CN104938479A - 组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学领域，特别涉及组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法。本发明以生理盐水作为脐带保存液的基础成分，使用脐血浆作为营养成分来源，脐血浆是天然的物质，不仅提供多元的营养成分，还为维持与体内相似的微环境，可最大程度的维持脐带的活力；添加了乳糖醛酸、羟乙基淀粉等大分子物质，避免了脐带在保存过程中发生肿胀死亡。保存液可以在低温下运输和保存制剂。不仅可为离体脐带提供充足的营养物质，还能很好的维持种子细胞的活力及其原有细胞形态及生物特性。

Description

组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学领域，特别涉及组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法。

背景技术

脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。

但是，脐带在离体情况下活力会渐渐下降，这直接影响了分离的干细胞数量和质量。如何维持离体脐带间充质干细胞的活性成为了当务之急。在此之前，人们在RPMI-1640等基础培养基的基础上添加青霉素、链霉素等物质用于保存离体脐带；或者使用添加了人血白蛋白、葡萄糖等营养物质用于保存离体脐带。但是由于营养成分单一或没有适宜的缓冲体系等原因，导致脐带在长期保存或运输中出现活力低下、甚至死亡等现象。为了进一步的适应临床应用需要，开发一种营养成分多元且体系稳定的脐带保存液成为了当务之急。

目前的脐带保存液存在如下问题：

1.保存液的由基础的培养基构成，营养成分单一，且该成分不一定适合脐带在离体情况下的所需。

2.没有稳定的缓冲溶液体系，保存过程中受外界因素影响较大，脐带保存质量波动较大。

3.配置过程繁琐。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法。本发明提供的脐带保存制剂不仅可为离体脐带提供充足的营养物质，还能很好的维持种子细胞的活力及其原有细胞形态及生物特性。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种组合物，包括生理盐水、血浆、双抗和非渗透性冷冻保护剂。

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。非渗透性冷保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、乳糖醛酸或羟乙基淀粉中的一种或两者以上的混合物。大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

在本发明的一些具体实施方案中，组合物中所述非渗透性冷冻保护剂包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、乳糖醛酸或羟乙基淀粉中的一种或两者以上的混合物。

本发明提供了一种组合物，包括生理盐水、血浆、双抗、乳糖醛酸和羟乙基淀粉。

在本发明的一些具体实施方案中，组合物包括生理盐水、1x～2x青-链霉素、终浓度为50mg-100mg/mL的乳糖醛酸、终浓度为1％-5％(v/v)羟乙基淀粉、终浓度为5％(v/v)的脐血浆。

在本发明的一些具体实施方案中，组合物中所述脐血浆的制备方法为：取脐血，于2500rpm离心15min，吸取上层淡黄色血浆，4℃保存备用。

本发明还提供了所述的组合物在制备脐带保存制剂中的应用。

本发明还提供了一种脐带保存制剂，包括所述组合物。

在本发明的一些具体实施方案中，脐带保存制剂为保存液。

本发明还提供了一种所述脐带保存制剂的制备方法，取所述血浆、所述双抗、所述乳糖醛酸和所述羟乙基淀粉溶于所述生理盐水。

本发明还提供了一种脐带的保存方法，采用所述脐带保存制剂保存所述脐带。

在本发明的一些具体实施方案中，脐带的保存方法具体为取脐带与所述脐带保存制剂混合，4℃保存。

本发明通过研究发现：该保存液用于维持脐带活力的关键是提供合适的保存环境及营养供给，保证离体脐带在保存液中避免肿胀死亡。因此保存液中的成分和运输过程中各条件成为提高脐带活力至关重要的因素。在本发明以前葡萄糖、人血白蛋白常作为维持脐带养来源。本发明就是在此基础上进一步改进了保存液的缓冲体系和营养体系，同时优化运输条件，尽可能的维持脐带的活力及其生物特性。

本发明以生理盐水作为脐带保存液的基础成分，使用脐血浆作为营养成分来源，脐血浆是天然的物质，不仅提供多元的营养成分，还为维持与体内相似的微环境，可最大程度的维持脐带的活力；添加了乳糖醛酸、羟乙基淀粉等大分子物质，避免了脐带在保存过程中发生肿胀死亡。保存液中各成分组成及其比例。可以在低温下运输和保存制剂。

有益效果包括但不限于：

1.本发明所制备的保存液能很好的维持脐带活力，不会造成脐带分离提取的间充质干细胞的数量和质量。

2.保存液制备步骤简便，能在短时间内配制大量。

3.保存液成本低廉，成分稳定、安全、无任何毒副作用。

与现有技术相比，本发明选用了生理盐水作为脐带保存液的基础成分，添加脐血浆、乳糖醛酸、羟乙基淀粉三种成分，从而形成了成分稳定，营养物质多元、溶液渗透压稳定的体系。这样不仅可为离体脐带提供充足的营养物质，还能很好的维持种子细胞的活力及其原有细胞形态及生物特性。

1.保存液中选用生理盐水作为基础成分，其与人体生理渗透压一致，不会对脐带伤害。另外，保存液中脐血浆为脐带提供多元的、可直接吸收的营养成分，克服了保存液中营养成分单一的缺点，最大程度的维持了种子细胞活力。

2.低温保存制剂，一方面可避免营养成分变性，另一方面则很好的保持了脐带的生物活性。

3.保存液制备需时短，可规模化生产。

4.在长途运输保存后，脐带干细胞均未出现生物特性的改变，贴壁率高，增值速度快。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示脐带干细胞培养结果(4X)；其中，图1(A)示脐带干细胞培养3d结果；图1(B)示脐带干细胞培养7d结果；

图2示脐带干细胞的形态检测结果；

图3示脐带干细胞活力检测结果；

图4示对照组的保存液脐带保存72h后，分离的脐带干细胞的流式检测结果；

图5示本发明实施例1提供的保存液样品组脐带保存72h后，分离的间充质干细胞的流式检测结果；

图6示空白对照组(不加抗体)的保存液脐带保存后，分离的间充质干细胞的流式检测结果；

图7示对照组A提供的保存液(样品组)胎盘保存后，分离的间充质干细胞的流式检测结果；

图8示空白对照组(不加抗体)的保存液胎盘保存后，分离的间充质干细胞的流式检测结果；

图9示对照组B提供的保存液(样品组)胎盘保存24h后，分离的间充质干细胞的流式检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，1x青-链霉素(双抗)购自Gibco公司，每毫升包含10000单位青霉素(碱)和10000μg链霉素(碱)，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)和硫酸链霉素。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 保存液的制备：

在生理盐水中，添加双抗、乳糖醛酸、羟乙基淀粉、脐血浆，使得生理盐水中含有1x青-链霉素(双抗)、终浓度为100mg/mL乳糖醛酸、终浓度为1％(v/v)的羟乙基淀粉、终浓度为5％(v/v)的脐血浆混匀后置4℃保存备用。

实施例2 保存液的制备：

在生理盐水中，添加双抗、乳糖醛酸、羟乙基淀粉、脐血浆，使得生理盐水中含有2x青-链霉素(双抗)、终浓度为50mg/mL乳糖醛酸、终浓度为5％(v/v)的羟乙基淀粉、终浓度为5％(v/v)的脐血浆混匀后置4℃保存备用。

实施例3 保存液的制备：

在生理盐水中，添加双抗、乳糖醛酸、羟乙基淀粉、脐血浆，使得生理盐水中含有1x青-链霉素(双抗)、终浓度为80mg/mL乳糖醛酸、终浓度为3％(v/v)的羟乙基淀粉、终浓度为5％(v/v)的脐血浆混匀后置4℃保存备用。

实施例4 脐带保存运输：

在医院产房把刚分娩的脐带放入装有本发明实施例1制备的4℃保存液的瓶子中，保存液浸没脐带，置于4℃保存，脐带采集后12小时内进入实验程序。

实施例5 脐带间充质干细胞分离培养

A、在超净台内用镊子取出实施例4保存后的脐带，置于15cm的玻璃平皿中，用4℃PBS对脐带进行初步清洗，转移至新的15cm培养皿中，将其剪成数段，并剔除中间三根血管；

B、位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华尔通氏胶，用长柄有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中；

C、用无菌长柄手术剪，在离心管中将华尔通氏胶剪切成1mm3左右的组织匀浆块；

D、把脐带组织块转移至50mL离心管中，加入0.2mg/mL的Ⅰ型胶原酶置于恒温振荡培养箱，37℃，200r，消化60～90min(每20min取出轻轻摇匀后放回去)，至脐带组织匀浆块呈靡状即可。

E、用80目不锈钢筛网进行过滤，滤去未消化组织块。

F、滤液800g离心5min，弃上清后用培养基重悬，调整密度为1～5×10⁵cell/mL接种。

实施例6 细胞及制剂质量评价

细胞质量评价(活力与体积、贴壁数量、形态检测、表面抗原)

a.活力与体积检测：

取实施例5制得的重悬后细胞悬液1mL，调整细胞密度为5×10⁶cell/mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1充分混匀，取20uL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活率及体积检测。

b.接种48h后，取出细胞，吸弃上清后，用PBS洗两遍，用0.25％胰酶进行酶解，获取贴壁细胞，计算出贴壁细胞的数量，得出贴壁率。

c.形态检测：取处于对数生长期的脐带干细胞，置倒置显微镜下观察细胞的形态。

d.流式结果检测：

取酶解下来细胞悬液5mL，调整细胞密度为1×10⁶的细胞悬液，分别取抗人CD105、CD73、CD90、CD45、CD34及HLA-DR的单克隆抗体各2.5μL,加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL1640基础培养基重悬后重悬后上机检测。

结果：

(1)细胞的质量检测(形态、活力、表面抗原)

①细胞培养时形态，见图1(A)、图1(B)；

脐带干细胞为典型的间充质干细胞，其在体外培养时贴壁生长，长梭形；细胞边缘清晰可见，折光性强；并未见漂浮的死亡细胞。当两者融合率达80％以上时，呈漩涡状，符合间充质干细胞的生物学特征。

②细胞形态检测：见图2、图3。

图2、图3说明，脐带干细胞在原代生长至90％的融合度是，对其进行酶解消化，检测器细胞活力和细胞体积带下，细胞活率达95％，细胞直径在14-24之间，也细胞形态符合间充质干细胞的正常形态。说明本发明的能良好的维持脐带干细胞的正常生理学特征。

(2)细胞流式检测:

样品组：本发明实施例1提供的脐带保存液。

空白对照组(不加抗体)见图4(A)～图4(G)；样品组见图5(A)～图5(G)。

在图4(A)～图4(G)中设定空白对照组(不加抗体)中各抗体的门，经检测得出样品组图5(A)～图5(G)的检测结果。脐带干细胞高表达CD73、CD90、CD105三种表面抗原，表达率分别为99.6％、99.6％和99.6％；而CD34、HLA-DR和CD45三种表面抗原的表达率只有0.0％、0.6％、0.0％，仍维持低较低的表达率。从流式检测结果可知，脐带干细胞维持间充质干细胞原有的特性，并未出现分化现象。

取实施例2、实施例3制备获得的脐带保存液进行上述实验，结果与实施例1制备获得的脐带保存液的实验结果相同或相近，无显著差异(P＞0.05)。

综合上述试验结果表明：本发明提供的脐带保存液能很好的维持脐带活力，不会造成脐带分离提取的间充质干细胞的数量和质量。

实施例7 对比试验：

保存液A：100mL生理盐水中含有1x青-链霉素(双抗)。

保存液B：100mL生理盐水中含有1x青-链霉素(双抗)5％脐血浆。

保存液C：100mL生理盐水中含有1x～2x青-链霉素(双抗)、5％脐血浆、100mg/mL乳糖醛酸、1％羟乙基淀粉。

表1 对比试验结果

保存液/保存时间	12h	24h	48h
				保存液A	96.47％	90.12％	85.44％
保存液B	98.36％	94.83％	89.52％
				保存液C	98.71％	97.29％	94.38％

从表1中可知，保存液A的细胞活力随着保存时间的延长，细胞活力从96.47％下降至85.44％；保存液B的细胞活力则从98.36％下降至89.52％。从两组数据可知，脐血浆可起到一定的细胞活力维持作用。

保存液B和保存液C两组分差异在于添加了乳糖醛酸和羟乙基淀粉，从数据可知，保存液C在每个时间检测点的活力均高于保存液B，脐带在保存液C进行48h的保存后，细胞活力仅下降了4％左右，说明了乳糖醛酸和羟乙基淀粉对具有良好的细胞活力维持作用。

实施例8 对比例

对照组A：所述脐带保存液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；

对照组B：一种脐带保存液，其特征在于，在1L脐带保存液中含有：氯化钠6000-6800mg、葡萄糖1000-2000mg、人血清白蛋白10000-20000mg、氯化钾250-400mg、无水氯化钙50-300mg、头孢哌酮钠100-150mg、酚红1-10mg，余量为注射用水。

1、对照组A的流式检测结果：其中，空白对照组(不加抗体)见图6(A)～图6(G)，对照组A见图7(A)～图7(G)。

在图6(A)～图6(G)中设定空白对照组(不加抗体)中各抗体的门，经检测得出样品组图7(A)～图7(G)的检测结果。脐带干细胞表达CD73、CD90、CD105三种表面抗原，表达率分别为95.2％、72.6％和95.7％，其中CD90未能符合ISCT颁布的国际标准(高于95％)；而CD34、HLA-DR和CD45三种表面抗原的表达率分别为8.4％、4.9％、4.9％，三种抗原表达率均高于ISCT颁布的国际标准(低于2％)。从流式检测结果可知，脐带干细胞未能保持原有的干细胞原有特性，出现分化现象。

2、对照组B的流式检测结果：其中，空白对照组(不加抗体)见图8(A)～图8(G)，对照组B见图9(A)～图9(G)。

在图8(A)～图8(G)中设定空白对照组(不加抗体)中各抗体的门，经检测得出样品组图9(A)～图9(G)的检测结果。脐带干细胞高表达CD73、CD90、CD105三种表面抗原，表达率分别为94.6％、72.1％和94.2％，其中CD90未能符合ISCT颁布的国际标准(高于95％)；而CD34、HLA-DR和CD45三种表面抗原的表达率只有0.3％、0.2％、0.2％，仍维持低较低的表达率。从流式检测结果可知，脐带干细胞维持间已经出现分化现象。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括生理盐水、血浆、双抗和非渗透性冷冻保护剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述非渗透性冷冻保护剂包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、乳糖醛酸或羟乙基淀粉中的一种或两者以上的混合物。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，包括生理盐水、1x～2x青-链霉素、终浓度为50mg-100mg/mL的乳糖醛酸、终浓度为1％-5％(v/v)羟乙基淀粉、终浓度为5％(v/v)的脐血浆。

4.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，所述脐血浆的制备方法为：取脐血，于2500rpm离心15min，吸取上层淡黄色血浆，4℃保存备用。

5.根据权利要求1至4任一项所述的组合物在制备脐带保存制剂中的应用。

6.一种脐带保存制剂，其特征在于，包括如权利要求1至5任一项所述的组合物。

7.根据权利要求6所述的脐带保存制剂，其特征在于，其为保存液。

8.一种如权利要求7所述的脐带保存制剂的制备方法，其特征在于，取所述血浆、所述双抗、所述乳糖醛酸和所述羟乙基淀粉溶于所述生理盐水。

9.一种脐带的保存方法，其特征在于，采用如权利要求6或7所述的脐带保存制剂保存所述脐带。

10.根据权利要求9所述的保存方法，其特征在于，所述保存方法具体为取脐带与所述脐带保存制剂混合，4℃保存。