CN110150264A - 一种细胞冻存液 - Google Patents

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龚立康
刘天歌
王卿
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    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
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Abstract

本发明一种细胞冻存液，含有基础培养基、甘油、胎牛血清和非渗透性的保护剂，各组分的含量为：甘油11‑15v/v％、胎牛血清0.5‑1v/v％、非渗透性的保护剂0.11～0.15w/v％，余量为基础培养基；所述基础培养基为RPMI‑1640、MEM、高糖DMEM、低糖DMEM或DMEM‑F12。本发明不含二甲基亚砜，而是通过非渗透性保护剂与甘油和胎牛血清的不同搭配来获取好的冷冻效果，具有很强的水分子络合能力，在冷冻功能上与二甲基亚砜相似，但能减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成；作为细胞冻存液，添加成份明确、安全性高、对细胞损伤小、细胞冻存前后形态一致、细胞复苏后细胞存活率高、增殖能力良好。

Description

一种细胞冻存液
技术领域
本发明涉及细胞及生物工程学技术领域，具体的，是一种细胞冻存液。
背景技术
细胞冻存是生物研究中的重要环节之一，它对人工培养细胞的冻存、防止由于细胞传代培养所导致的细胞退化、防止传代培养中的细菌污染、解决维持传代培养过程中的一系列问题具有重要作用。然而，细胞冻存也会在一定程度上使细胞受到损伤。
目前在细胞冻存领域中，人们广泛采用的是冷冻剂(英语全称Cryo-ProtectantAgent，简称CPA)。所述冷冻剂包括渗透型冷冻剂和非渗透型冷冻剂，其中，渗透型冷冻剂主要包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺和甲醇；其的保护机理是：在细胞冷冻悬浮液完全凝固之前，冷冻剂能进入细胞内，在细胞内外形成一定的摩尔浓度，降低细胞内外尚未结冰的溶液中的电解质浓度，以保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，能使细胞内水分不会过多外渗，能避免细胞过度脱水而皱缩。所述冷冻剂能有效降低细胞冻存过程中细胞的溶质损伤和冰晶损伤。目前采用的冷冻剂中，二甲基亚砜(DMSO)是细胞保存中最常用的冷冻剂，但是，它同时对细胞也存在一定的毒性，常温下能使细胞内蛋白变性，因此，这些不足限制了它的进一步应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足并在现有研究成果的基础上，提供一种细胞冻存液，它不含二甲基亚砜，而是通过海藻酸钠、透明质酸、γ-聚谷氨酸这些非渗透性的保护剂与甘油和胎牛血清的不同搭配来获取较好的冷冻效果，可用于细胞的低温冻存，具有细胞冻存前后形态一致、细胞复苏后存活率高、增殖能力良好的积极效果。为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。一种细胞冻存液，其特征在于，含有基础培养基、甘油、胎牛血清和非渗透性的保 护剂，其各组分的含量为：
甘油11-15v/v％；
胎牛血清0.5-1v/v％；
非渗透性的保护剂0.11～ 0.15w/v％；
余量为基础培养基。
进一步，所述基础培养基为RPMI-1640、MEM、高糖DMEM、低糖DMEM或DMEM-F12。
进一步，所述非渗透性的保护剂为海藻酸钠(Sodium alginate)、透明质酸钠(Hyaluronic acid sodium salt)或γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid)。
本发明细胞冻存液的积极效果为：
(1)不含二甲基亚砜，而是通过非渗透性的保护剂-海藻酸钠、透明质酸钠、γ- 聚谷氨酸与甘油和胎牛血清的不同搭配来获取较好的冷冻效果，具有很强的水分子络合能力，在冷冻功能上与二甲基亚砜相似，但能减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成，可用于细胞 的低温冻存。
(2)作为细胞冻存液，具有细胞冻存前后形态一致、细胞复苏后存活率高、冻存复苏后细胞的增殖能力良好的积极效果。
(3)添加成份明确，安全性高，对细胞的损伤小；可用于替代目前最常用的二甲基亚砜冷冻液。
具体实施方式
以下介绍本发明细胞冻存液的具体实施方式，提供7个实施例和2个比较例。但是应 该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
实施例1
一种细胞冻存液，其基础成分为RPMI-1640培养基，添加成分如下：
甘油(glycerinum) 11v/v％；
胎牛血清(Fetal calf serum) 1v/v％；
非渗透性的保护剂0 .11w/v％。
实施例2
一种细胞冻存液，其基础成分为DMEM-F12培养基，添加成分如下：
甘油12v/v％；
胎牛血清 0.6v/v％；
非渗透性的保护剂0 .12w/v％。
实施例3
一种细胞冻存液，其基础成分为RPMI-1640培养基，添加成分如下：
甘油13v/v％；
胎牛血清 0.7v/v％；
非渗透性的保护剂0 .13w/v％。
实施例4
一种细胞冻存液，其基础成分为MEM培养基，添加成分如下：
甘油14v/v％；
胎牛血清0.8v/v％；
非渗透性的保护剂0 .14w/v％。
实施例5
一种细胞冻存液，其基础成分为低DMEM培养基，添加成分如下：
甘油11v/v％；
胎牛血清 0.7v/v％；
非渗透性的保护剂0 .14w/v％。
实施例6
一种细胞冻存液，其基础成分为高糖DMEM培养基，添加成分如下：
甘油11v/v％；
胎牛血清 0.8v/v％；
非渗透性的保护剂0 .11w/v％。
实施例7
一种细胞冻存液，其基础成分为RPMI-1640培养基，添加成分如下：
甘油15v/v％；
胎牛血清 1v/v％；
非渗透性的保护剂0 .15w/v％。
比较例1
一种细胞冻存液，其成分为：RPMI-1640培养基80％；胎牛血清10％；二甲基亚砜 10％；作为与本发明细胞冻存液的对比冻存液1。
比较例2
一种细胞冻存液，其成分为：RPMI-1640培养基90％；甘油10％；作为与本发明细胞冻存液的对比冻存液2。
细胞冻存液的效果验证
将本发明实施例1～7所制备的细胞冻存液与比较例1～2所制备的对比冻存液1和2分别用下述方法进行细胞冻存和复苏实验。HeLa细胞冻存：培养生长成单层的HeLa细胞，在对数生长期时，将细胞用0 .25％胰 蛋白酶液消化4分钟，加入培养液(RPMI-1640培养基90％和FBS 10％)15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，用1000rpm/min离心5分钟，弃上清，分别加入实施例1～7和比较例所制备的细胞冻存液，混均。以1×106 cells/ml的浓度，1ml的体系置入1 .5ml的冻存管中；4℃保存 30min，-20℃保存2h后转移到-80℃冰箱中长期保存：分别冻存1个月；三个月。
细胞复苏：将冻存细胞从-80℃冰箱中取出，快速转移到37℃水浴锅中解冻，随后将冻存细胞移到1 .5ml EP管中，用1000r/min离心5min，经培养基重悬后接种到T75培养瓶中培养。冻存1个月和3个月后细胞的存活率见表1。
表1 .冻存1个月和3个月后细胞的存活率
冻存1个月和3个月后细胞复苏后第一天的贴壁率见表2。
表2 .冻存1个月和3个月后细胞复苏后第一天的贴壁率
冻存3个月后细胞的存活率和细胞复苏后第一天的贴壁率见表3。
表3 采用实施例7的细胞冻存液冻存3个月的细胞存活率及复苏后第一天的细胞贴壁率
从以上细胞存活率和细胞复苏后第一天的贴壁率的结果可以看出：
(1)本发明的细胞冻存液既可以达到DMSO对细胞冻存的效果，又可以减少对细胞的毒性作用，冻存复苏后的细胞形态不变，存活率高。
(2)本发明的细胞冻存液不含DMSO，安全无毒，不会给实验人员的健康和环境带来危害，所采用的三种非渗透型的保护剂均为广泛使用的化妆品原料，来源便利且稳定。
(3)本发明的细胞冻存液成分简单明确，便于配置使用，可广泛应用于细胞冻存领域。
以上所述仅是本发明的优选实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明组分范畴的前提下，还可以做出若干改变和改进，这些应都属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种细胞冻存液，其特征在于，含有基础培养基、甘油、胎牛血清和非渗透性的保护剂，其各组分的含量为：
甘油11-15v/v％；
胎牛血清0.5-1v/v％；
非渗透性的保护剂0.11～ 0.15w/v％；
余量为基础培养基。
2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为RPMI-1640、MEM、高糖DMEM、低糖DMEM或DMEM-F12。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113661977A (zh) * 2021-09-09 2021-11-19 广东圆康再生医学科技开发有限公司 一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法
CN114190366A (zh) * 2021-12-29 2022-03-18 松山湖材料实验室 冻存液及其制备方法与在人正常肝细胞的应用

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