JP7038369B2 - ウシ生殖細胞の凍結保存用組成物及び凍結保存方法 - Google Patents
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Description
下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50~99モル%である両性高分子電解質(不凍ポリアミノ酸)とグリセリンとを含む、ウシ精子などウシ生殖細胞の凍結保存用組成物、及び、これを用いる凍結保存方法。
1-1.凍結保存溶液の調製
ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)の25%水溶液に、モル%で65%の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル%についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。
種雄牛から採取した精液は、精子の数・運動性等を検査した後、1次希釈液(「1-1.」で用いたダルベッコ改変培地)で5倍程度に希釈した後、低温室(4℃)にて静置し、ゆっくり冷却した。精液の温度が4℃程度まで下がった段階で1次希釈液にて最終希釈量の半量まで点滴にて希釈した。その後、4℃程の温度を維持しつつ、耐凍剤の入った2次希釈液(「1-1.」で得られた「凍結保存溶液」)を点滴にて最終希釈量まで希釈し、凍結保存用ストロー(富士平工業株式会社製品「0.5ml 細133型」、径4mm×133mm)に分注・注入した。その後暫く静置し、プログラムフリーザーを用いた冷却速度100℃/分以下の緩慢凍結法で-150℃前後まで冷却・凍結してから、液体窒素中に保存した(2次希釈液中の耐凍剤の添加量 グリセリン:13v/v%:従来型、グリセリン6.5v/v%+CPLL1.0w/v%:新規型)。
凍結保存したウシ精子の凍結融解後の生存性の結果を以下の表1に示す。
目的:
凍結融解直後の精子生存性に差異がみられなかったが(表1)、人工授精による受胎率には差異が認められたことから(表2)、その要因を検索した。
従来法(6.5%グリセリン)または新規法(3.25%グリセリン+0.5%CPLL)により凍結され、融解されたそれぞれの精子を、6時間保温保存した後、精子の運動性を調査した。ウシ精子の運動性評価には、精子運動解析装置(CASA;SMAS 3、ディテクト製)および測定用チャンバー(MicroCell、Vitrolife 製)を使用して、37℃で精子運動パラメータ(運動率 Mot、前進運動率 Prog、直線速度 VSL、曲線速度 VCL、平均速度 VAP、頭部振幅AHL、頭部振動数BCF)を測定した。VAP>10μm/secを運動精子、VAP>50μm/sec かつ STR>0.75を前進運動精子とした。
結果を以下の表3に示す。
凍結融解直後の精子の生存性(運動性)には差異が無いものの、融解して一定時間経過した精子の生存性に差異が認められた。
目的:
凍結融解直後の精子生存性に差異がみられなかったが(表1)、融解6時間後の精子生存性に差異が認められたことから(表3)、その要因を検索した。
従来法(6.5%グリセリン)または新規法(3.25%グリセリン+0.5%CPLL)により凍結され、融解されたそれぞれの精子をSYBR14とpropidium iodide(PI)で染色を行い、精子頭部細胞膜の障害を調査した。
結果を以下の表4に示す。
凍結融解6時間後の精子の生存性に差異が認められた要因の一つは、凍結融解による精子細胞膜へのダメージによるものと推測される。
2-1.凍結保存溶液の調製
ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)の25%水溶液に、モル%で65%の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル%についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。
桑実胚から胚盤胞期胚に成長したウシ胚は、20%ウシ胎子血清を加えたPBSで洗浄した後、CPLLを加えた凍結保存液に浸漬し、ただちに0.25mlの凍結保存用ストロー(IMV製)に凍結液とともに封入された(図1)。封入後、10分~20分の平衡処理後、プログラムフリーザーにより冷却速度100℃/分以下の緩慢凍結法で-30℃まで冷却した後、液体窒素中に浸漬することで凍結が行われた。凍結後は使用まで液体窒素中で保存された。
凍結保存したウシ胚の凍結融解後の生存性の結果を以下の表5に示す。
3-1.凍結保存溶液の調製
ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)の25%水溶液に、モル%で65%の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル%についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。
組織培養用フラスコ(ディッシュ)でコンフルエントまで培養されたウシ体細胞は、PBS洗浄、トリプシンによる酵素処理等定法によって回収された。回収されたウシ体細胞は、凍結保存用チューブ(1.0ml用、ファルコン製)中の凍結保存液に浸漬され、ただちに-80℃ディープフリーザー内に置かれ、凍結および保存された(長期保存の場合は液体窒素中で保管)。
凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解直後の生存性の結果を以下の表8に示す。また、凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解後の細胞増殖性の結果を以下の表9に示す。さらに、凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解後に播種した接着細胞数(凍結保護剤除去後播種)を図2に示す。
Claims (8)
- ダルベッコ改変培地(DMEM)、イーグルのMEM培地(MEM)、その他の細胞用培養液、または、その他の生理的溶液に、不凍ポリアミノ酸及びグリセリンが添加されるとともにpHが7.0~8.0の範囲内になるように調整され、さらに、ウシ精液に由来する液体が5~20w/w%となるように添加された水溶液である、請求項1記載のウシ精子の凍結保存液。
- 下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50~99モル%である両性高分子電解質(不凍ポリアミノ酸)と、グリセリンとを添加した生理的溶液により、ウシの精液を5~20倍に希釈することで、0.3~0.9w/w%の両性高分子電解質(不凍ポリアミノ酸)と、2~4w/w%のグリセリンと、ウシの精液に由来する部分とを含有する凍結保存液中にウシ精子を懸濁させるようにする希釈工程と、
ウシ精子を懸濁させた凍結保存液を、管状の容器中にて凍結に供する工程と、
この後、-60℃以下の温度に保持することで保存を行う工程とを含む、ウシ精子の凍結保存方法。
- 前記希釈工程は、
ウシの精液を、生理的溶液により2.5~10倍に希釈し、2~8℃で保持する1次希釈工程と、
2~8℃で保持しつつ、1次希釈工程により得られた懸濁液に、両性高分子電解質(不凍ポリアミノ酸)とグリセリンとを添加した生理的溶液を点滴により添加することで、さらに希釈することにより、ウシの精液が5~20倍に希釈されるようにする2次希釈工程とを含む、請求項3記載のウシ精子の凍結保存方法。 - 径が5mm以下である凍結保存用ストローを用い、-140℃以下にまで冷却することを特徴とする請求項3または4に記載のウシ精子の凍結保存方法。
- 凍結融解6時間後にて、運動精子率を30%以上とし、高速直進運動率を10%以上とすることができる請求項3~5のいずれかに記載のウシ精子の凍結保存方法。
- 請求項7の凍結保存液により、冷却速度100℃/分以下の緩慢凍結法で冷却及び凍結を行う、ウシ胚の凍結保存方法。
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