CN112056309B - 一种细胞保存液及其在保存脐血nk细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞保存液及其在保存脐血NK细胞中的应用。本发明公开了一种细胞保存液，包括：柠檬酸三钠、柠檬酸、葡萄糖、羟乙基淀粉、人血清白蛋白和水。本发明细胞保存液中柠檬酸三钠、柠檬酸、葡萄糖与羟乙基淀粉、人血清白蛋白协同配合，有效延长脐血的保存时间至72 h，保证脐血NK细胞存活率和数量与保存前基本不变，并且能分离扩增培养到正常倍数和数量的NK细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞保存液及其在保存脐血NK细胞中的应用。
背景技术
自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）是人类血液系统中重要的免疫细胞。众所周知，机体防御体系的第一道防线就是NK细胞，其在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，而且在天然免疫系统其发挥主要杀瘤效应，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。
脐血来源丰富，目前脐血也成为NK细胞的主要来源之一。为了保持新鲜脐血NK细胞的活性，目前常采用的是添加肝素钠进行采集，采集后一般是4小时内必须处理，也有研究表明：在保持脐血与抗凝剂正常比例情况下，临床新鲜脐血37 ℃保存7小时内进行Ficoll分离法富集NK可达到较好富集效果，这给脐血采集和单个核细胞的分离工作造成了一定的限制。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种细胞保存液及其在保存脐血NK细胞中的应用，该细胞保存液在保持脐血NK细胞的活性的条件下，可延长脐血保存时间至72h。
其具体技术方案如下：
本发明提供了一种细胞保存液，包括：柠檬酸三钠、柠檬酸、葡萄糖、羟乙基淀粉、人血清白蛋白和水。
实验证明，本发明提供的细胞保存液可以提供细胞营养，有效维持脐血NK细胞在保存期间的活性，使得NK细胞的存活率和数量在72h内基本保持不变，并能分离扩增培养到正常倍数和数量的NK细胞。
本发明中，每10mL细胞保存液中包括：
柠檬酸三钠3.0-3.5g；
柠檬酸0.01 -0.05g；
葡萄糖2.0 -3.5g；
羟乙基淀粉1-5ml；
人血清白蛋白1-5ml；
余量为水。
优选地，每10mL细胞保存液中包括：
柠檬酸三钠 3g；
柠檬酸 0.03g；
葡萄糖 3g；
羟乙基淀粉 0.6g；
人血清白蛋白 2g；
余量为水。
本发明中，羟乙基淀粉的质量浓度为5%-10%，优选为6%；
所述人血白蛋白的质量浓度为10%-30%，优选为20%。
本发明还提供了上述细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：。
本发明还提供了上述细胞保存液在保存脐血NK细胞中的应用。
本发明还提供了一种脐血NK细胞的保存方法，包括以下步骤：
向脐血中加入抗凝剂后，再加入上述细胞保存液中保存。
本发明中，抗凝剂优选为肝素钠，所述肝素钠的浓度为200U/ml，所述脐血与所述肝素钠的体积比为10：1。
本发明中，保存的温度为1~6℃，优选为4℃。
本发明中，所述脐血与所述细胞保存液的体积比为10：1。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种细胞保存液，包括：柠檬酸三钠、柠檬酸、葡萄糖、羟乙基淀粉、人血清白蛋白和水。本发明细胞保存液中柠檬酸三钠、柠檬酸、葡萄糖与羟乙基淀粉、人血清白蛋白协同配合，有效延长脐血的保存时间至72 h，保证脐血NK细胞存活率和数量与保存前基本不变，并且能分离扩增培养到正常倍数和数量的NK细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1中步骤5组1单个核细胞活率计数图；
图2为本发明实施例1中步骤6组1扩增培养后NK细胞的流式检测结果图；
图3为本发明实施例1中步骤6组1扩增培养后NK细胞活率计数图；
图4为本发明实施例1和对比例1扩增前后脐血NK细胞含量、活率和数量检测结果图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，脐血来源于江门医院妇产科，其它试剂均为市购。
实施例1
1、细胞保存液的配制：先用5ml注射用水溶解柠檬酸三钠 3g、柠檬酸 0.03g、葡萄糖 3g、羟乙基淀粉 0.6g、人血清白蛋白 2g，再用注射用水定容至10ml，保存于4℃。
2、人新鲜脐血采集与保存：将100mL脐血（收集于含10mL 20IU/ml的肝素钠采集袋中，置于1-6℃，同时避免X射线。
3、人新鲜脐血分装：取30mL采集袋中的脐血装在50mL离心管中，加入3mL细胞保存液，保存72h。
4、人脐血流式检测：在安全柜中，抽取保存72h后的脐血1ml，用BD流式仪检测NK的含量。
5、人脐血单个核细胞分离：采用密度梯度离心法，将血液加入含有Ficoll分离液的离心管，800g离心20min，吸取白膜层的细胞，离心洗涤2次，沉淀物即为外周血单个核细胞，并计数。
6、NK细胞的培养：将收集的细胞取2千万加入含100IU/ml IL-2的无血清培养基和2千万滋养层细胞一起共培养，并加入2ml血清；
3-4天进行补液，第5天再加入8千万滋养层细胞进行二次刺激，继续共培养，视细胞生长状态不断补液至终体积为2L；
14天时收集细胞，采用台昐蓝染色法计算细胞的活率和总数，流式仪检测NK细胞的含量。
7、实验重复3次，分为组1、组2和组3。
实施例2~实施例5
实施例2~5步骤1~7同实施例1。实施例2~5均是采集100mL脐血。
对比例1
本对比例30mL脐血取自实施例1步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别仅在于，不加细胞保存液，保存时间为4h。
对比例2
本对比例30mL脐血取自实施例1步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别在于，不加细胞保存液。
对比例3
本对比例30mL脐血取自实施例2步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别在于：保存温度为15℃。
对比例4
本对比例30mL脐血取自实施例3步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别在于，替换实施例1细胞保存液中的人血清白蛋白为SOD（超氧化物歧化酶）。
对比例5
本对比例30mL脐血取自实施例3步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别在于，替换实施例1细胞保存液中的葡萄糖为ATP。
对比例6
本对比例30mL脐血取自实施例2步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别在于，羟乙基淀粉和人血清白蛋白用量分别为0.1g和0.2g。
对比例7
本对比例30mL脐血取自实施例4步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别在于，柠檬酸三钠、柠檬酸与葡萄糖的用量比为6g:0.3g：6g。
对比例8
本对比例30mL脐血取自实施例4步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别在于，羟乙基淀粉与人血清白蛋白用量比为10g:10g。
对比例9
本对比例30mL脐血取自实施例5步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别在于，5mL细胞保存液仅包含：3.0g柠檬酸三钠、0.03g柠檬酸、3.0葡萄糖。
对比例10
本对比例30mL脐血取自实施例5步骤2采集袋中的脐血。
本对比例与实施例1的区别在于，5mL细胞保存液仅包含：0.6g羟乙基淀粉、2g人血清白蛋白、其余为水。
实施例1~5和对比例1~10保存后脐血NK细胞流式、细胞活率和总数计算结果，以及从脐血中分离培养的NK细胞流式、细胞活率和总数计算结果如表1~5和图1~4所示。
从表1和图2~3的结果可知，新鲜脐血采用实施例1细胞保存液保存72h后，脐血中NK细胞的存活率和细胞数量与对比例1未加入细胞保存液保存4h的脐血中NK细胞基本保持不变，而且实施例1经脐血分离的NK细胞可以扩增培养得到与对比例1相当倍数和数量的NK细胞。
从表2的结果可知，相比于实施例2，对比例3保存液细胞保存温度过高、对比例6保存液中羟乙基淀粉和人血清白蛋白的用量过低都会影响细胞活性。
从表3的结果可知，相比于实施例3，采用SOD替换人血清白蛋白或ATP替换葡萄糖与实施例3保存液中的其它组分复配，都会导致细胞的活性降低。
从表4的结果可知，相比于实施例4，保存液中羟乙基淀粉和人血清白蛋白的用量过高会导致细胞活性降低。
从表5的结果可知，相比于实施例5，仅使用柠檬酸三钠、柠檬酸与葡萄糖作为保存液或仅使用羟乙基淀粉和人血清白蛋白作为保存液，保存72h后，保存液失去协同作用，且保存时间过长，导致细胞活性非常低。
综上所述，经实施例1~5保存液各组分协同作用，保存72h后脐血中NK细胞的存活率和细胞数量，以及扩增培养后NK细胞的存活率和细胞数量，以及NK细胞含量均显著优于对比例1~10。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种细胞保存液，其特征在于，包括：柠檬酸三钠、柠檬酸、葡萄糖、羟乙基淀粉、人血清白蛋白和水；
每10mL所述细胞保存液中包括：
柠檬酸三钠3.0-3.5g；
柠檬酸0.01-0.05g；
葡萄糖2.0-3.5g；
羟乙基淀粉0.5-5g；
人血清白蛋白1-5g；
余量为水。
2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，每10mL所述细胞保存液包括：
柠檬酸三钠3g；
柠檬酸0.03g；
葡萄糖3g；
羟乙基淀粉0.6g；
人血清白蛋白2g；
余量为水。
3.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述羟乙基淀粉的质量浓度为5％～10％。
4.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述人血清白蛋白的质量浓度为10％～30％。
5.权利要求1所述的细胞保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
先用5ml注射用水溶解柠檬酸三钠3.0-3.5g、柠檬酸0.01-0.05g、葡萄糖2.0-3.5g、羟乙基淀粉0.5-5g、人血清白蛋白1-5g，再用注射用水定容至10ml，4℃保存。
6.根据权利要求1至4任意一项所述的细胞保存液在保存脐血NK细胞中的应用。
7.一种脐血NK细胞的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
向脐血中加入抗凝剂后，再加入权利要求1至4任意一项所述的细胞保存液中保存。
8.根据权利要求7所述的保存方法，其特征在于，所述保存的温度为1～6℃。
9.根据权利要求7所述的保存方法，其特征在于，所述脐血与所述细胞保存液的体积比为10：1。
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