CN109644989A - 一种关节软骨冷冻保护液及软骨冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种关节软骨冷冻保护液，所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉18‑22份、鼠李糖2‑3份、鲸蜡烯1‑2份、微晶纤维素2‑4份、半乳甘露糖4‑6份、胞壁酰二肽4‑6份、三棕榈酰五肽3‑5份、α‑熊果苷0.5‑1.5份、去离子水70份。本发明还提供一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，包括淋洗、滴加部分冷冻保护液、加入剩余冷冻保护液、程序降温。本发明不使用二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；本发明所述关节软骨冷冻保存方法，冷冻保存第8周取出复温后，关节软骨的细胞成活率为82‑85%，第10周关节软骨的细胞成活率为78‑80%。

Description

一种关节软骨冷冻保护液及软骨冷冻保存方法
技术领域
本发明涉及一种关节软骨冷冻保护液及软骨冷冻保存方法，属于生物材料技术领域。
背景技术
随着年龄增长，关节软骨容易受到损伤、磨损，软骨移植是目前治疗软骨损伤的重要的方法之一，经低温冷冻保存的同种异体软移植治疗关节软缺损已经获得了很好的治疗效果，但是生物材料脱离供体后实现长时间的保存很难，随着低温保存技术的不断发展，研究表明在深低温环境中的离体生物材料会逐渐减缓其新陈代谢，甚至停止新陈代谢。
CN104938478A公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法，采用的冷冻保护液，每1000ml包含：99.9％二甲基亚砜150～250ml、乙酰胺110～200g、1,2-丙二醇70～120ml、聚乙二醇10～80g、海藻糖20 ～100g，余为去离子水。使软骨细胞存活率在冷冻保存第8周时仍保持在一个较高水平(由传统组的60％提高到68％)。
CN108835105A公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜200-300份、角鲨烯25-60份、分心木多糖20-35份、四氢澳洲茄胺12-25份、虾青素2-7份、水10-30份；其制备的冷冻保护液，在第8周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达76％，在第10周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达71％。
上述专利虽然在低温保存关节软骨中取得一定的进展，但仍然存在以下不足：
（1）关节软骨的细胞存活率仍然较低，保存时间短；
（2）均采用二甲基亚砜作为主要冷冻保护成分，但DMSO具有细胞毒性和渗透损伤，解冻后需要充分冲洗去除DMSO，但是已进入细胞内的DMSO难以彻底清洗掉。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明提供一种关节软骨冷冻保护液及软骨冷冻保存方法，实现以下发明目的：
（1）不使用二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；
（2）提高复苏后细胞成活率，延长冷冻保存时间。
为实现上述发明目的，采用以下技术方案：
一种关节软骨冷冻保护液，所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉18-22份、鼠李糖2-3份、鲸蜡烯1-2份、微晶纤维素2-4份、半乳甘露糖4-6份、胞壁酰二肽4-6份、三棕榈酰五肽3-5份、α-熊果苷0.5-1.5份、去离子水70份。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉20份、鼠李糖3份、鲸蜡烯2份、微晶纤维素3份、半乳甘露糖5份、胞壁酰二肽5份、三棕榈酰五肽4份、α-熊果苷1份、去离子水70份。
所述冷冻保护液的制备方法为：将各组分混合搅拌均匀后，先在3MPa下进行均质处理3分钟，然后采用超声处理，超声频率为18HZ，时间为10分钟，温度为40℃，超声处理后，调节pH至7，得到稳定的冷冻保护液。
一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，所述冷冻保存方法，包括淋洗、滴加部分冷冻保护液、加入剩余冷冻保护液、程序降温。
所述淋洗，将新鲜的关节软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗1次后，采用冷冻保护液进行淋洗，冷冻保护液提前预冷至3-4℃；冷冻保护液的淋洗流量为2-3ml/min，淋洗时间为4-5分钟。
所述滴加部分冷冻保护液，向关节软骨移植物中，在氮气保护下，滴加部分冷冻保护液，滴加时间为5-7分钟；滴加的冷冻保护液的量占总量的50-55%；冷冻保护液的温度为3-4℃。
所述加入剩余冷冻保护液，加入剩余保护液，2-4℃条件下浸泡10分钟；关节软骨移植物与总的冷冻保护液的体积比为1:2-3。
所述程序降温，先以5-7℃/min的速率降至-20℃，然后以2-5℃/min的速率降低至-60℃，然后以8℃/min的速率降低至-100℃，然后转入液氮中保存。
与现有技术相比，本发明技术方案具有以下有益效果：
（1）本发明不使用二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；
（2）本发明所述关节软骨冷冻保存方法，冷冻保存第8周取出复温后，关节软骨的细胞成活率为82-85%，第10周关节软骨的细胞成活率为78-80%，第12周关节软骨的细胞成活率仍然能维持在70-76%以上。
具体实施方式
实施例1一种关节软骨冷冻保护液
所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：
羧甲基淀粉20份、鼠李糖3份、鲸蜡烯2份、微晶纤维素3份、半乳甘露糖5份、胞壁酰二肽5份、三棕榈酰五肽4份、α-熊果苷1份、去离子水70份。
所述冷冻保护液的制备方法为：
将各组分混合搅拌均匀后，先在3MPa下进行均质处理3分钟，然后采用超声处理，超声频率为18HZ，时间为10分钟，温度为40℃，超声处理后，调节pH至7，得到稳定的冷冻保护液。
实施例2 采用上述冷冻保护液进行关节软骨冷冻保存的方法
包括以下步骤：
（1）淋洗
将新鲜的关节软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗1次后，采用冷冻保护液进行淋洗，冷冻保护液提前预冷至3℃；
冷冻保护液的淋洗流量为2ml/min，淋洗时间为5分钟，冷冻保护液的温度为3℃。
（2）滴加部分冷冻保护液
向关节软骨移植物中，在氮气保护下，滴加部分冷冻保护液，滴加时间为5分钟；滴加的冷冻保护液的量占总量的50%；冷冻保护液的温度为3℃。
（3）加入剩余冷冻保护液
加入剩余保护液，2-3℃条件下浸泡10分钟；转入冷藏管中，做好标记。
关节软骨移植物与总的冷冻保护液的体积比为1:2。
（4）程序降温
将冷藏管放入程序降温机中进行程序降温，先以5℃/min的速率降至-20℃，然后以2℃/min的速率降低至-60℃，然后以8℃/min的速率降低至-100℃，然后转入液氮中保存。
关节软骨复温的方法为：冷冻关节软骨取出后，立即行37℃水浴复温10秒，然后依次投入37℃10％、5％蔗糖溶液中各停留5分钟，最后磷酸盐缓冲液液冲洗1遍，然后用荧光标记法测定关节软骨的细胞存活率。
冷冻保存第8周取出复温后，关节软骨的细胞成活率为85%，第10周关节软骨的细胞成活率为80%，第12周关节软骨的细胞成活率仍然能维持在76%以上。
实施例3 采用上述冷冻保护液进行关节软骨冷冻保存的方法
包括以下步骤：
（1）淋洗
将新鲜的关节软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗1次后，采用冷冻保护液进行淋洗，冷冻保护液提前预冷至4℃；
冷冻保护液的淋洗流量为3ml/min，淋洗时间为4分钟，冷冻保护液的温度为4℃。
（2）滴加部分冷冻保护液
向关节软骨移植物中，在氮气保护下，滴加部分冷冻保护液，滴加时间为7分钟；滴加的冷冻保护液的量占总量的55%；冷冻保护液的温度为4℃。
（3）加入剩余冷冻保护液
加入剩余保护液，4℃条件下浸泡10分钟；转入冷藏管中，做好标记；
关节软骨移植物与总的冷冻保护液的体积比为1:3。
（4）程序降温
将冷藏管放入程序降温机中进行程序降温，先以7℃/min的速率降至-20℃，然后以5℃/min的速率降低至-60℃，然后以8℃/min的速率降低至-100℃，然后转入液氮中保存。
关节软骨复温的方法为：冷冻关节软骨取出后，立即行37℃水浴复温10秒，然后依次投入37℃10％、5％蔗糖溶液中各停留5分钟，最后磷酸盐缓冲液液冲洗1遍，然后用荧光标记法测定关节软骨的细胞存活率。
冷冻保存第8周取出复温后，关节软骨的细胞成活率为82%，第10周关节软骨的细胞成活率为78%，第12周关节软骨的细胞成活率仍然能维持在70%以上。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种关节软骨冷冻保护液，其特征在于：所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉18-22份、鼠李糖2-3份、鲸蜡烯1-2份、微晶纤维素2-4份、半乳甘露糖4-6份、胞壁酰二肽4-6份、三棕榈酰五肽3-5份、α-熊果苷0.5-1.5份、去离子水70份。
2.根据权利要求1所述的一种关节软骨冷冻保护液，其特征在于：所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉20份、鼠李糖3份、鲸蜡烯2份、微晶纤维素3份、半乳甘露糖5份、胞壁酰二肽5份、三棕榈酰五肽4份、α-熊果苷1份、去离子水70份。
3.根据权利要求1所述的一种关节软骨冷冻保护液的制备方法，其特征在于：
所述冷冻保护液的制备方法为：将各组分混合搅拌均匀后，先在3MPa下进行均质处理3分钟，然后采用超声处理，超声频率为18HZ，时间为10分钟，温度为40℃，超声处理后，调节pH至7，得到稳定的冷冻保护液。
4.一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，其特征在于：所述冷冻保存方法，包括淋洗、滴加部分冷冻保护液、加入剩余冷冻保护液、程序降温。
5.根据权利要求4所述的一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，其特征在于：所述淋洗，将新鲜的关节软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗1次后，采用冷冻保护液进行淋洗，冷冻保护液提前预冷至3-4℃；冷冻保护液的淋洗流量为2-3ml/min，淋洗时间为4-5分钟。
6.根据权利要求4所述的一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，其特征在于：所述滴加部分冷冻保护液，向关节软骨移植物中，在氮气保护下，滴加部分冷冻保护液，滴加时间为5-7分钟；滴加的冷冻保护液的量占总量的50-55%；冷冻保护液的温度为3-4℃。
7.根据权利要求4所述的一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，其特征在于：所述加入剩余冷冻保护液，加入剩余保护液，2-4℃条件下浸泡10分钟；关节软骨移植物与总的冷冻保护液的体积比为1:2-3。
8.根据权利要求4所述的一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，其特征在于：所述程序降温，先以5-7℃/min的速率降至-20℃，然后以2-5℃/min的速率降低至-60℃，然后以8℃/min的速率降低至-100℃，然后转入液氮中保存。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110226593A (zh) * 2019-07-30 2019-09-13 葛亮 一种生物组织冷冻保护液
CN111657267A (zh) * 2020-06-17 2020-09-15 科瑞百奥泰州生物技术有限公司 一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法
CN112930902A (zh) * 2021-03-30 2021-06-11 苏州蓝润农业科技有限公司 一种利用微冻技术提高蓝莓嫁接成活率的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0362438A1 (en) * 1988-06-21 1990-04-11 Mathilde Elisabeth Boon Microwave treatment of xenogeneic cartilage transplants
US5166048A (en) * 1981-03-02 1992-11-24 Soll David B Protection of human corneal endothelial cells
CN102308787A (zh) * 2011-07-06 2012-01-11 中国人民解放军第四军医大学 一种软骨保存液
CN104938476A (zh) * 2015-03-02 2015-09-30 泰山医学院 一种骨软骨移植物保存液及其制备方法
CN104938478A (zh) * 2015-05-20 2015-09-30 泰山医学院 一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法
CN106614526A (zh) * 2016-12-30 2017-05-10 潍坊医学院 一种玻璃化冷冻保存软骨的方法
CN107372466A (zh) * 2017-08-30 2017-11-24 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法
CN108835105A (zh) * 2018-09-10 2018-11-20 刘亚莉 一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5166048A (en) * 1981-03-02 1992-11-24 Soll David B Protection of human corneal endothelial cells
EP0362438A1 (en) * 1988-06-21 1990-04-11 Mathilde Elisabeth Boon Microwave treatment of xenogeneic cartilage transplants
CN102308787A (zh) * 2011-07-06 2012-01-11 中国人民解放军第四军医大学 一种软骨保存液
CN104938476A (zh) * 2015-03-02 2015-09-30 泰山医学院 一种骨软骨移植物保存液及其制备方法
CN104938478A (zh) * 2015-05-20 2015-09-30 泰山医学院 一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法
CN106614526A (zh) * 2016-12-30 2017-05-10 潍坊医学院 一种玻璃化冷冻保存软骨的方法
CN107372466A (zh) * 2017-08-30 2017-11-24 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法
CN108835105A (zh) * 2018-09-10 2018-11-20 刘亚莉 一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
韩忠朝: "《造血干细胞理论与移植技术》", 30 November 2000, 河南科学技术出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110226593A (zh) * 2019-07-30 2019-09-13 葛亮 一种生物组织冷冻保护液
CN111657267A (zh) * 2020-06-17 2020-09-15 科瑞百奥泰州生物技术有限公司 一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法
CN111657267B (zh) * 2020-06-17 2021-02-02 科瑞百奥泰州生物技术有限公司 一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法
CN112930902A (zh) * 2021-03-30 2021-06-11 苏州蓝润农业科技有限公司 一种利用微冻技术提高蓝莓嫁接成活率的方法

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