CN106942200A - 一种冻存保护液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种冻存保护液及其应用，所述冻存保护液为在基础培养基加入胎牛血清、人血清白蛋白、二甲亚砜、乙二醇、甲酰胺和海藻糖。本发明的冻存保护液可以进行玻璃化冻存优势：细胞复苏率达到90%以上，存活率达到85%以上，相比普通冻存方法，其复苏率和存活率都明显增加，大大提高了冻存效果。

Description

一种冻存保护液及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冻存保护液，特别用于玻璃化冻存免疫细胞和脐血的冻存保护液及其方法和应用。
背景技术
传统的细胞低温保存方法有连续慢速降温法、程序性降温法和梯度降温法等，其主要的区别在于细胞的降温速率及各个降温阶段停留的时间不同，所采用的冷冻保护剂成分及浓度也有区别，文献报道在这些方法中目前低温保存细胞存活率最高的为程序性降温法，人们采用类似的降温技术低温保存细胞已取得了一定的进展。但是，传统的低温保存方法有很多局限性，如无法避免冷冻过程中细胞内冰晶的形成，且操作过程繁琐，需要昂贵的程序降温仪。
玻璃化冻存法是近年来发展起来的一项新的冷冻技术，玻璃化冷冻技术是利用体积微小的冷冻承载工具，在极快速降温过程中，使高浓度的冷冻保护液由液态转变为黏度很高的类似玻璃样的固态，并以这种状态在低温下长期保存。其超快的降温速率可以避免细胞内冰晶的形成，极大的降低了冷冻过程中的细胞损伤。玻璃化冻存法可以保持原有细胞的活性和完整性，并能降低其抗原性，其冷冻保护剂的组分及配方已可用于保存人体的组织和器官，到目前为止，已经成功保存了人的精子、卵母细胞、胚胎、红细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、胰岛等。
发明内容
本发明提供一种玻璃化冻存免疫细胞和脐血的冻存保护液及相应的冻存方法，采用本发明的冻存保护液具有良好的玻璃化冻存效果；采用此法冻存的细胞，在复苏后存活率相比于传统冻存方法有显著增加；而且细胞复苏后有更高的活细胞比率。
本发明的目的之一在于提供一种存活率更高的玻璃化冻存免疫细胞和脐血的冻存保护液。
本发明的目的之二在于提供一种玻璃化冻存免疫细胞和脐血的方法和应用。
实现本发明第一个目的的技术方案是：一种玻璃化冻存免疫细胞和脐血的冻存保护液，冻存保护液是在基础培养基中加入胎牛血清、人血清白蛋白、二甲亚砜、乙二醇、甲酰胺和海藻糖；各组分的用量如下（v/v为体积比）：
二甲亚砜 2.5～3.5mol/L
乙二醇 2.5～3.5mol/L
甲酰胺 2.0～3.0mol/L
海藻糖 0.5～1.0mol/L
胎牛血清 15～25%（v/v）
人血清白蛋白 0.2%-3%。
各组分的优化用量如下：
二甲亚砜 3.2 mol/L
乙二醇 3.2 mol/L
甲酰胺 2.5 mol/L
海藻糖 0.5 mol/L
胎牛血清 20%（v/v）
人血清白蛋白 1% 。
所述基础培养基为RPMI 1640 培养液或者其他可替代的培养基。
实现本发明另一目的的技术方案是：一种玻璃化冻存免疫细胞和脐血的冻存保护液用来冻存细胞的方法，包括以下步骤：
①制备冻存保护液；
②制备细胞；
③用步骤①制备的冻存保护液悬浮细胞并注入冻存麦管；
④直接放入液氮中进行玻璃化冻存。
步骤①中制备冻存保护液的方法如下：在基础培养基RPMI 1640 培养液中依次加入胎牛血清、人血清白蛋白、海藻糖、乙二醇、甲酰胺，过滤除菌，加入二甲亚砜，放入低温保存，优选为4℃保存。
各组分用量为：
二甲亚砜 2.5～3.5mol/L
乙二醇 2.5～3.5mol/L
甲酰胺 2.0～3.0mol/L
海藻糖 0.5～1.0mol/L
胎牛血清 15～25%（v/v）
人血清白蛋白 0.2%-3%。
各组分的优化用量如下：
二甲亚砜 3.2 mol/L
乙二醇 3.2 mol/L
甲酰胺 2.5 mol/L
海藻糖 0.5 mol/L
胎牛血清 20%（v/v）
人血清白蛋白 1% 。
步骤②中制备细胞，分为免疫细胞和脐血两种，分别来源于人的外周静脉血和脐血，通过密度梯度离心去除红细胞，获得白膜层细胞，洗涤并用无血清培养液重悬，收集细胞。
步骤③中将用步骤②制备的细胞进行离心，用步骤①制备的冻存保护液悬浮细胞并调整密度至2～10×106/ml，注入冻存麦管，并密封。
步骤③中注入细胞的冻存麦管进行编号，按照步骤④迅速放入液氮罐中进行玻璃化冷冻。
本发明所述的制备的冻存保护液也可用于各种来源的其他免疫细胞和脐血的玻璃化冻存。
本发明的积极效果是：细胞复苏率达到90%以上，存活率达到85%以上，较常规冻存细胞相比，其复苏率和存活率都明显增加，大大改善了冻存效果。运用本发明的冻存保护液，可进行免疫细胞的冻存，亦可用于其他细胞的冻存，同时还具有制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产等优势。本发明还提供了一种新的冻存体系。
具体实施方式 （实施例1）
本实施例的冻存保护液组分及用量如下：
制备冻存保护液的方法如下：在基础培养基RPMI 1640 培养液中依次加入胎牛血清、人血清白蛋白、海藻糖、乙二醇、甲酰胺，过滤除菌，加入二甲亚砜，放入4℃保存。各组分的优化用量如下：
二甲亚砜 3.2 mol/L
乙二醇 3.2 mol/L
甲酰胺 2.5 mol/L
海藻糖 0.5 mol/L
胎牛血清 20%（v/v）
人血清白蛋白 1% 。
（应用例1）
用实施例1制备的冻存保护液冻存免疫细胞。
包括以下步骤：
⑴.制备免疫细胞；
⑵.用步骤1制备的冻存保护液悬浮免疫细胞并注入冻存麦管；
⑶.直接放入液氮中进行玻璃化冻存。
步骤⑴中采集人的外周静脉血，密度梯度离心获得单个核细胞，洗涤并用无血清培养液重悬，调整细胞密度到1×106/ml，步骤⑵中将用步骤⑴制备的免疫细胞进行离心，用制备的冻存保护液悬浮免疫细胞并调整密度至5×106/ml，注入冻存麦管，并密封。
步骤⑵中注入免疫细胞的冻存麦管进行编号，按照步骤⑶迅速放入液氮罐中进行玻璃化冷冻。
3个月后放入37℃水浴复苏，细胞计数仪检测细胞复苏率，台盼蓝染色检测存活率，结果如表1：
表1：玻璃化冻存的外周血来源免疫细胞复苏结果(n=3)
玻璃化冻存前后 复苏率% 存活率%
冻存前 --- 96.75±2.93
冻存后 92.86±5.32 88.34±7.14
（应用例2）
用实施例1制备的冻存保护液冻存脐血。
包括以下步骤：
⑴.制备脐血细胞；
⑵.用步骤1制备的冻存保护液悬浮脐血细胞并注入冻存麦管；
⑶.直接放入液氮中进行玻璃化冻存。
步骤⑴中采集脐血，密度梯度离心去除红细胞，获得白膜层细胞，洗涤并用无血清培养液重悬，调整细胞密度到1×106/ml，步骤⑵中将用步骤⑴培养制备的脐血细胞进行离心，用制备的冻存保护液悬浮脐血细胞并调整密度至5×106/ml，注入冻存麦管，并密封。
步骤⑵中注入脐血细胞的冻存麦管进行编号，按照步骤⑶迅速放入液氮罐中进行玻璃化冷冻。
3个月后放入37℃水浴复苏，细胞计数仪检测细胞复苏率，台盼蓝染色检测存活率，结果如表2：
表2：玻璃化冻存的脐血细胞复苏结果(n=3)
玻璃化冻存前后 复苏率% 存活率%
冻存前 --- 94.34±5.73
冻存后 94.54±6.71 88.65±4.52
本发明的冻存保护液可以进行玻璃化冻存优势：细胞复苏率达到90%以上，存活率达到85%以上，相比普通冻存方法，其复苏率和存活率都明显增加，大大提高了冻存效果。运用本发明的冻存保护液，可进行各种免疫细胞和脐血的冻存，亦可用于其他细胞的冻存，同时还具有制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产等优势。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种冻存保护液，其特征在于：在基础培养基加入胎牛血清、人血清白蛋白、二甲亚砜、乙二醇、甲酰胺和海藻糖；各组分的用量为：
二甲亚砜 2.5～3.5mol/L
乙二醇 2.5～3.5mol/L
甲酰胺 2.0～3.0mol/L
海藻糖 0.5～1.0mol/L
胎牛血清 15～25%（v/v）
人血清白蛋白 0.2%-3%。
2.根据权利要求1所述的冻存保护液，其特征在于：各组分的用量为：
二甲亚砜 3.2 mol/L
乙二醇 3.2 mol/L
甲酰胺 2.5 mol/L
海藻糖 0.5 mol/L
胎牛血清 20%（v/v）
人血清白蛋白 1% 。
3.如权利要求1或者2所述的冻存保护液，其特征是：所述基础培养基为RPMI 1640 培养液。
4.一种冻存免疫细胞和脐血的方法，其特征在于：包括步骤：
A）制备冻存保护液；
B）制备细胞；
C）用步骤A）制备的冻存保护液悬浮细胞并注入冻存管；
D）直接放入液氮中进行玻璃化冻存。
5.根据权利要求4所述的冻存免疫细胞和脐血的方法，其特征在于：步骤A）中制备培养液的方法为：在基础培养基RPMI 1640 培养液中依次加入胎牛血清、人血清白蛋白、海藻糖、乙二醇、甲酰胺，过滤除菌，加入二甲亚砜，放入低温保存；各组分的用量为：
二甲亚砜 2.5～3.5mol/L
乙二醇 2.5～3.5mol/L
甲酰胺 2.0～3.0mol/L
海藻糖 0.5～1.0mol/L
胎牛血清 15～25%（v/v）
人血清白蛋白 0.2%-3%。
6.根据权利要求5所述的冻存免疫细胞和脐血的方法，其特征在于：各组分的优化用量为：
二甲亚砜 3.2 mol/L
乙二醇 3.2 mol/L
甲酰胺 2.5 mol/L
海藻糖 0.5 mol/L
胎牛血清 20%（v/v）
人血清白蛋白 1% 。
7.根据权利要求4所述的冻存免疫细胞和脐血的方法，其特征在于：步骤B）中制备细胞，为免疫细胞和脐血细胞两种，分别来源于人的外周静脉血和脐血，通过密度梯度离心去除红细胞，获得白膜层细胞，洗涤并用无血清培养液重悬，收集细胞。
8.根据权利要求4所述的冻存免疫细胞和脐血的方法，其特征在于：步骤C）中将用步骤B）制备的细胞进行离心，用步骤A）制备的冻存保护液悬浮细胞并调整密度至0.5～10×106/ml，注入冻存管，并密封；对其进行编号，迅速放入液氮罐中进行玻璃化冷冻。
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