CN104082277A - 一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂及保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂，由以下组分组成：培养基43份~53份；自体血浆30份~40份；二甲基亚砜12份~17份；人血白蛋白5%~7%；海藻糖0.17molL/~0.23mol/L。本发明公开的保存方法为，采集新鲜抗凝血液，使用人血白蛋白将外周核细胞配置成细胞悬液，然后加入等体积的冻存保护剂，混合均匀后于-90℃~-70℃的条件下保存10h~20h，然后转入液氮中保存。本发明的公开的冻存保护剂和保存方法，可以使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，缩短CIK细胞诱导扩增的周期。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞保存的技术领域，具体涉及到一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂及保存方法。
背景技术
人外周血单个核细胞指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等细胞。人外周血单个核细胞是制备细胞因子诱导的CIK细胞的种子细胞，也是诱导生成特定淋巴细胞的种子细胞。在实际临床使用中，通常会在患者健康时提取人外周血单个核细胞进行冻存，在需要时再对其进行诱导扩增，因此冻存前后人外周血单个核细胞的质量和数量直接关系到诱导CIK细胞的周期和细胞质量，这就要求在人外周血单个核细胞冻存的过程中，将细胞的损伤降到最低；使细胞在复苏后有较高的活率；复苏后细胞形态规则，扩增周期短。
现有的人外周血单个核细胞冻存技术主要采用血清、渗透性冷冻保护剂和培养基配制冻存液对细胞进行冻存；或者在冻存保护液中加入羟乙基淀粉，采用这种方法冻存的细胞在回输过程中可能导致过敏性反应，并且在复苏之后细胞的虽然存活率较高但细胞活性较低，主要表现为不规则形态的细胞较多，并且在随后诱导培养杀伤细胞过程中，扩增周期较长。
因此要能够满足实际的需要，在人外周血单个核细胞冻存复苏之后细胞不仅要保证有较高的活率还要有较强的细胞活性，还应尽量缩短随后的CIK细胞诱导扩增周期。
为了解决现有技术中的上述不足，本发明提出了一种新的解决方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂，以及使用这种冻存保护剂保存人外周血单个核细胞的方法。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂，由以下组分组成：培养基43份～53份；自体血浆30份～40份；二甲基亚砜12份～17份；人血白蛋白5％～7％；海藻糖0.17molL/～0.23mol/L。
此外，本发明还公开了人外周单个核细胞的保存方法，包括以下步骤：
A、采集新鲜的抗凝人外周血进行离心处理，分别提取血浆和外周血单个核细胞；取血浆配置人血白蛋白，外周血单个核细胞采用磷酸盐缓冲液清洗数次；使用人血白蛋白将清洗后的外周血单个核细胞制成细胞悬液；
B、配置冻存保护剂，取培养基43份～53份；自体血浆30份～40份；二甲基亚砜12份～17份混合均匀，然后加入人血白蛋白和海藻糖，人血白蛋白的终含量质量百分数为5％～7％，海藻糖的终含量为0.17molL/～0.23mol/L；
C、取外周血单个核细胞的细胞悬液，加入等体积的冻存保护剂，混合均匀后于-90℃～-70℃的条件下保存10h～24h，然后转入液氮中保存。
综上所述，本发明具有以下优点：
本发明的公开的冻存保护剂和保存方法，可以使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，缩短CIK细胞诱导扩增的周期。
具体实施方式
以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。
采集新鲜的EDTA抗凝人外周血加入淋巴分离管中进行离心处理，分别提取上层的血浆和中层的外周血单个核细胞。取血浆配置人血白蛋白，外周血单个核细胞采用磷酸盐缓冲液清洗数次；使用人血白蛋白将清洗后的外周血单个核细胞制成细胞悬液，采用台盼蓝计数，调整细胞悬液的细胞浓度为6.0×107个/ml。
在细胞悬液中加入冻存保护剂，混合均匀后在低温处保存一段时间，然后转入液氮中保存。在实施过程中，可以将细胞悬液分成多份，每份加入的保护剂成分和剂量可以不相同，同时可以让每份的保存条件保持一定差别，对照验证保存过程和条件对保存效果的影响。冻存保护剂的组分、加入比例以及保存条件如表1。
表1：实施例1～7的具体实施方案
将对照组和实施例1～实施例7的细胞保存液在其对应的保存条件下保存一个月；将冻存的细胞在37℃水温下复苏，待完全熔化后，取少量悬液使用台盼蓝染色计数法计算复苏率和细胞活率，结果如表2。
表2：八个实施例中的细胞复苏率和细胞活率
| 实施组 | 细胞复苏率 | 细胞活率 |
| 对照组 | 82±4 | 88.86±4.68 |
| 实施例1 | 91±4 | 92.32±2.88 |
| 实施例2 | 88±3 | 93.55±5.25 |
| 实施例3 | 92±5 | 90.22±3.12 |
| 实施例4 | 83±5 | 76.56±5.42 |
| 实施例5 | 87±6 | 86.48±4.16 |
| 实施例6 | 86±5 | 84.78±3.22 |
| 实施例7 | 88±5 | 85.66±4.34 |
同时将8个实施组中的剩余细胞悬液中加入磷酸也缓冲液离心清洗，弃其上层清液，加入细胞因子诱导培养CIK细胞，每天取少量细胞悬液观察细胞形态、计算复苏率和细胞活率；结果如表3。
表3：八个实施例中的细胞诱导培养CIK细胞的生长情况
结果分析：
从表1和表2的实验结果可以得知，实施例1～实施例7中的保护剂和保存方法相较于对照组，其细胞复苏率和细胞活率明显提高；同时实验组和对照组的细胞进行诱导培养CIK细胞过程中，在相同的培养时间，实施例1～实施例7培养的细胞数量更多，说明实验组的诱导培养周期明显短于对照组，实验组具有更好的效果。
同时，从实施例1～实施例7的数据中可以得知，海藻糖对保存效果具有较大影响。海藻糖的浓度为0.05mol/L、0.5mol/L和1mol/L时的冻存效果明显较差，海藻糖浓度为0.17mol/L～0.23mol/L时的冻存效果明显较好。
实施例4中的冻存保护剂未加入海藻糖，其冻存效果远远低于实施例1、实施例2和实施例3的冻存效果，说明海藻糖的对冻干保存效果具有较大的影响。
Claims (5)
1.一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂，由以下组分组成：
培养基43份～53份；自体血浆30份～40份；二甲基亚砜12份～17份；
人血白蛋白5％～7％；海藻糖0.17molL/～0.23mol/L。
2.如权利要求1所述的保护剂，其特征在于：所述组分的组成为：
培养基50份；自体血浆35份；二甲基亚砜15份；人血白蛋白5％；海藻糖0.2mol/L。
3.一种人外周单个核细胞的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、采集新鲜的抗凝人外周血进行离心处理，分别提取血浆和外周血单个核细胞；取血浆配置人血白蛋白，外周血单个核细胞采用磷酸盐缓冲液清洗数次；使用人血白蛋白将清洗后的外周血单个核细胞制成细胞悬液；
B、配置冻存保护剂，取培养基43份～53份；自体血浆30份～40份；二甲基亚砜12份～17份混合均匀，然后加入人血白蛋白和海藻糖，人血白蛋白的终含量为5％～7％，海藻糖的终含量为0.17molL/～0.23mol/L；
C、取外周血单个核细胞的细胞悬液，加入等体积的冻存保护剂，混合均匀后于-90℃～-70℃的条件下保存10h～24h，然后转入液氮中保存。
4.如权利要求3所述的保存方法，其特征在于：所述冻存保护剂的配置为：取培养基50份；自体血浆35份；二甲基亚砜15份混合均匀，然后加入人血白蛋白和海藻糖，人血白蛋白的终含量为5％，海藻糖的终含量为0.2mol/L。
5.如权利要求3所述的保存方法，其特征在于：所述细胞悬液的细胞密度为6.0×107个/ml。
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