CN106922651A - 一种高活性的细胞冻存液 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种高活性的细胞冻存液，该冻存液由DMEM基础培养基、胎牛血清、维生素E、羟乙基淀粉、四甲烯二胺、海藻糖和白蛋白组成；其中，胎牛血清的添加量为DMEM基础培养基重量的2.2~2.5%；维生素E的浓度为38~42μM；羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的18‑20%；四甲烯二胺的添加量为DMEM基础培养基重量的0.5~0.8%；海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的1.0~1.5%；白蛋白的添加量为DMEM基础培养基重量的3.0~3.5%。本发明的主要优势在于对于细胞具有很好的保护作用，长时冻存时，可以获得97%以上的复苏存活率。
Description
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种高活性的细胞冻存液。
背景技术
随着细胞技术的不断发展，对细胞的保存的要求也日渐提高，主要体现在冻存后的复苏存活性上。目前，常用的冻存液含有DMSO，DMSO的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过度脱水皱缩。不过，DMSO对细胞具有一定毒性，一般的冻存液将其浓度控制在5%以下。特别的，在长期保存细胞时，DMSO对细胞具有一定的损伤作用，不利于细胞的复苏。因此寻求一种无DMSO的冻存液是本领域的研究方向之一。
虽然现有技术提供了多种含有血清或者无血清的冻存液，如ZL 201110227449.8和ZL 201610124499.6 。
不过，类似的冻存液在长时冻存方面，稳定性较差，难以符合一些科研工作和产业发展的要求。
发明内容
本发明的目的旨在针对现有技术的不足，提供一种高活性的冻存液，该冻存液由DMEM基础培养基、胎牛血清、维生素E、羟乙基淀粉、四甲烯二胺、海藻糖和白蛋白组成；
其中，胎牛血清的添加量为DMEM基础培养基重量的2.2~2.5 %；维生素E的浓度为38~42μM；羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的18-20 %；四甲烯二胺的添加量为DMEM基础培养基重量的0.5~0.8%；海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的1.0~1.5%；白蛋白的添加量为DMEM基础培养基重量的3.0~3.5%。
优选的，所述胎牛血清的添加量为DMEM基础培养基重量的2.3 %。
优选的，所述维生素E的浓度为40 μM。
优选的，所述羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的18.5 %。
优选的，所述四甲烯二胺的添加量为DMEM基础培养基重量的0.6%。
优选的，所述海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的1.2%。
优选的，所述白蛋白的添加量为DMEM基础培养基重量的3.3%。
本发明所用的海藻糖可以与细胞膜形成玻璃态基质，避免冰晶产生的伤害；同时，所用的羟乙基淀粉可以促使细胞内水分的排出，减少细胞内冰晶的含量。
如本发明的一个对比例所示，当不含四甲烯二胺和维生素E时，或当海藻糖和羟乙基淀粉的添加量不在本发明范围时，细胞的复苏存活率出现较大幅度的降低。这可能是由于四甲烯二胺对于海藻糖和羟乙基淀粉在减少冰晶产生方面具有促进和稳定作用，而微生物E和白蛋白对于细胞具有一定的缓冲保护作用。
本发明的主要优势在于对于细胞具有很好的保护作用，长时冻存时，可以获得97%以上的复苏存活率。
具体实施方式
以下结合实施例进一步对本发明进行说明，值得一提的时，下述实施例仅仅起到示例作用，并非旨在对本发明有所限定，本领域的技术人员应该理解，凡是符合本发明精神的技术方案均属于本发明的保护范围。
实施例1
配制冻存液：
冻存液由DMEM基础培养基、胎牛血清、维生素E、羟乙基淀粉、四甲烯二胺、海藻糖和白蛋白组成；
其中，胎牛血清的添加量为DMEM基础培养基重量的2.3 %；维生素E的浓度为40 μM；羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的18.5 %；四甲烯二胺的添加量为DMEM基础培养基重量的0.6%；海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的1.2%；白蛋白的添加量为DMEM基础培养基重量的3.3%。
实施例2
配制冻存液：
冻存液由DMEM基础培养基、胎牛血清、维生素E、羟乙基淀粉、四甲烯二胺、海藻糖和白蛋白组成；
其中，胎牛血清的添加量为DMEM基础培养基重量的2.5 %；维生素E的浓度为42 μM；羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的20 %；四甲烯二胺的添加量为DMEM基础培养基重量的0.5%；海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的1.0%；白蛋白的添加量为DMEM基础培养基重量的3.5%。
实施例3
配制冻存液：
冻存液由DMEM基础培养基、胎牛血清、维生素E、羟乙基淀粉、四甲烯二胺、海藻糖和白蛋白组成；
其中，胎牛血清的添加量为DMEM基础培养基重量的2.2 %；维生素E的浓度为38 μM；羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的18 %；四甲烯二胺的添加量为DMEM基础培养基重量的0.8%；海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的1.5%；白蛋白的添加量为DMEM基础培养基重量的3.0%。
对比实施例1
除了不含四甲烯二胺和维生素E外，其余与实施例1一致。
对比实施例2
除了羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的22 %、海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的0.8%之外，其余与实施例1一致。
对比实施例3
除了羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的16 %、海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的1.2%之外，其余与实施例1一致。
应用实施例1
将实施例1~3和对比实施例1~3所得冻存液分别稀释分离的人源外周血单个核细胞至浓度为0.1×107、0.5×107和1.0×107个，于4℃下预冷10-30 min后，在-80℃下冻存24h，转移至液氮罐中保存。保存时间为6个月、12个月、24个月。
将冻存细胞从液氮罐中转移至37℃的恒温箱中，溶化后加入预冷的细胞培养液。利用台盼蓝染色法对细胞进行计数。
细胞复苏率（%）=活细胞数/总细胞数×100%。
结果如表1所示。
表1
Claims (7)
1.一种高活性的细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液由DMEM基础培养基、胎牛血清、维生素E、羟乙基淀粉、四甲烯二胺、海藻糖和白蛋白组成；
其中，胎牛血清的添加量为DMEM基础培养基重量的2.2~2.5 %；维生素E的浓度为38~42μM；羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的18-20 %；四甲烯二胺的添加量为DMEM基础培养基重量的0.5~0.8%；海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的1.0~1.5%；白蛋白的添加量为DMEM基础培养基重量的3.0~3.5%；
所述细胞包括淋巴细胞、骨髓造血肝细胞、外周血单个核细胞中的一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胎牛血清的添加量为DMEM基础培养基重量的2.3 %。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素E的浓度为40 μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羟乙基淀粉的添加量为DMEM基础培养基重量的18.5 %。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述四甲烯二胺的添加量为DMEM基础培养基重量的0.6%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述海藻糖的添加量为DMEM基础培养基重量的1.2%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白蛋白的添加量为DMEM基础培养基重量的3.3%。
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| CN103881971A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 曾因明 | 一种用于培养和/或扩增间充质干细胞的培养基及其培养方法 |
| CN103881973A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 曾因明 | 一种用于诱导分化间充质干细胞的培养基及其方法 |
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