度6±2℃，相对湿度60% ± 10%）中，于3、6、9、12个月末取样测定，并与0月的检测结果进行比较。目前已完成为期12个月的长期稳定性试验。长期试验结果表明：本品在规定贮藏条件下放置12个月，样品的外观性状、pH值、可见异物、无菌及各组分含量等主要考察指标与0月相比无明显变化。结果如下：

表9 长期试验考察结果

Figure 2013101038872100002DEST_PATH_IMAGE017

试验结论：

自制样品经加速和长期留样试验，样品的外观性状、pH值、可见异物、无菌及各组分含量等主要考察指标与0月相比无明显变化，表明本品稳定性良好。

实施例6 有效性和不良反应考察

本临床试验方案根据国家食品药品监督管理局《医疗器械临床试验规定》（局令第5号）的原则进行设计。为更好的验证心肌脏器保护溶液（HTK溶液）的有效性和安全性，选择德国克勒化学制药生产的HTK溶液作为对照组。

临床试验方案遵循赫尔辛基人体医学研究的伦理准则。试验开始前方案已获得伦理委员会批准。本临床试验采用随机、开放、平行对照的非劣效性临床试验设计

本研究共入组120例(A组:60例、B组:60例)，两个中心各入组60例，120例全部完成试验，且全部进入FAS、PPS、SS。试验结果表明，心肌脏器保护溶液（HTK溶液）用于心脏外科手术过程中心脏停搏及心肌保护是安全、有效的。

本试验采用随机、开放、对照、多中心的研究方法，由2个中心共同完成。共入组病例120例，试验组和对照组各60例，且全部进入FAS、PPS、SS，无脱落、剔除。两组人口学特征均衡可比（P>0.05），基线期两组生命体征及体格检查（身高、体重、体温、心率、收缩压、舒张压、呼吸频率、心电图）相比差异无统计学意义（P>0.05），在使用产品依从性方面两组依从性均为100%。

疗效性方面，本试验主要疗效指标为心脏复跳率、心律失常（室颤、室速）发生率，次要疗效指标为诱导心脏停搏的时间、血管活性药物使用情况、复跳前后心脏心率。结果显示：心脏自动复跳率（百分比）试验组为88.33%，对照组为90%，心律失常（室颤、室速）发生率（百分比）试验组为24(40%)，对照组为25(41.67%)；诱导心脏停搏的时间（标准差）试验组为6.72(0.78)，对照组为6.55(0.86)，血管活性药物使用率（百分比）试验组为40%，对照组为41.67%，复跳前心脏心率（标准差）试验组为69.95，对照组为70.7，复跳后心脏心率（标准差）试验组为73.25，对照组为74.93，复跳后心率—复跳前心率(标准差)试验组为3.3，对照组为4.23。两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

安全性方面，本试验分别从不良事件、实验室检查等方面对心肌脏器保护溶液（HTK溶液）的安全性进行评价和比较。

结果显示：治疗前后患者生命体征，体温、心率、呼吸皆在正常变化范围，治疗前后实验组组内对比收缩压和舒张压无明显变化，对照组收缩压和舒张压皆在正常范围内变化，无安全性影响。

本次试验无不良事件发生，本产品安全性良好。

Claims

1.一种心肌脏器保护液，组分包括氯化钠15mmol，氯化钾9 mmol，六水氯化镁4 mmol，一水一盐酸组氨酸18 mmol，组氨酸180 mmol，色氨酸2 mmol，二水氯化钙0.015 mmol，甘露醇30 mmol ，2-酮戊二酸氢钾1 mmol以及注射用水，其制备过程包括：（1）配液：在充氮条件下称量处方量各组分，依次加入盐酸组氨酸、组氨酸、甘露醇、氯化钠、氯化钾、氯化镁搅拌使溶解；将药液温度冷至50～60℃，依次加入氯化钙、色氨酸，搅拌使溶解完全后，加入2-酮戊二酸氢钾，搅拌溶解；（2）吸附过滤：加入0.05%（w/v）用量活性炭，50℃吸附15min后，脱炭；过0.22μm滤膜；（3）封装灭菌：充氮、灌封；115℃湿热灭菌30分钟后，迅速冷却；样品于2~15℃条件下保存。

2.权利要求1所述的心肌脏器保护液制备方法，其特征在于：充氮气后灌封。

3.权利要求1所述的心肌脏器保护液在器官移植过程中用于保存心脏、肾脏、肝脏和胰腺器官。