CN108835105A - 一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法 - Google Patents

一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法。所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜200‑300份、角鲨烯25‑60份、分心木多糖20‑35份、四氢澳洲茄胺12‑25份、虾青素2‑7份、水10‑30份。本发明的关节软骨玻璃化冷冻保护液通过角鲨烯、分心木多糖和其他原料发生协同作用，通过实验验证，可有效提升关节软骨的细胞存活率，在第8周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达76%，在第10周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达71%；制备工艺简单，有利于实现工业化生产。

Description

一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法。
背景技术
关节软骨在关节活动中起重要作用。然而，人到一定年龄，人的关节纤维变性、弹性减弱，关节软骨的延伸能力逐渐弱化，恢复原状的能力减弱；关节软骨就容易受到损伤、磨损。软骨移植是目前治疗软骨损伤的十分有前景的修复方法之一。
伴随着低温保存技术的不断发展，研究表明，在低温环境中的离体关节软骨会逐渐减缓其新陈代谢，甚至停止新陈代谢，因此能够使其得以长期保存。但是目前对适用于关节软骨的玻璃化冷冻保护液的研究较少。且采用现有的关节软骨玻璃化冷冻保护液保存关节软骨，在冷冻保存第8周时关节软骨的细胞存活率仅有68％左右，仍需进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种关节软骨玻璃化冷冻保护液，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜200-300份、角鲨烯25-60份、分心木多糖20-35份、四氢澳洲茄胺12-25份、虾青素2-7份、水10-30份；
所述的分心木多糖的制备方法为：用质量分数为3-4％的氢氧化钠溶液提取分心木，得到的提取液中加入胃蛋白酶进行酶解，然后用三氯乙酸去除蛋白，所得物再用质量分数为70-75％的乙醇进行重结晶，即得分心木多糖。
作为本发明进一步的方案：所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜230-270份、角鲨烯35-50份、分心木多糖25-32份、四氢澳洲茄胺15-22份、虾青素3-5份、水14-26份。
作为本发明进一步的方案：所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜250份、角鲨烯42份、分心木多糖28份、四氢澳洲茄胺18份、虾青素4份、水22份。
一种关节软骨玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取分心木多糖、角鲨烯和二甲基亚砜混合，超声震荡处理5-10min后，混合物置于75-85℃下搅拌反应4-6h，搅拌速度为400-600r/min；
(2)将上步所得物置于0-5℃下静置20-30h；然后与四氢澳洲茄胺、虾青素混合，置于85-95℃下搅拌反应20-35min，搅拌速度为800-1000r/min；
(3)上步所得物先采用Co60-γ辐射源进行辐射处理，辐照剂量为20-30GY；再进行紫外线照射处理，照射强度为50-100μW/cm；
(4)将上步所得物与水混合均匀后，置于-50℃至-10℃下冷冻10-20h，再置于室温下静置1-5h，即得关节软骨玻璃化冷冻保护液。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)取分心木多糖、角鲨烯和二甲基亚砜混合，超声震荡处理7min后，混合物置于78℃下搅拌反应5h，搅拌速度为500r/min。
作为本发明进一步的方案：步骤(2)将上步所得物置于2℃下静置26h；然后与四氢澳洲茄胺、虾青素混合，置于90℃下搅拌反应25min，搅拌速度为900r/min。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)上步所得物先采用Co60-γ辐射源进行辐射处理，辐照剂量为25GY；再进行紫外线照射处理，照射强度为80μW/cm。
作为本发明进一步的方案：步骤(4)将上步所得物与水混合均匀后，置于-25℃下冷冻12h，再置于室温下静置3h，即得关节软骨玻璃化冷冻保护液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的关节软骨玻璃化冷冻保护液通过角鲨烯、分心木多糖和其他原料发生协同作用，通过实验验证，可有效提升关节软骨的细胞存活率，在第8周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达76％，在第10周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达71％；制备工艺简单，有利于实现工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种关节软骨玻璃化冷冻保护液，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜200份、角鲨烯60份、分心木多糖20份、四氢澳洲茄胺25份、虾青素2份、水30份；
所述的分心木多糖的制备方法为：用质量分数为3％的氢氧化钠溶液提取分心木，得到的提取液中加入胃蛋白酶进行酶解，然后用三氯乙酸去除蛋白，所得物再用质量分数为75％的乙醇进行重结晶，即得分心木多糖。
一种关节软骨玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取分心木多糖、角鲨烯和二甲基亚砜混合，超声震荡处理5min后，混合物置于85℃下搅拌反应4h，搅拌速度为600r/min；
(2)将上步所得物置于0℃下静置30h；然后与四氢澳洲茄胺、虾青素混合，置于85℃下搅拌反应35min，搅拌速度为800r/min；
(3)上步所得物先采用Co60-γ辐射源进行辐射处理，辐照剂量为20GY；再进行紫外线照射处理，照射强度为100μW/cm；
(4)将上步所得物与水混合均匀后，置于-50℃下冷冻20h，再置于室温下静置1h，即得关节软骨玻璃化冷冻保护液。
实施例2
一种关节软骨玻璃化冷冻保护液，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜300份、角鲨烯25份、分心木多糖35份、四氢澳洲茄胺12份、虾青素7份、水10份；
所述的分心木多糖的制备方法为：用质量分数为4％的氢氧化钠溶液提取分心木，得到的提取液中加入胃蛋白酶进行酶解，然后用三氯乙酸去除蛋白，所得物再用质量分数为70％的乙醇进行重结晶，即得分心木多糖。
一种关节软骨玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取分心木多糖、角鲨烯和二甲基亚砜混合，超声震荡处理10min后，混合物置于75℃下搅拌反应6h，搅拌速度为400r/min；
(2)将上步所得物置于5℃下静置20h；然后与四氢澳洲茄胺、虾青素混合，置于95℃下搅拌反应20min，搅拌速度为1000r/min；
(3)上步所得物先采用Co60-γ辐射源进行辐射处理，辐照剂量为30GY；再进行紫外线照射处理，照射强度为50μW/cm；
(4)将上步所得物与水混合均匀后，置于-10℃下冷冻10h，再置于室温下静置5h，即得关节软骨玻璃化冷冻保护液。
实施例3
一种关节软骨玻璃化冷冻保护液，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜250份、角鲨烯42份、分心木多糖28份、四氢澳洲茄胺18份、虾青素4份、水22份。
所述的分心木多糖的制备方法为：用质量分数为3.5％的氢氧化钠溶液提取分心木，得到的提取液中加入胃蛋白酶进行酶解，然后用三氯乙酸去除蛋白，所得物再用质量分数为72％的乙醇进行重结晶，即得分心木多糖。
一种关节软骨玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取分心木多糖、角鲨烯和二甲基亚砜混合，超声震荡处理7min后，混合物置于78℃下搅拌反应5h，搅拌速度为500r/min。
(2)将上步所得物置于2℃下静置26h；然后与四氢澳洲茄胺、虾青素混合，置于90℃下搅拌反应25min，搅拌速度为900r/min。
(3)上步所得物先采用Co60-γ辐射源进行辐射处理，辐照剂量为25GY；再进行紫外线照射处理，照射强度为80μW/cm。
(4)将上步所得物与水混合均匀后，置于-25℃下冷冻12h，再置于室温下静置3h，即得关节软骨玻璃化冷冻保护液。
实施例4
与实施例1不同的是。所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜230份、角鲨烯50份、分心木多糖25份、四氢澳洲茄胺22份、虾青素3份、水26份。
实施例5
与实施例1不同的是。所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜270份、角鲨烯35份、分心木多糖32份、四氢澳洲茄胺15份、虾青素5份、水14份。
实施例6
实施例1-5任一制备的关节软骨玻璃化冷冻保护液的使用方法为：通过加酸或碱调节关节软骨玻璃化冷冻保护液的pH值至7；把新鲜关节骨软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗1-3次；将关节骨软骨移植物在3℃下经玻璃化冷冻保护溶液处理，浸泡5-8分钟，用冷藏管封装，做好标记，然后直接以最快速度投入液氮中保存。
对比例1
除原料中不含有角鲨烯和分心木多糖外，其他制备工艺均与实施例3一致。
对比例2
除原料中仅含有角鲨烯和分心木多糖，以及制备关节软骨玻璃化冷冻保护液必需的二甲基亚砜270份外，其他制备工艺均与实施例3一致。
对比例3
除原料中仅含有角鲨烯，以及制备关节软骨玻璃化冷冻保护液必需的二甲基亚砜270份外，其他制备工艺均与实施例3一致。
对比例4
除原料中仅含有分心木多糖，以及制备关节软骨玻璃化冷冻保护液必需的二甲基亚砜270份外，其他制备工艺均与实施例3一致。
对比例5
与实施例3相比，缺少步骤(3)。
对比例6
申请号为201510257292.1，授权公告号为CN 104938478 B的中国发明专利公开的一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法。
实验例
使用实施例3和对比例1-6的关节软骨玻璃化冷冻保护液保存关节软骨。分别测试第2、4、6、8、10周将关节软骨复温后关节软骨的细胞存活率。
其中，实施例3和对比例1-5的关节软骨玻璃化冷冻保护液的使用方法为：通过加酸或碱调节关节软骨玻璃化冷冻保护液的pH值至7；把新鲜关节骨软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗1-3次；将关节骨软骨移植物在3℃下经玻璃化冷冻保护溶液处理，浸泡5-8分钟，用冷藏管封装，做好标记，然后直接以最快速度投入液氮中保存。
对比例6的关节软骨玻璃化冷冻保护液的使用方法参照申请号为201510257292.1，授权公告号为CN 104938478 B的中国发明专利公开的软骨保存方法。
将关节软骨复温的方法为：冷冻关节软骨取出后，立即行37℃水浴复温10秒，然后依次投入37℃10％、5％蔗糖溶液中各停留5分钟，最后磷酸盐缓冲液液冲洗3遍。然后用荧光标记法测定关节软骨的细胞存活率，实验结果见表1。
表1
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (8)

1.一种关节软骨玻璃化冷冻保护液，其特征在于，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜200-300份、角鲨烯25-60份、分心木多糖20-35份、四氢澳洲茄胺12-25份、虾青素2-7份、水10-30份；
所述的分心木多糖的制备方法为：用质量分数为3-4％的氢氧化钠溶液提取分心木，得到的提取液中加入胃蛋白酶进行酶解，然后用三氯乙酸去除蛋白，所得物再用质量分数为70-75%的乙醇进行重结晶，即得分心木多糖。
2.根据权利要求1所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液，其特征在于，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜230-270份、角鲨烯35-50份、分心木多糖25-32份、四氢澳洲茄胺15-22份、虾青素3-5份、水14-26份。
3.根据权利要求1所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液，其特征在于，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜250份、角鲨烯42份、分心木多糖28份、四氢澳洲茄胺18份、虾青素4份、水22份。
4.一种根据权利要求1-3任一所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取分心木多糖、角鲨烯和二甲基亚砜混合，超声震荡处理5-10min后，混合物置于75-85℃下搅拌反应4-6h，搅拌速度为400-600r/min；
（2）将上步所得物置于0-5℃下静置20-30h；然后与四氢澳洲茄胺、虾青素混合，置于85-95℃下搅拌反应20-35min，搅拌速度为800-1000r/min；
（3）上步所得物先采用Co60-γ辐射源进行辐射处理，辐照剂量为20-30GY；再进行紫外线照射处理，照射强度为50-100µW/cm；
（4）将上步所得物与水混合均匀后，置于-50℃至-10℃下冷冻10-20h，再置于室温下静置1-5h，即得关节软骨玻璃化冷冻保护液。
5.根据权利要求4所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，步骤（1）取分心木多糖、角鲨烯和二甲基亚砜混合，超声震荡处理7min后，混合物置于78℃下搅拌反应5h，搅拌速度为500r/min。
6.根据权利要求4所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，步骤（2）将上步所得物置于2℃下静置26h；然后与四氢澳洲茄胺、虾青素混合，置于90℃下搅拌反应25min，搅拌速度为900r/min。
7.根据权利要求4所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，步骤（3）上步所得物先采用Co60-γ辐射源进行辐射处理，辐照剂量为25GY；再进行紫外线照射处理，照射强度为80µW/cm。
8.根据权利要求4所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，步骤（4）将上步所得物与水混合均匀后，置于-25℃下冷冻12h，再置于室温下静置3h，即得关节软骨玻璃化冷冻保护液。
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