CN107988149A - 一种精子活力液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种精子活力液及其制备方法,属于人类辅助生殖技术领域。所述精子活力液,是将ATP钠盐、肝素钠干粉/肝素钠盐溶液溶解于含有抗菌素、指示剂的盐溶液中配制而成。本发明所述的精子活力液中添加了ATP钠盐和肝素钠,ATP钠盐不仅可以为精子运动提供能量物质,还可以有助于精子中段线粒体产能,肝素则可以通过结合精子表面的受体激活受体偶联的信号传导系统,温和有效地提升精子线粒体的产能功能和钙离子内流,进而改善精子的活力。因而,本发明不仅可以有效地改善精子的活力,唤醒和激活精子中段线粒体的产能,提高人工授精(IUI)的成功率,而且,也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
Description
技术领域
本发明涉及一种精子活力液及其制备方法,属于人类辅助生殖技术领域。
背景技术
人类辅助生殖技术中,对于少弱精症、睾丸和附睾穿刺的精子以及冷冻后因脂膜损伤和线粒体功能受损的精子,通过增进精子的活力,可以极大地缩短精子注射(ICSI)和卵子体外操作的时间,提高受精率和可用胚胎数量,直接或者间接地提高妊娠率。然而,现有技术中临床常规使用的精子激动剂对精子DNA具有极大地损伤作用,直接影响下子代的出生健康。
肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药,为白色或类白色的粉末,有引湿性,在水中易溶。其功能包括:1、治疗各种疾病并发的播散性血管内凝血早期;2、预防动、静脉血栓和肺栓塞;3、治疗动、静脉血栓和肺栓塞,缺血性脑卒中,不稳定型心绞痛(减轻症状、预防心肌梗塞),急性心肌梗塞(防止早期再梗塞和梗塞区延展,降低病死率);4、人工心肺、腹膜透析或血液透析时作为抗凝血药物;5、作为溶血栓疗法的维持治疗;6、用于输血时预防血液凝固及血库保存鲜血等体外抗凝剂。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种各项质控达标的精子活力液,不仅可以有效地改善精子的活力,提高人工授精(IUI)的成功率,而且也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
为解决上述问题,本发明所采用的技术方案是:
一种精子活力液,其特征在于:将ATP钠盐、肝素钠干粉/肝素钠盐溶液溶解于含有抗菌素、指示剂的盐溶液中配制而成。
优选的:将ATP钠盐、肝素钠干粉分别按照5-20μg/ml、10-50USP/ml的浓度溶解于含有抗菌素、指示剂的盐溶液中配制而成。
优选的:将ATP钠盐、肝素钠盐溶液分别按照5-20μg/ml、10-50USP/ml的浓度溶解于含有抗菌素、指示剂的盐溶液中配制而成。
进一步地说:抗菌素为庆大霉素,浓度为5-11μg/ml。
再进一步说:所述指示剂为酚红,浓度9-10μg/ml。
更进一步说:所述盐溶液是以HEPES或者MOPS为缓冲剂,以钠、钾、镁、钙离子为基础,并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、白蛋白为能量物质的化合物培养溶液;其中包含:氯化钠98.11-102.00mmol/L、氯化钾4.55-4.70mmol/L、硫酸镁0.18-0.22mmol/L、氯化钙1.92-2.12mmol/L、碳酸氢钠3.90-4.10mmol/L、HEPES或者MOPS 19.99-22.00mmol/L、葡萄糖2.68-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.31-0.33mmol/L、乳酸钠21.11-21.66mmol/L、磷酸二氢钾0.36-0.39mmol/L;
所述白蛋白为重组人血清白蛋白,是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于在盐水溶液中制备而成,终浓度为5mg/ml。
所述精子活力液的制备方法,包括以下步骤:
1、称量好各种组分,备用;
2、配制盐溶液:称量好的组分中,先将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中,溶解过程中遵循先固体后液体的原则;所述超纯注射级用水经0.1-0.3μM滤膜过滤,内毒素<0.015EU/ml;然后,依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠,制得盐溶液;
3、检测步骤2所得盐溶液的渗透压和pH值,并记录最终渗透压和pH值;所述渗透压保持为250-275mOsm/Kg,所述pH值保持为7.0-7.4;
4、按照预配置的容量,将终浓度为5mg/ml的重组人血清白蛋白补充到盐溶液中;
5、将ATP钠盐以5-20μg/ml的工作浓度溶解于步骤4制得的盐溶液中,到充分溶解止;
6、肝素钠干粉或者肝素钠盐溶液按照10-50USP/ml的浓度溶解于步骤5制得的溶液中,到充分溶解止;
7、将步骤6所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后,取样测试;测试参数:
A、30-37℃条件下pH值:7.1-7.4;
B、渗透压:255-295mOsm/Kg;
C、内毒素:<0.15EU/ml;
D、一细胞鼠胚培养到96小时:≥80%的囊胚形成率;
8、将配置好的溶液在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
有益效果:本发明所述的精子活力液中添加了ATP钠盐和肝素钠,ATP钠盐不仅可以为精子运动提供能量物质,还可以有助于精子中段线粒体产能,肝素则可以通过结合精子表面的受体激活受体偶联的信号传导系统,温和有效地提升精子线粒体的产能功能和钙离子内流,进而改善精子的活力。因而,本发明不仅可以有效地改善精子的活力,唤醒和激活精子中段线粒体的产能,提高人工授精(IUI)的成功率,而且,也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
具体实施方式
下面结合具体实施实施方式对本发明做进一步说明。
本发明所述的精子活力液,是将ATP钠盐、肝素钠干粉/肝素钠盐溶液分别按照功能可行的浓度(优选浓度为ATP钠盐5-20μg/ml、肝素钠干粉/肝素钠盐溶液10-50USP/ml)溶解于含有抗菌素、指示剂的盐溶液中配制而成。所述抗菌素为庆大霉素,浓度为5-11μg/ml。所述指示剂为酚红,浓度9-10μg/ml。
所述盐溶液是以HEPES或者MOPS为缓冲剂,以钠、钾、镁、钙离子为基础,并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、白蛋白为能量物质的化合物培养溶液;其中包含:氯化钠98.11-102.00mmol/L、氯化钾4.55-4.70mmol/L、硫酸镁0.18-0.22mmol/L、氯化钙1.92-2.12mmol/L、碳酸氢钠3.90-4.10mmol/L、HEPES或者MOPS19.99-22.00mmol/L、葡萄糖2.68-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.31-0.33mmol/L、乳酸钠21.11-21.66mmol/L、磷酸二氢钾0.36-0.39mmol/L:
所述白蛋白为重组人血清白蛋白,是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于在盐水溶液中制备而成,终浓度为5mg/ml。
所述精子活力液的制备方法,包括以下步骤:
1、称量好各种组分,备用;
2、配制盐溶液:称量好的组分中,先将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中,溶解过程中遵循先固体后液体的原则;所述超纯注射级用水经0.1-0.3μM滤膜过滤,内毒素<0.015EU/ml;然后,依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠,制得盐溶液;
3、检测步骤2所得盐溶液的渗透压和pH值,并记录最终渗透压和pH值;所述渗透压保持为250-275mOsm/Kg,所述pH值保持为7.0-7.4;
4、按照预配置的容量,将终浓度为5mg/ml的重组人血清白蛋白补充到盐溶液中;
5、将ATP钠盐以5-20μg/ml的工作浓度溶解于步骤4制得的盐溶液中,到充分溶解止;
6、肝素钠干粉或者肝素钠盐溶液按照10-50USP/ml的浓度溶解于步骤5制得的溶液中,到充分溶解止;
7、将步骤6所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后,取样测试;测试参数:
A、30-37℃条件下pH值:7.1-7.4;
B、渗透压:255-295mOsm/Kg;
C、内毒素:<0.15EU/ml;
D、一细胞鼠胚培养到96小时:≥80%的囊胚形成率;
8、将配置好的溶液在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
【存储说明和稳定性】
存储:将分装好的精子活力液存放于2℃-8℃,应尽可能减少液体暴露于CO2和空气,以避免7.0或更低的pH水平。不要暴露在高于39℃的温度下。
稳定性:可以直到标签上显示的到期日期。使用无菌程序除去所需体积的产品,一旦移除,不要将任何量的产品返回原始容器;如果产品变色、浑浊或有微生物污染迹象,请勿使用。
为避免污染问题,使用无菌技术进行处理,并在完成操作后丢弃瓶子或小瓶中剩余的任何多余产品。
【具体使用方法】
1、人工授精(IUI)的正常操作程序按照标准程序进行。先制备好要做人工授精的精液后(约500微升),再将50微升的精子活力液加入到预先制备的样本中,15~30分钟平衡后,即可实施IUI。
2、对于单精子注射技术(ICSI),来自附睾穿刺(MESA)的精子、少弱精症患者的精子,ICSI程序将遵循简易制备流程。用微吸头吸取精子活力液3~5微升,加入到ICSI皿的精子培养液中,在37℃恒温环境下保存培养15~30分钟后,在倒置显微镜下非常容易找到运动的精子,然后放入PVP内,按正常ICSI程序操作即可。
3、对于睾丸穿刺的精子(TESE),TESE的精子分离程序,按标准TESE样本制备程序进行。仅须在最终的培养液中滴入5~10微升精子活力液,在37℃恒温环境平衡培养30分钟后,就会发现精子活性明显增加。制滴后在倒置显微镜下非常容易找到运动的精子,然后放入PVP内,按正常ICSI程序操作即可。
4、对于冻融的精子样本,冷冻精子准备的过程将遵循标准流程。将50微升精子活力液添加到5ml的精子洗涤液中即可。两次洗涤后,即可投入使用。
Claims (7)
1.一种精子活力液,其特征在于:将ATP钠盐、肝素钠干粉/肝素钠盐溶液溶解于含有抗菌素、指示剂的盐溶液中配制而成。
2.根据权利要求1所述的精子活力液,其特征在于:将ATP钠盐、肝素钠干粉分别按照5-20μg/ml、10-50USP/ml的浓度溶解于含有抗菌素、指示剂的盐溶液中配制而成。
3.根据权利要求2所述的精子活力液,其特征在于:将ATP钠盐、肝素钠盐溶液分别按照5-20μg/ml、10-50USP/ml的浓度溶解于含有抗菌素、指示剂的盐溶液中配制而成。
4.根据权利要求2或3所述的精子活力液,其特征在于:抗菌素为庆大霉素,浓度为5-11μg/ml。
5.根据权利要求4所述的精子活力液,其特征在于:所述指示剂为酚红,浓度9-10μg/ml。
6.根据权利要求5所述的精子活力液,其特征在于:所述盐溶液是以HEPES或者MOPS为缓冲剂,以钠、钾、镁、钙离子为基础,并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、白蛋白为能量物质的化合物培养溶液;其中包含:氯化钠98.11-102.00mmol/L、氯化钾4.55-4.70mmol/L、硫酸镁0.18-0.22mmol/L、氯化钙1.92-2.12mmol/L、碳酸氢钠3.90-4.10mmol/L、HEPES或者MOPS19.99-22.00mmol/L、葡萄糖2.68-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.31-0.33mmol/L、乳酸钠21.11-21.66mmol/L、磷酸二氢钾0.36-0.39mmol/L;
所述白蛋白为重组人血清白蛋白,是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于在盐水溶液中制备而成,终浓度为5mg/ml。
7.如权利要求6所述精子活力液的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)称量好各种组分,备用;
(2)配制盐溶液:称量好的组分中,先将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中,溶解过程中遵循先固体后液体的原则;所述超纯注射级用水经0.1-0.3μM滤膜过滤,内毒素<0.015EU/ml;然后,依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠,制得盐溶液;
(3)检测步骤(2)所得盐溶液的渗透压和pH值,并记录最终渗透压和pH值;所述渗透压保持为250-275mOsm/Kg,所述pH值保持为7.0-7.4;
(4)按照预配置的容量,将终浓度为5mg/ml的重组人血清白蛋白补充到盐溶液中;
(5)将ATP钠盐以5-20μg/ml的工作浓度溶解于步骤(4)制得的盐溶液中,到充分溶解止;
(6)肝素钠干粉或者肝素钠盐溶液按照10-50USP/ml的浓度溶解于步骤(5)制得的溶液中,到充分溶解止;
(7)将步骤(6)所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后,取样测试;测试参数:
A、30-37℃条件下pH值:7.1-7.4;
B、渗透压:255-295mOsm/Kg;
C、内毒素:<0.15EU/ml;
D、一细胞鼠胚培养到96小时:≥80%的囊胚形成率;
(8)将配置好的溶液在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
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