CN114762497B - 细胞冻存液及细胞冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种细胞冻存液和使用该细胞冻存液的冻存方法。该细胞冻存液包括：二甲基亚砜，血浆，枸橼酸枸橼酸钠，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，葡萄糖以及腺嘌呤。该细胞冻存液配方简单、原料便宜、操作省力，能够有效保护人外周血单个核细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高人单个核细胞的复苏成活率达到80％，且复苏进行NK细胞诱导增殖后，细胞增殖数量大，NK细胞分化比例高，保证了人单个核细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及细胞冻存液及细胞冻存方法。
背景技术
人外周血单个核细胞(PBMC)是血液白细胞中具有单个核的一类细胞，以淋巴细胞为主，同时包括少数单核细胞和浆细胞等。这些细胞在损伤、炎症和感染等应急状态下，扮演着清除入侵者保卫机体的角色；在日常状态下，扮演着及时清除体内衰老和突变的细胞，维持体内细胞更新与清除平衡的角色。提升这些细胞的功能，可以提升机体免疫系统功能和状态，因此人外周血单个核细胞在临床上应用极为广泛。
人外周血单个核细胞冻存是保证免疫细胞回输成功的关键技术之一，所以冻存的方式尤为重要。目前，人外周血单个核细胞冻存为-196℃液氮深低温保存，一般要求冻存30年左右。因此探索一种操作简便、快速、成本低廉及保存时间长的人外周血单个核细胞冻存方法对于临床外周血单个核细胞的储存、应用具有重要意义，其中冻存剂的作用尤为重要。目前，除商品化无血清冻存剂之外，应用于液氮深低温保存的人外周血单个核细胞保存剂有二甲基亚砜、RPMI1640培养基、灭活的胎牛血清等，不同的保护剂的配方及使用方法差异较大，对人外周血单个核细胞的保存效果与保存时间也有差异，并且面临着临床使用异源性风险等因素，人外周血单个核细胞安全难以保证。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一种人外周血单个核细胞冻存液和使用该冻存液的冻存方法。该冻存液配方简单、原料便宜、操作省力，能够有效保护人外周血单个核细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高人单个核细胞的复苏成活率达到80％，且复苏进行NK细胞诱导增殖后，细胞增殖数量大，NK细胞分化比例高，保证了人单个核细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种细胞冻存方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：
提供待冻存细胞在细胞冻存液中的悬浮液；和
冻存所述悬浮液，
其中，所述细胞冻存液包括二甲基亚砜，血浆，枸橼酸，枸橼酸钠，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，葡萄糖以及腺嘌呤。
根据本发明实施方案的细胞冻存方法，对细胞的损伤小，可以提高冻存细胞的复苏成活率和复苏后细胞的诱导增殖倍数。
根据本发明的实施方案，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液具有一个或多个以下特征：包括体积分数为5％～15％的二甲基亚砜，包括体积分数为50％～90％的血浆，包括质量体积分数为0.05％～0.09％的枸橼酸，包括质量体积分数为0.40％～0.70％枸橼酸钠，包括质量体积分数为0.03％～0.06％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，包括质量体积分数为0.50％～1.0％的葡萄糖，和/或包括质量体积分数为0.005％～0.01％的腺嘌呤。
根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液包括体积分数为65％～75％的血浆。如约70％的血浆。
根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液进一步包括葡萄糖酸钙。
根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液进一步包括质量体积分数为0.01～0.8％的葡萄糖酸钙，优选质量体积分数为0.4％的葡萄糖酸钙。
根据本发明的实施方案，所述冻存所述悬浮液包括：
将所述悬浮液进行低温静置处理，所述低温静置处理是在温度为-78℃～-82℃的条件下进行1～14天；和
将低温静置处理后的所述悬浮液进行速冻处理，所述速冻处理是在液氮中进行的。
发明人令人惊讶地发现，将低温静置处理时间控制在14天内，有利于维持细胞复苏后的高细胞活率。
根据本发明的实施方案，所述待冻存细胞是人外周血单个核细胞。
根据本发明的实施方案，所述待冻存细胞是通过如下方式获得的：
将人外周血与试剂进行混合处理，所述试剂包括质量体积分数为0.2％～0.5％的枸橼酸，质量体积分数为2％-4％枸橼酸钠，质量体积分数为0.1％-0.3％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数为2.5％-5％的葡萄糖以及质量体积分数为0.02％-0.05％的腺嘌呤，其中所述人外周血与所述试剂的体积比为200：(25～30)；
将混合处理产物进行密度梯度离心处理，以便获得中间细胞层；
将所述中间细胞层在新的离心管中进行重悬和离心处理，以便获得所述待冻存细胞。
根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液是通过如下方式获得的：
将人外周血与试剂进行混合处理，所述试剂包括质量体积分数为0.2％～0.5％的枸橼酸，质量体积分数为2％-4％枸橼酸钠，质量体积分数为0.1％-0.3％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数为2.5％-5％的葡萄糖以及质量体积分数为0.02％-0.05％的腺嘌呤，其中所述人外周血与所述试剂的体积比为200：(25～30)；
将混合处理产物进行密度梯度离心处理，以便获得上清；
将所述上清与预定量的DMSO进行混合，以便获得所述细胞冻存液。
根据本发明的实施方案，上述获得待冻存细胞和冻存液的过程可以合并处理，所述抗凝血进行聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理后，上清与预定量的DMSO进行混合，以便获得所述细胞冻存液，而中间细胞层可在新的离心管中进行重悬和离心处理，以便获得所述待冻存细胞。
相应地，根据本发明的实施方案，所述提供待冻存细胞在细胞冻存液中的悬浮液包括：
将人外周血与试剂进行混合处理，所述试剂包括质量体积分数为0.2％～0.5％的枸橼酸，质量体积分数为2％-4％枸橼酸钠，质量体积分数为0.1％-0.3％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数为2.5％-5％的葡萄糖以及质量体积分数为0.02％-0.05％的腺嘌呤，其中所述人外周血与所述试剂的体积比为200：(25～30)，优选地体积比为50∶7；
将混合处理产物进行密度梯度离心处理，以便获得中间细胞层和上清；
将所述中间细胞层在新的离心管中进行重悬和离心处理，以便获得所述待冻存细胞；
将所述上清与预定量的DMSO进行混合，以便获得所述冻存液；
将所述待冻存细胞在所述冻存液中重悬，以便获得所述悬浮液。
根据本发明的实施方案，所述人外周血与试剂I的体积比为50∶7。进而进一步降低血液的凝固风险。
根据本发明的实施方案，所述密度梯度离心处理包括聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心。在一些实施方案中，所述抗凝血与聚蔗糖－泛影葡胺的体积比为30：(15～20)，优选2：1。
根据本发明的实施方案，将所述人外周血与试剂进行混合处理后的8小时内进行所述聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理。发明人令人惊讶地发现，人外周血与试剂进行混合处理后的8小时内进行密度梯度离心，有利于维持外周血单个核细胞的复苏后的NK细胞的高增殖倍数。
根据本发明的实施方案，进一步包括将所述上清与预定量的葡萄糖酸钙进行混合处理；任选地，所述葡萄糖酸钙的质量体积分数为0.01～0.8％，优选为0.4％。
根据本发明的实施方案，所述聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理后，所获得的上清作为细胞冻存基液，与DMSO进行混合，获得冻存液，将所述上清与预定量的葡萄糖酸钙进行混合，可进一步提高冻存细胞的复苏成活率。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种细胞冻存液。根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液包括：二甲基亚砜，血浆，枸橼酸，枸橼酸钠，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，葡萄糖以及腺嘌呤。
根据本发明实施方案的细胞冻存液，配方简单、原料便宜、操作省力，能够有效保护人外周血单个核细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高人单个核细胞的复苏成活率，且复苏进行NK细胞诱导增殖后，细胞增殖数量大，NK细胞分化比例高，保证了人单个核细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液具有一个或多个以下特征：包括体积分数为5％～15％的二甲基亚砜，包括体积分数为50％～90％的血浆，包括质量体积分数为0.05％～0.09％的枸橼酸，包括质量体积分数为0.40％～0.70％枸橼酸钠，包括质量体积分数为0.03％～0.06％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，包括质量体积分数为0.50％～1.0％的葡萄糖，和/或包括质量体积分数为0.005％～0.01％的腺嘌呤。
根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液包括体积分数为65％～75％的血浆。如约70％的血浆。
根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液进一步包括葡萄糖酸钙。
根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液进一步包括质量体积分数为0.01～0.8％的葡萄糖酸钙，优选，质量分数为0.4％的葡萄糖酸钙。进而进一步提高冻存细胞的复苏成活率。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种组合物，包括根据本发明第二方面所述的细胞冻存液以及在根据本发明的第二方面所述的细胞冻存液中冻存的细胞。
根据本发明的实施方案，所述细胞与所述冻存液中的血浆来源于同一机体。
根据本发明的实施方案，所述细胞为人外周血单个核细胞。根据本发明实施方案的细胞冻存液特别适用于人外周血单个核细胞的冻存。
附图说明
图1是根据本发明实施例的人外周血单个核细胞冻存复苏后，NK细胞的诱导分化生成的流式细胞检测结果；
图2是根据本发明实施例的人外周血与试剂I混合后放置的时间对外周血中PBMC影响；
图3是根据本发明实施例的待冻存细胞重悬液的低温静置处理时间对细胞的影响。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语具有其与如本领域技术人员通常理解的相同的含义。
本文所用的术语
需要说明的是，本申请所述的“质量体积分数”是指每100mL的液体体积中所含有的物质的克数，即是通过物质的克数除以物质所在液体的体积即得。
需要说明的是，本申请所述的“细胞冻存基液”是指可以配合其他物质成分作为细胞冻存液的溶液，例如本申请所描述的“细胞冻存基液”即可在此基础上，配合预定量的DMSO和/或葡萄糖酸钙，获得细胞冻存液，用于人外周血单个核细胞的冻存。
细胞冻存基液及其制备方法
在本发明的一个方面，本发明提出了一种细胞冻存基液。根据本发明的实施方案，所述细胞冻存基液包括：体积分数(v/v)为50％～90％的血浆，质量体积分数(w/v，g/mL)为0.05％～0.09％的枸橼酸，质量体积分数(w/v，g/mL)为0.40％～0.70％枸橼酸钠，质量体积分数(w/v，g/mL)为0.03％～0.06％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数(w/v，g/mL)为0.50％～1.0％的葡萄糖以及质量体积分数(w/v，g/mL)为0.005％～0.01％的腺嘌呤。根据本发明实施方案的细胞冻存基液配合预定量的二甲基亚砜(DMSO)适于对细胞，尤其是外周血单个核细胞的冻存，外周血单个核细胞的复苏成活率高，复苏后NK细胞增殖数量大，NK细胞分化比例高。具体地，根据本发明实施方案的细胞冻存基液中的枸橼酸根离子可与血中钙离子形成难解离的可溶性络合物枸橼酸钙，抑制凝血过程，便于后续单个核细胞的分离；枸橼酸与枸橼酸钠可形成缓冲对，调节和稳定溶液的pH；葡萄糖可以为细胞提供能量来源，有利于单个核细胞保存；血浆为营养保护剂，其中包括的血清蛋白、无机盐离子、维生素等各种细胞因子及营养物质，不仅为人外周血单个核细胞提供了所需的营养物质，而且血清蛋白还形成了血清的黏度，可以保护细胞免受机械损伤。
根据本发明的实施方案，进一步包括质量体积分数(w/v，g/mL)为0.01～0.8％的葡萄糖酸钙，优选，质量体积分数为0.4％的葡萄糖酸钙。葡萄糖酸钙对细胞冻存基液中的枸橼酸根离子进行络合，补充细胞冻存基液中的钙离子，降低枸橼酸根离子对细胞的伤害，进而进一步提高冻存细胞的复苏成活率。
根据本发明的实施方案，所述细胞与所述血浆来源于同一机体。此时来源于自体的血浆用于来源自体的细胞的冻存，自体血浆不存在异源性，避免了外源血清在将来临床应用方面的安全隐患。
根据本发明的实施方案，所述细胞为人外周血单个核细胞。根据本发明实施方案的细胞冻存基液配合预定量的DMSO，特别适用于人外周血单个核细胞的冻存。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述的细胞冻存基液的方法。根据本发明的实施方案，所述细胞冻存基液是通过如下方式获得的：将人外周血与试剂进行混合处理，以便获得抗凝血，所述人外周血与试剂的体积比为200：(25～30)，其中，所述试剂包括质量体积分数(w/v，g/mL)为0.2％～0.5％的枸橼酸，质量体积分数(w/v，g/mL)为2％-4％枸橼酸钠，质量体积分数(w/v，g/mL)为0.1％-0.3％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数(w/v，g/mL)为2.5％-5％的葡萄糖以及质量体积分数(w/v，g/mL)为0.02％-0.05％的腺嘌呤；将所述抗凝血进行聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理，以便获得所述细胞冻存基液。根据本发明实施方案的制备细胞冻存基液的方法操作简便、省力，所获得的细胞冻存基液配合预定量的DMSO，尤其适用于人外周血单个核细胞的冻存。
根据本发明的具体实施实施方案，所述聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理后，所获得的上清即为细胞冻存基液，所述上清中包含人外周血的血浆以及基本全部的试剂，分离获得的人外周血的血浆的体积约为初始人外周血体积的一半，例如当初始人外周血体积为200ml时,则获得的人外周血的血浆的体积约为100mL,如果初始使用的试剂的体积为28mL,则离心后这28mL的试剂基本全部处于上清中。由此，本领域技术人员可根据初始试剂中各种物质的含量，依据此稀释比例，推算出细胞冻存基液中各种物质的含量。例如，当初始人外周血体积为200mL，初始使用的试剂的体积为28mL，则细胞冻存基液中各种物质的含量约为初始试剂中各物质含量的28/128。
根据本发明的实施方案，所述人外周血与试剂的体积比为200：(25～30)，优选为50∶7。发明人发现，如果外周血与试剂比例大于200：(25～30)，血液凝固风险会增加，控制人外周血与试剂的体积比为200：(25～30)，有利于降低血液凝固风险，增加人外周血单个核细胞的分离率。
根据本发明的实施方案，进一步包括将离心处理产物上清与预定量的葡萄糖酸钙进行混合处理。根据本发明的具体实施方案，所述聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理后，所获得的上清即为细胞冻存基液，将所述上清与预定量的葡萄糖酸钙进行混合，葡萄糖酸钙可与细胞冻存基液中的枸橼酸根离子进行络合，补充细胞冻存基液中的钙离子，降低枸橼酸根离子对细胞的伤害，可进一步提高冻存细胞的复苏成活率。
根据本发明的实施方案，聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理中，所述抗凝血与聚蔗糖－泛影葡胺的体积比为30：(15～20)。发明人发现，聚蔗糖－泛影葡胺的用量影响离心后血液的分层效果，如果聚蔗糖－泛影葡胺的用量过少，离心后的白膜层(中间细胞层)会有红细胞污染，而控制抗凝血与聚蔗糖－泛影葡胺的体积比为30：(15～20)，可有效降低离心后白膜层的红细胞污染的概率。
根据本发明的实施方案，所述抗凝血与聚蔗糖－泛影葡胺的体积比为2∶1。
根据本发明的实施方案，将所述人外周血与试剂进行混合处理后的8小时内进行所述聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心。发明人发现，人外周血与试剂进行混合处理后的放置一段时间后再进行分离并不影响复苏后NK细胞的扩增比例，但是对NK细胞的扩增倍数影响显著，随着与细试剂接触的时间的延长，例如放置16h或24h后，细胞的增殖倍数会显著下降，这表明试剂对PBMC的细胞扩增有影响。人外周血与试剂进行混合处理后的8小时内进行密度梯度离心，有利于减少试剂对细胞的毒性，维持冻存人外周血单个核细胞的复苏后的NK细胞的高增殖倍数。
细胞冻存液
在本发明的另一方面，本发明提出了一种细胞冻存液。根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液包括：体积分数为5％～15％的二甲基亚砜以及前面所述的细胞冻存基液或依据前面所述的方法制备的细胞冻存基液。根据本发明的实施方案，所述细胞冻存液包括：体积分数为5％～15％的二甲基亚砜(例如，体积分数为5％，10％，15％的二甲基亚砜)，体积分数为50％～90％的血浆(例如，体积分数为50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％的血浆)，质量体积分数为0.05％～0.09％的枸橼酸(例如，质量体积分数为0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％的枸橼酸)，质量体积分数为0.40％～0.70％枸橼酸钠(例如，质量体积分数为0.4％，0.5％，0.6％，0.7％的枸橼酸钠)，质量体积分数为0.03％～0.06％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠(例如，质量体积分数为0.03％，0.04％，0.05％，0.06％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠)，质量体积分数为0.50％～1.0％的葡萄糖(例如，质量体积分数为0.50％，0.60％，0.70％，0.80％，0.90％，1.0％的葡萄糖)以及质量体积分数为0.005％～0.01％的腺嘌呤(例如，质量体积分数为0.005％，0.006％，0.007％，0.008％，0.009％，0.01％的腺嘌呤)。
其中，二甲基亚砜(DMSO)(v/v)5％-15％，DMSO避免冷冻过程中冰晶对细胞的损伤，如果比例小于5％，将无法避免冷冻过程中冰晶对细胞的损伤，比例大于15％，细胞水分丧失过多，会造成细胞死亡；血浆(v/v)50％-90％，如果比例小于50％，则无法保证所述冻存液的黏度，从而无法保护细胞免受机械损伤；枸橼酸(w/v)0.05％～0.09％，枸橼酸钠(w/v)0.40％～0.70％，枸橼酸根离子可以络合外周血中的钙离子形成枸橼酸钙，如果含量偏低，因无法完全络合外周血中的钙离子造成血液凝固，其次枸橼酸与枸橼酸钠形成缓冲对，调节和稳定溶液的pH，如果含量偏高，无法保证溶液中的pH，会造成细胞死亡；磷酸二氢钾或磷酸二氢钠(w/v)0.03％～0.06％，为细胞代谢提供磷酸盐。
根据本发明实施方案的细胞冻存液配方简单、原料便宜、操作省力，能够有效保护人外周血单个核细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高人单个核细胞的复苏成活率达到80％，且复苏进行NK细胞诱导增殖后，细胞增殖数量大，NK细胞分化比例高，保证了人单个核细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
细胞冻存方法
在本发明的再一方面，本发明提出了一种细胞冻存方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括利用前面所述的细胞冻存液对待冻存细胞进行悬浮处理。根据本发明实施方案的细胞冻存方法，对细胞的损伤小，可以提高冻存细胞的复苏成活率和复苏后细胞的诱导增殖倍数。
根据本发明的实施方案，所述方法进一步包括将待冻存细胞的悬浮液进行低温静置处理，所述低温静置处理是在温度为-78℃～-82℃的条件下进行1～14天；将低温静置处理后的待冻存细胞的悬浮液进行速冻处理，所述速冻处理是液氮中进行的。发明人发现，低温静置处理时间控制在14天内，细胞复苏后的活率并无显著性差异，但低温静置超过14天，如静置21天，则复苏后的细胞活率会显著下降。
根据本发明的实施方案，所述待冻存细胞是人外周血单个核细胞，所述待冻存细胞是通过如下方式获得的：将人外周血与试剂进行混合处理，以便获得抗凝血，所述人外周血与试剂的体积比为200：(25～30)，优选，体积比为200∶28，其中，所述试剂包括质量体积分数为0.2％～0.5％的枸橼酸，质量体积分数为2％-4％枸橼酸钠，质量体积分数为0.1％-0.3％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数为2.5％-5％的葡萄糖以及质量体积分数为0.02％-0.05％的腺嘌呤；将所述抗凝血进行聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理，以便获得中间细胞层；将所述中间细胞层在新的离心管中进行重悬和离心处理，以便获得所述待冻存细胞。在上述获得待冻存细胞的同时，聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理后的上清即可作为所述细胞冻存基液，用于所获得的待冻存细胞的冻存。人自体血浆作为细胞冻存液的组成成分，不存在异源性，避免了外源血清在将来临床应用方面的安全隐患，且属于人外周血分离的副产物，获取简单方便，经济实惠。
根据本发明的实施方案，将所述人外周血与试剂进行混合处理后的8小时内进行所述聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理。发明人发现，人外周血与试剂进行混合处理后的8小时后进行密度梯度离心，有利于维持外周血单个核细胞的复苏后的NK细胞的高增殖倍数。
在本发明的再一方面，本发明提出了一种细胞冻存方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：将人外周血与试剂进行混合处理，优选地，所述混合处理后的放置时间不超过8小时，以便获得抗凝血，所述人外周血与试剂的体积比为200：(25～30)，其中，所述试剂包括质量体积分数(w/v，g/mL)为0.2％～0.5％的枸橼酸，质量体积分数(w/v，g/mL)为2％-4％枸橼酸钠，质量体积分数(w/v，g/mL)为0.1％-0.3％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数(w/v，g/mL)为2.5％-5％的葡萄糖以及质量体积分数(w/v，g/mL)为0.02％-0.05％的腺嘌呤，所述试剂可自行配制或购买获得；将所述抗凝血进行聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理，以便获得上清和中间细胞层，所述上清构成所述细胞冻存基液；将所述中间细胞层在新的离心管中进行重悬和离心处理，以便获得所述待冻存细胞；将所述细胞冻存基液与DMSO进行混合，以便获得细胞冻存液，所述DMSO在所述细胞冻存液中的体积分数为5％-15％；利用所述细胞冻存液对所述待冻存细胞进行重悬处理；将待冻存细胞重悬液进行低温静置处理，优选地，所述低温静置处理是在温度为-78℃～-82℃的条件下进行1～14天；将低温静置处理后的待冻存细胞的悬浮液进行速冻处理，所述速冻处理是液氮中进行的，以便实现细胞冻存。根据本发明实施方案的细胞冻存方法，适于人外周血单个核细胞的冻存，能够有效保护人外周血单个核细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高人单个核细胞的复苏成活率，且复苏进行NK细胞诱导增殖后，细胞增殖数量大，NK细胞分化比例高，保证了人单个核细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
提供下面的实施例以进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法均可以按照这类反应的常规条件进行或者按照制造厂商所建议的条件进行。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
试剂I组分为每1000mL含枸橼酸(C6H8O7·H2O)3.27g、枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)26.3g、磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)2.22g、葡萄糖(C6H12O6·H2O)31.9g、腺嘌呤(C5H5N5)0.275g。
10％葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙的分子式为C12H22CaO14·H2O，化学名为D-葡萄糖酸钙盐一水化合物。
实施例1
1、将200mL人体外周血与25-30mL试剂I混匀，混成抗凝血，优选外周血与血液试剂I的体积比为50∶7。
2、在50mL无菌管中底部加入15-20mL Ficoll-PaqueTM PREMIUM(聚蔗糖－泛影葡胺)，优选15mL。
3、取30mL抗凝血，在不破坏Ficoll-PaqueTM PREMIUM界面的情况下，缓慢加入到50mL无菌离心管中，重复步骤2和3，直到将228mL抗凝血全部加入到不同的50mL无菌管中，800g离心20分钟。
4、离心结束后，取上层透明血浆混合物，转移至新的离心管中，于56℃水浴灭活30分钟，转入-20℃中放置5分钟后，3000g转速下离心15分钟，吸取上清保存于新的冻存管中，混匀即为冻存用人自体血浆与试剂I混合液。
5、冻存用人自体血浆与试剂I混合液中加入DMSO，使得二甲基亚砜(DMSO)(v/v)为5％-15％，以便获得细胞冻存液，经推算，细胞冻存液中包含：体积分数为5％～15％的二甲基亚砜，体积分数为50％～90％的血浆，质量体积分数为0.05％～0.09％的枸橼酸，质量体积分数为0.40％～0.70％枸橼酸钠，质量体积分数为0.03％～0.06％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数为0.50％～1.0％的葡萄糖以及质量体积分数为0.005％～0.01％的腺嘌呤。
6、取中间细胞层，转移至新的离心管中，每15mL细胞悬液加入30mL PBS，800g转速离心7分钟，弃上清后，再加入30mL PBS重悬细胞，800g转速离心7分钟，弃上清。
7、按照1mL细胞冻存液重悬1x107个细胞的密度制备成细胞冻存液悬液。
8、每个2mL规格的冻存管中加入1mL细胞冻存液悬液，置于程序降温盒中进行降温冻存。
9、程序降温盒放入-80℃过夜后，将冻存管转入液氮中进行永久保存。
实施例2
1、将200mL人体外周血与25-30mL 试剂I混匀，混成抗凝血，优选外周血与试剂I的体积比为50∶7。
2、在50mL无菌管中底部加入15-20mL Ficoll-PaqueTM PREMIUM，优选15mL。
3、取30mL抗凝血，在不破坏Ficoll-PaqueTM PREMIUM界面的情况下，缓慢加入到50mL无菌离心管中，重复步骤2和3，直到将228mL抗凝血全部加入到不同的50mL离心管中，800g离心20分钟。
4、离心结束后，取上层透明装血浆混合物，转移至新的离心管中，于56℃水浴灭活30分钟，转入-20℃中放置5分钟后，3000g转速下离心15分钟，吸取上清保存于新的冻存管中，按照体积比，加入0.01-8％(v/v)的葡萄糖酸钙注射液(10％，g/mL)，混匀即为冻存用人自体血浆与试剂I混合液。
5、冻存用人自体血浆与试剂I混合液中加入DMSO，使得二甲基亚砜(DMSO)(v/v)为5％-15％，以便获得细胞冻存液，经推算，细胞冻存液中包含：5％～15％的二甲基亚砜，体积分数为50％～90％的血浆，质量体积分数为0.01～0.8％的葡萄糖酸钙，质量体积分数为0.05％～0.09％的枸橼酸，质量体积分数为0.40％～0.70％枸橼酸钠，质量体积分数为0.03％～0.06％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数为0.50％～1.0％的葡萄糖以及质量体积分数为0.005％～0.01％的腺嘌呤。
6、取中间细胞层，转移至新的离心管中，每15mL细胞悬液加入30mL PBS，800g转速离心7分钟，弃上清后，再加入30mL PBS重悬细胞，800g转速离心7分钟，弃上清。
7、按照1mL细胞冻存液重悬1x107个细胞的密度制备成细胞冻存液悬液。
8、每个2mL规格的冻存管中加入1mL细胞冻存液悬液，置于程序降温盒中进行降温冻存。
9、程序降温盒放入-80℃过夜后，将冻存管转入液氮中进行永久保存。
实施例3
本实施例通过单个核细胞复苏活率以及复苏后NK细胞增殖分化的比例来确定实施例1所获得的冻存液对单个核细胞生物学性能的保护。
实验方法如下：
将液氮冻存0.5个月的细胞取出，放入37℃水浴锅震荡直至细胞悬液融化，离心，以PBS洗涤两次，即可统计活率。
使用实施例1所获得的冻存液与对比细胞冻存液冻存0.5个月后，统计复苏后的单个核细胞存活率(冻存密度为1.0╳107个细胞/mL)，结果如表1所示。
表1：
由表1可以看出，使用实施例1的方法冻存的A、B、C、D、E号单个核细胞冻存0.5个月之后，复苏的细胞存活率均高于传统冻存液，且与市售冻存液相当。使用实施例1的方法冻存的细胞，复苏后单个核细胞均没有可见异物、细菌、真菌、内毒素、支原体污染。
进一步通过NK细胞诱导增殖实验，检测人外周血单个核细胞冻存0.5个月后复苏，NK细胞诱导增殖分化第15天，NK细胞的诱导分化生成比例，结果如表2和图1所示。
表2
由表2和图1可以看出，使用实施例1的方法冻存的单个核细胞在复苏后，再次扩增NK细胞，NK细胞的诱导生成比例均能够达到65％以上，且相比于使用传统冻存液，NK增殖分化比例显著性提高，相比于使用市售冻存液，NK增殖分化比例相当。
通过上述实施例可以说明，采用本发明的人外周血单个核细胞冻存液可以长期储存人外周血单个核细胞。
实施例4
本实施例探究了人外周血与试剂I混合后放置的时间对外周血中PBMC影响。
本研究将采血袋采集的新鲜人体血液与试剂I进行混匀后，在10℃的储存温度中，分别放置4h、8h、16h、24h后，进行PBMC的分离，之后进行细胞计数以及细胞活率检测。检测结果显示，在10℃环境中，放置4h、8h、16h和24h后，细胞活率无显著性差异(图2a)。
随后，本研究对这批细胞利用实施例1的方法进行了冻存，复苏后检测细胞的活率，实验结果显示，复苏后的细胞活率并无显著性差异，这说明试剂I对PBMC冻存复苏后的活率并无影响(图2b)。
最后，本研究探究了人外周血与试剂I混合后放置的时间对体外扩增培养NK细胞的功能性的影响。结果表明，新鲜的外周血液与试剂I混匀后，放置4h、8h、16h、24h再进行分离并不影响使用实施例1的方法冻存细胞，复苏后NK细胞的扩增比例(图2c)，但是对冻存复苏后NK细胞的扩增倍数影响显著，随着与试剂I接触的时间的延长，细胞的增殖倍数显著下降，这表明试剂I对PBMC的细胞扩增有影响(图2d)。
实施例5
本实施例探究了使用实施例1的冻存液重悬细胞后，待冻存细胞重悬液的低温静置处理时间对细胞的影响。
在细胞存储过程中，外周血分离得到的PBMC在液氮冻存之前通常需要经过-80℃降温(低温静置处理)，与此同时质检人员需要对PBMC进行无菌和内毒素等相关质量检测，只有检测合格的样品，才能转入-196℃气相液氮罐中进行正式保存。因此，探究-80℃存放时间对PBMC的影响至关重要。为了验证PBMC在-80℃冰箱中放置时间对细胞活率的影响，我们将从新鲜血液中分离的PBMC在-80℃分别放置2天、7天、14天、21天后转入液氮冻存，液氮冻存一个月后，进行细胞复苏，检测细胞活率、外周血NK增殖能力。
实验结果显示，细胞重悬液在-80℃放置2、7和14天，PBMC复苏后的活率并无显著性差异，但是在-80℃存放21天，PBMC复苏后细胞活率显著性下降(图3a-c)。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均与本领域普通技术人员通常已知的含义一致。
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由具有相同，等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等同或相似特征的示例。
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施例也在所附权利要求的范围内。
Claims (21)
1.一种细胞冻存方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提供待冻存细胞在细胞冻存液中的悬浮液；和
冻存所述悬浮液，
其中，所述细胞冻存液包含：
体积分数为5％～15％的二甲基亚砜，
体积分数为50％～90％的血浆，
质量体积分数为0.05％～0.09％的枸橼酸，
质量体积分数为0.40％～0.70％枸橼酸钠，
质量体积分数为0.03％～0.06％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，
质量体积分数为0.50％～1.0％的葡萄糖，和
质量体积分数为0.005％～0.01％的腺嘌呤，并且
所述待冻存细胞是外周血单个核细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞冻存液包括体积分数为65％～75％的血浆。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞冻存液进一步包括葡萄糖酸钙。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述细胞冻存液进一步包括质量体积分数为0.01～0.8％的葡萄糖酸钙。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，冻存所述悬浮液包括：
将所述悬浮液进行低温静置处理，所述低温静置处理是在温度为-78℃～-82℃的条件下进行1～14天；和
将低温静置处理后的所述悬浮液进行速冻处理，所述速冻处理是在液氮中进行的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待冻存细胞是人外周血单个核细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待冻存细胞是通过如下方式获得的：
将人外周血与试剂进行混合处理，所述试剂包括质量体积分数为0.2％～0.5％的枸橼酸，质量体积分数为2％-4％枸橼酸钠，质量体积分数为0.1％-0.3％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数为2.5％-5％的葡萄糖以及质量体积分数为0.02％-0.05％的腺嘌呤，其中所述人外周血与所述试剂的体积比为200：(25～30)；
将混合处理产物进行密度梯度离心处理，以便获得中间细胞层；
将所述中间细胞层在新的离心管中进行重悬和离心处理，以便获得所述待冻存细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞冻存液是通过如下方式获得的：
将人外周血与试剂进行混合处理，所述试剂包括质量体积分数为0.2％～0.5％的枸橼酸，质量体积分数为2％-4％枸橼酸钠，质量体积分数为0.1％-0.3％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数为2.5％-5％的葡萄糖以及质量体积分数为0.02％-0.05％的腺嘌呤，其中所述人外周血与所述试剂的体积比为200：(25～30)；
将混合处理产物进行密度梯度离心处理，以便获得上清；
将所述上清与预定量的DMSO进行混合，以便获得所述细胞冻存液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提供待冻存细胞在细胞冻存液中的悬浮液包括：
将人外周血与试剂进行混合处理，所述试剂包括质量体积分数为0.2％～0.5％的枸橼酸，质量体积分数为2％-4％枸橼酸钠，质量体积分数为0.1％-0.3％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，质量体积分数为2.5％-5％的葡萄糖以及质量体积分数为0.02％-0.05％的腺嘌呤，其中所述人外周血与所述试剂的体积比为200：(25～30)；
将混合处理产物进行密度梯度离心处理，以便获得中间细胞层和上清；
将所述中间细胞层在新的离心管中进行重悬和离心处理，以便获得所述待冻存细胞；
将所述上清与预定量的DMSO进行混合，以便获得所述冻存液；
将所述待冻存细胞在所述冻存液中重悬，以便获得所述悬浮液。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述密度梯度离心处理包括聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心处理中，所述抗凝血与聚蔗糖－泛影葡胺的体积比为30：(15～20)。
12.根据权利要求7～9和11中任一项所述的方法，其特征在于，将所述人外周血与所述试剂进行混合处理后的8小时内进行所述密度梯度离心处理。
13.根据权利要求8～9和11中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述上清与预定量的葡萄糖酸钙进行混合处理。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖酸钙的质量体积分数为0.01～0.8％。
15.一种细胞冻存液，其特征在于，包含：
体积分数为5％～15％的二甲基亚砜，
体积分数为50％～90％的血浆，
质量体积分数为0.05％～0.09％的枸橼酸，
质量体积分数为0.40％～0.70％枸橼酸钠，
质量体积分数为0.03％～0.06％的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，
质量体积分数为0.50％～1.0％的葡萄糖，和
质量体积分数为0.005％～0.01％的腺嘌呤。
16.根据权利要求15所述的细胞冻存液，其特征在于，包括体积分数为65％～75％的血浆。
17.根据权利要求15或16所述的细胞冻存液，其特征在于，进一步包括葡萄糖酸钙。
18.根据权利要求17所述的细胞冻存液，其特征在于，进一步包括质量体积分数为0.01～0.8％的葡萄糖酸钙。
19.一种组合物，其特征在于，包括权利要求15～18任一项所述的细胞冻存液和在权利要求15～18任一项所述的细胞冻存液中冻存的细胞。
20.根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述细胞与所述冻存液中的血浆来源于同一机体。
21.根据权利要求19或20所述的组合物，其特征在于，所述细胞为人外周血单个核细胞。
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