CN102669087A

CN102669087A - 一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法

Info

Publication number: CN102669087A
Application number: CN2012101499681A
Authority: CN
Inventors: 刘韬
Original assignee: SHENZHEN POTEN BIOLOGICAL MEDICAL INSTITUTIONS MANAGEMENT CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN POTEN BIOLOGICAL MEDICAL INSTITUTIONS MANAGEMENT CO Ltd
Priority date: 2012-05-15
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明涉及生物技术领域。本发明提供一种外周血单个核细胞冻存液，包含10-12%(V/V)渗透性冷冻保护剂，10-14%(V/V)β-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血浆，64-72%(V/V)生理盐水。本发明还提供一种外周血单个核细胞冻存方法，包括：（1）将外周血单个核细胞悬浮于细胞培养液中，获得外周血单个核细胞悬液；（2）将所述外周血单个核细胞悬液与权利要求1-5中任一项所述的外周血单个核细胞冻存液按照0.9-1.1∶1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；（3）将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。

Description

一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地讲，本发明涉及一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法。

背景技术

外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞（monocyte）、树突状细胞和其它少量细胞（造血干细胞等）。PBMC是制备细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）的种子细胞，CIK细胞因其同时表达CD3和CD56而被认为是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选方案。在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的PBMC。针对该问题目前常用的做法是，利用低温冻存技术保存外周血单个核细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。

为了将冻存过程中细胞的损伤降至最低，使细胞复苏时存活率最高，最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。因此需要采取缓慢冷冻、加入冷冻保护剂排除水分、在尽可能低的温度下保存细胞、快速复苏等方法来达到对细胞产生最低损伤的目的，其中冷冻保护剂的作用十分重要。常用的冷冻保护剂主要有甘油、二甲基亚砜(DMSO)等渗透性试剂，以及羟乙基淀粉（HES）、白蛋白和聚乙二醇（PEG）等非渗透性试剂，目前常用的是DMSO。

现有技术中，细胞冻存复苏后的存活率通常在70%-90%之间。日本学者Makino S等采用5%DMSO、6%羟乙基淀粉、4%人血清白蛋白冻存自体外周血干细胞，冻存于-80℃，获得的复苏存活率为88.4%±3.6%，为目前已知报道中最高的存活率。不过叶韵斌等学者的报道显示，用此方法冻存的细胞回输给患者，有些患者出现了不适症状，原因可能是羟乙基淀粉（HES）为大分子物质，个别患者在使用含羟乙基淀粉的药品时，可能发生过敏性反应。

因此，为提供足够量的PBMC，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明的目的是提高PBMC细胞冻存复苏后的存活率，同时避免将复苏后的PBMC细胞回输给患者时出现不良反应。

为了实现上述发明目的，本发明技术方案如下：

一种外周血单个核细胞冻存液，包含10-12%(V/V)渗透性冷冻保护剂，10-14%(V/V)β-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血浆，64-72%(V/V)生理盐水。

以及，一种外周血单个核细胞冻存方法，包括以下步骤：

（1）将外周血单个核细胞悬浮于细胞培养液中，获得外周血单个核细胞悬液；

（2）将所述外周血单个核细胞悬液与本发明的外周血单个核细胞冻存液按照0.9-1.1∶1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；

（3）将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。

本发明的PBMC冻存液使用了经美国FDA认证安全的β-葡聚糖作为冷冻保护剂，使冻存复苏后的PBMC的存活率达到91.56%左右，且使用本发明的PBMC冻存液的单个核细胞复苏后经诱导培养得到的CIK细胞中CD3⁺CD56⁺T细胞的比例与未冻存的PBMC相比十分接近，且两者的细胞生长曲线和增殖倍数没有明显差异，并且将该CIK细胞回输给患者后未引起不适症状。

附图说明

图1为使用本发明实施例1的冻存液冻存PBMC复苏后诱导得到CIK细胞与未冻存的PBMC诱导得到的CIK细胞的生长曲线图；

图2为使用本发明实施例1的冻存液冻存PBMC复苏后诱导得到CIK细胞与未冻存的PBMC诱导得到的CIK细胞中CD3⁺CD56⁺T细胞的流式检测图，其中（a）为本发明实施例1的冻存液冻存的PBMC的检测结果，（b）为未冻存的PBMC的检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种能提高外周血单个核细胞冻存复苏后存活率，同时避免将复苏后诱导培养的细胞回输给患者时出现不良反应的外周血单个核细胞冻存液。该外周血单个核细胞冻存液包含10-12%(V/V)渗透性冷冻保护剂，10-14%(V/V)β-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血浆，64-72%(V/V)生理盐水。

具体地，上述渗透性冷冻保护剂可渗透到细胞内，防止细胞在冻存的时候生成冰晶损伤细胞从而起到保护作用，本发明实施例中所述渗透性冷冻保护剂选自甘油、DMSO、乙二醇和丙二醇中的一种或几种，优选的实施例中所述渗透性冷冻保护剂为DMSO，其优选浓度为10%(V/V)。其中，V/V为体积百分比。

上述实施例中使用β-葡聚糖作为非渗透性冷冻保护剂可降低回输给患者时的不良反应。葡聚糖是一种高分子葡萄糖聚合物，存在于某些微生物生长过程中分泌的粘液中，被美国FDA已认定是一种安全的物质，是目前最佳的血浆代用品之一，β-葡聚糖是葡聚糖中最具生理活性的，广泛用于医药、食品、化妆品等行业。本发明优选实施例中所述β-葡聚糖浓度为12%。

上述生理盐水优选为注射用生理盐水，用分析纯氯化钠配制，优选浓度为68%。

上述血清或血浆中的血清可为胎牛血清或小牛血清；血浆优选为自体血浆，自体血浆为抗凝外周血分离出细胞后得到的血浆，因与PBMC细胞来自同一受试者，因此称为自体血浆，自体血浆优选浓度为10%。

本发明实施例的外周血单个核细胞冻存液使用了β-葡聚糖作为非渗透性冷冻保护剂，使冻存复苏后的PBMC的存活率达到91.56%左右，且使用本发明的PBMC冻存液的单个核细胞复苏后经诱导培养得到的CIK细胞中CD3⁺CD56⁺T细胞的比例与未冻存的PBMC相比十分接近，且两者的细胞生长曲线和增殖倍数没有明显差异，同时将该CIK细胞回输给患者后未引起不适症状，因此本发明的PBMC冻存液相对于现有技术有显著进步。

本发明还提供一种外周血单个核细胞冻存方法，所述方法包括以下步骤：

（2）将所述外周血单个核细胞悬液本发明的外周血单个核细胞冻存液按照0.9-1.1∶1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；

优选地，步骤（1）得到的PBMC细胞悬液中细胞密度为2-10×10⁷个/ml。悬浮PBMC细胞的培养液可以是本领域常用的PBMC培养液，如RPMI1640培养液。

步骤（2）中将PBMC细胞悬液与PBMC冻存液优选以1∶1的比例轻轻混合均匀，且使得分装于细胞冻存管中的细胞数量为1-5×10⁷个/支，通过调整外周血单个核细胞的密度，以达到最佳冻存效果。

优选地，步骤（3）中将程序冻存盒于-80℃冷冻的时间为23-25小时，优选时间为24小时。优选地，在程序冻存盒中装有纯异丙醇，可实现每分钟1℃的降温。其中，纯异丙醇可以是分析纯的异丙醇或是工业中的纯异丙醇。

本发明的实施例中将PBMC冻存后复苏，检测细胞存活率，诱导培养为CIK细胞，并检测所得的成熟CIK细胞中CD3⁺CD56⁺T细胞的百分比。

同时将复苏并诱导得到的CIK细胞回输给患者并观察临床反应，以此检测PBMC冻存效果。

本发明的PBMC冻存方法使用了本发明的PBMC冻存液并在冻存盒中使用了异丙醇以达到缓慢线性降温的目的，跟程序降温仪相比具有同样的缓慢降温的效果，本发明的方法节约了细胞冻存成本。

本发明实施例中涉及的细胞培养基及细胞培养方案均为本领域技术人员熟知，其中细胞培养基可从生物公司购得，细胞培养方案及相关参数可从本领域的教材或实验指南中获得。

现以具体外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法为例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

1.抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，室温700g离心20min，吸取上层血浆，56℃水浴30min；下部细胞加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到2个装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温800g离心15min，吸取白膜层细胞，为外周血单个核细胞。

上述700g离心后所得血浆于4℃静置15min，900g离心30min，取自体血浆，按如下体积百分比的组分配制PBMC冻存液：

10%DMSO+12%β-葡聚糖+10%自体血浆+68%注射用生理盐水。

2.PBMC的冻存

（1）将上述分离得到的PBMC用PBS清洗两次，之后用RPMI1640培养液重悬细胞，调整细胞密度至6×10⁷个/ml；

（2）将上述细胞悬液与PBMC冻存液按照1∶1的体积比例轻轻混合均匀，分装于细胞冻存管中，每管1ml，使细胞含量为3×10⁷个/支；

（3）将上述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，该冻存盒底部夹层内含有浓度为100%的异丙醇，然后将该程序冻存盒放入-80℃超低温冰箱中，24h后转入液氮罐中冻存。

3.PBMC的复苏及诱导培养

（1）从液氮罐中取出一管已冻存的PBMC，迅速置于37℃水浴中1min，使PBMC完全融化，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞存活率，结果见表1；

（2）将融化的细胞悬液转移到15ml离心管中，800rpm离心3min；

（3）弃上清，向离心管中加入10ml CIK培养液，吹打均匀，800rpm离心3min；

（4）弃上清，加适量CIK完全培养液（含血清和IL-2），吹打均匀，转移到预先包被处理的培养瓶中进行诱导培养；

（5）将上述培养瓶置于37℃、5%CO₂培养箱中，每隔一天取样对CIK细胞进行计数，并取未冻存PBMC进行诱导培养，两者结果进行比较，见表2和图1，诱导培养第13天收获成熟的CIK细胞。

4.诱导得到的CIK细胞的检测

用流式细胞仪检测收获的成熟CIK细胞中CD3⁺CD56⁺T细胞的百分比，并与未冻存PBMC诱导培养的结果进行比较，结果见图2。

5.CIK细胞回输结果观测

选取100名受试者回输以上所得的成熟CIK细胞，回输后观察24h，记录反应结果。

对比实施例1

1.取人外周血，分离得到外周血单个核细胞（PBMC）及自体血浆，按如下比例及组分配制PBMC冻存液：

10%DMSO+10%自体血浆+80%注射用生理盐水。

2.PBMC的冻存

实验步骤同实施例1。

3.PBMC复苏后存活率检测

从液氮罐中取出一管已冻存的PBMC，迅速置于37℃水浴中1min，使PBMC完全融化，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞存活率，结果见表1。

结果

1.实施例1中的PBMC冻存复苏后细胞存活率检测结果如表1所示。

表1采用不同冻存液冻存的PBMC复苏后的细胞存活率

由表1可见，实施例1中PBMC冻存并复苏后细胞存活率高于对比实施例1中的细胞存活率，也高于目前已知的使用现有技术的冻存液冻存PBMC并复苏后细胞存活率。

2.实施例1的冻存组和对比实施例1的未冻存组的PBMC诱导培养得到的CIK细胞计数结果如表2和图1所示。

表2冻存组与未冻存组的PBMC诱导得到的CIK计数结果

由表2和图1可知，实施例1中使用本发明的冻存液冻存并复苏后PBMC经诱导培养得到的CIK细胞的数量相对于未冻存的情况略有下降，但差别不显著。

3.流式细胞仪检测冻存组（实施例1）和未冻存组（对比实施例1）的PBMC得到的成熟CIK细胞中CD3⁺CD56⁺T细胞百分比的结果如图2所示，两者相比较没有显著差异。

4.CIK细胞回输结果

在实施例1的100名受试者中有6例出现发热反应（体温38.5℃），经物理降温后24h内自行缓解，这属于CIK回输的正常临床反应。因此可以认为本发明实施例中得到的CIK细胞回输给受试者后基本没有不适症状。

实施例2

1.抽取健康志愿者外周血50ml，分离外周血单个核细胞，步骤同实施例1，按如下体积百分比的组分配制PBMC冻存液：

11%DMSO+14%β-葡聚糖+9%胎牛血清+66%注射用生理盐水。

2.PBMC的冻存

（1）将上述分离得到的PBMC用PBS清洗两次，之后用RPMI1640培养液重悬细胞，调整细胞密度至2×10⁷个/ml；

（2）将上述细胞悬液与PBMC冻存液按照1∶1的体积比例轻轻混合均匀，分装于细胞冻存管中，每管1ml，使细胞含量为1×10⁷个/支；

3.PBMC的复苏及诱导培养

（1）从液氮罐中取出一管已冻存的PBMC，迅速置于37℃水浴中1min，使PBMC完全融化，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞存活率，存活率为85.45±5.41%；

（2）将融化的细胞悬液转移到15ml离心管中，800rpm离心3min；

（5）将上述培养瓶置于37℃、5%CO₂培养箱中，至第13天取样对CIK细胞进行计数，得到的CIK细胞的数量约为47.53×10⁸。

4.诱导得到的CIK细胞的检测

用流式细胞仪检测收获的成熟CIK细胞中CD3⁺CD56⁺T细胞的百分比，所得比值为24.31%。

5.CIK细胞回输结果观测

选取100名受试者回输以上所得的成熟CIK细胞，回输后观察24h，未出现明显不良反应。

实施例3

12%DMSO+14%β-葡聚糖+8%小牛血清+66%注射用生理盐水。

2.PBMC的冻存

（1）将上述分离得到的PBMC用PBS清洗两次，之后用RPMI1640培养液重悬细胞，调整细胞密度至10×10⁷个/ml；

（2）将上述细胞悬液与PBMC冻存液按照1∶1的体积比例轻轻混合均匀，分装于细胞冻存管中，每管1ml，使细胞含量为5×10⁷个/支；

3.PBMC的复苏及诱导培养

（1）从液氮罐中取出一管已冻存的PBMC，迅速置于37℃水浴中1min，使PBMC完全融化，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞存活率，存活率为88.45±6.34%；

（2）将融化的细胞悬液转移到15ml离心管中，800rpm离心3min；

（5）将上述培养瓶置于37℃、5%CO₂培养箱中，至第13天取样对CIK细胞进行计数，得到的CIK细胞的数量约为47.13×10⁸。

4.诱导得到的CIK细胞的检测

用流式细胞仪检测收获的成熟CIK细胞中CD3⁺CD56⁺T细胞的百分比，所得比值为26.10%。。

5.CIK细胞回输结果观测

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种外周血单个核细胞冻存液，包含体积百分比为10-12%的渗透性冷冻保护剂，10-14%的β-葡聚糖，8-10%的血清或血浆，64-72%的生理盐水。

2.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞冻存液，其特征在于，所述渗透性冷冻保护剂选自甘油、二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞冻存液，其特征在于，所述生理盐水为注射用生理盐水。

4.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞冻存液，其特征在于，所述血清为胎牛血清或小牛血清。

5.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞冻存液，其特征在于，所述血浆为自体血浆。

6.一种外周血单个核细胞冻存方法，包括以下步骤：

（2）将所述外周血单个核细胞悬液与权利要求1-5中任一项所述的外周血单个核细胞冻存液按照0.9-1.1∶1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；

7.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞冻存方法，其特征在于，所述步骤（1）得到的外周血单个核细胞悬液中细胞密度为2-10×10⁷个/ml。

8.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞冻存方法，其特征在于，所述步骤（2）中分装于细胞冻存管中的细胞数量为1-5×10⁷个/支。

9.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞冻存方法，其特征在于，所述步骤（3）中的程序冻存盒内装有纯异丙醇。

10.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞冻存方法，其特征在于，所述步骤(3)中将程序冻存盒于-80℃冷冻时间为23-25小时。