CN113957039A - 一种冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，将新鲜牛睾丸组织进行程序化冷冻或玻璃化冷冻；将牛睾丸组织进行冷冻复苏，然后制备单细胞悬液；利用制备的单细胞悬液制备饲养层细胞；利用制备的饲养层细胞进行支持细胞与生精细胞共培养。与现有技术相比，本发明能有效的保证一次性采集足够的样品，并在低温条件下储藏和运输，且能利用冷冻复苏后的样品进行酶消化得到活率较高的生精细胞。经过冷冻复苏后的生精细胞，能在体外进行长期的培养与传代，为后续的细胞实验奠定了基础。具有操作简单、不受时间和距离限制的特点，能减少采样次数与成本。
Description
技术领域
本发明涉及生精细胞冷冻保存及其解冻培养增殖技术领域，特别是一种冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法。
背景技术
目前牛生精细胞体外培养主要采用新鲜睾丸组织，从屠宰场或养殖场采样，放置在冰上，并在短时间内运输到实验室，采用酶消化法得到单细胞悬液并进行后续细胞分离与培养实验。在组织、细胞长期冷冻保存中，玻璃化冷冻与程序化冷冻得到广泛的运用，但其效果由于物种的差异出现差异。
但是由于距离采样地较远时无法保证在短时间内运输到实验室进行处理；常规的组织冷冻仅将组织样品投入液氮罐中进行保存，在没有添加冷冻保护剂的情况下，无法保证复苏后能得到生精细胞，无法进行后续的细胞培养。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，包括以下步骤：
S1、将新鲜牛睾丸组织进行程序化冷冻或玻璃化冷冻；
S2、将牛睾丸组织进行冷冻复苏，然后制备单细胞悬液；
S3、利用制备的单细胞悬液制备饲养层细胞；
S4、利用制备的饲养层细胞进行支持细胞与生精细胞共培养。
进一步地，所述步骤S1中程序化冷冻的具体步骤为：
S1A1、将新鲜牛睾丸组织收集在无菌0.9％NaCl溶液中，并在融化的冰上运送至实验室；
S1A2、将三个直径100毫米的无菌培养皿放在冰上，并用5mL的DMEM/F12装满，使用无菌镊子将新鲜睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第一个培养皿中；
S1A3、将将新鲜牛睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第二个培养皿中；
S1A4、用无菌剪刀或手术刀将将新鲜牛睾丸组织分为4cm3的碎片，去除残留的白膜，并保留一个新鲜牛睾丸组织碎片作为新鲜对照；
S1A5、将剪好的新鲜牛睾丸组织碎片转移到装有DMEM/F12的最后一个培养皿中；
S1A6、将冷冻管置于4℃，用800μL冷冻保护剂分别填充15个冷冻管，在每个冷冻管中装入四个剪好的新鲜牛睾丸组织碎片，并标记冷冻管；
S1A7、将冷冻管在4℃下孵育15分钟；
S1A8、将冷冻管放入Mr.Frosty冷冻容器中，并将冷冻容器置于-80℃的冰箱中孵育4-8h；
S1A9、孵育后，转移到液氮中长期保存。
进一步地，所述步骤S1中玻璃化冷冻的具体步骤为：
S1B1、将新鲜牛睾丸组织收集在无菌0.9％NaCl溶液中，并在融化的冰上运送至实验室；
S1B2、将三个直径100毫米的无菌培养皿放在冰上，并用5mL的DMEM/F12装满，使用无菌镊子将新鲜牛睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第一个培养皿中；
S1B3、将将新鲜牛睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第二个培养皿中；
S1B4、用无菌剪刀或手术刀将新鲜牛睾丸组织分为4cm3的碎片，去除残留的白膜，并保留一个新鲜牛睾丸组织碎片作为新鲜对照；
S1B5、将剪好的新鲜牛睾丸组织碎片转移到装有DMEM/F12的最后一个培养皿中；
S1B6、将冷冻管置于4℃，用800μL、50％冷冻保护剂分别填充15个冷冻管，在每个冷冻管中装入四个剪好的新鲜牛睾丸组织碎片，在室温下放置10分钟；
S1B7、去除上清液，并在15个冷冻管中分别加入800μL、100％冷冻保护剂，在室温下放置5分钟；
S1B8、去除上清液，每个冷冻管中加入800μL玻璃化冷冻液；
S1B9、将冷冻管在液氮的气相中熏蒸15min，然后浸入液氮中保存。
进一步地，所述步骤S2中，冷冻复苏的具体步骤为：
1)在37℃的水浴中解冻牛睾丸组织碎片，直到所有冰融化为止；
2)用70％乙醇大量喷洒冷冻管；
3)用添加了体积比为10％的FBS的DMEM/F12将冷冻管内的液体体积加倍，从而稀释冷冻保护剂，并在4℃下孵育5分钟；
4)将冷冻管内的牛睾丸组织碎片转移到新的DMEM/F12中来去除CPA，完成冷冻复苏。
进一步地，所述步骤S2中，冷冻复苏的具体步骤为：
(1)通过在预热至37℃的复苏液1(DMEM/F12+0.5mol/L蔗糖+20％FBS)中温育2min来解冻牛睾丸组织碎片，复苏液1由DMEM/F12+0.5mol/L蔗糖+20％FBS组成；
(2)除去上清液，每个冷冻管中加入800μL复苏液2(90％DMEM/F12+20％FBS)孵育2min后，完成冷冻复苏，复苏液2由90％DMEM/F12+20％FBS组成。
进一步地，所述步骤S2中，制备单细胞悬液具体步骤为：
S21、提前将水浴锅设定为37℃，冷冻离心机温度降到4℃；
S22、将冷冻复苏的牛睾丸组织转移50ml离心管中；
S23、加入1mg/mL的Ⅳ型胶原蛋白酶和1μg/mL的DnaseⅠ混匀，用封口膜将管口封上；
S24、将冷冻离心机的离心管放入水浴摇床，37℃，225rpm孵育40-50min；
S25、向冷冻离心机的离心管中加入等体积的DPBS稀释酶的浓度，从而终止消化；
S26、用剪刀将枪头斜着剪一刀，随后反复吹打细胞悬液30-50次，使生精细胞从曲细精管中释放出来；
S27、将细胞悬液先后用0.105mm的细胞筛和70μm的滤膜过滤到新的离心管中，在300g、4℃离心5min；
S29、用5ml的DPBS重悬浮细胞悬液，形成单细胞悬液。
进一步地，所述步骤S3中制备饲养层细胞的具体步骤为：
将单细胞悬液在300g、4℃离心5min，用2-3mL基础细胞培养液重悬浮生精细胞，并吹打混匀；将重悬浮以后的细胞接种在6孔板中，放入37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h以后，将未贴壁的细胞从6孔板中上清液吸除，转移到另外的6孔板中培养；已经贴壁的细胞，每孔加入1mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，放入培养箱中消化2-4分钟，消化完全以后用等体积的细胞培养液终止消化；将消化以后的细胞在300g、4℃离心5min，随后用细胞培养液重悬浮，并重新接种在6孔板中，放入培养箱中培养；后续待支持细胞覆盖80-90％时，进行传代。
进一步地，所述步骤S4具体包括：将制备支持细胞饲养层过程中吸出的悬浮细胞接种到传代以后的支持细胞上，放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，观察细胞生长状况，在培养24-48h以后换新的培养，后续进行传代培养。
与现有技术相比，本发明能有效的保证一次性采集足够的样品，并在低温条件下储藏和运输，且能利用冷冻复苏后的样品进行酶消化得到活率较高的生精细胞。经过冷冻复苏后的生精细胞，能在体外进行长期的培养与传代，为后续的细胞实验奠定了基础。具有操作简单、不受时间和距离限制的特点，能减少采样次数与成本。
附图说明
图1为PF与VF组培养两周悬浮生精细胞DDX4染色：A、B、C分别为PF组细胞在DDX4、DAPI及其合并的细胞图；D、E、F分别为VF组细胞在DDX4、DAPI及其合并的细胞图；标尺：50μm。
图2为PF与VF组培养两周悬浮细胞GFRA1染色：A、B、C分别为PF组细胞在GFRA1、DAPI及其合并的细胞图；D、E、F分别为VF组细胞在GFRA1、、DAPI及其合并的细胞图；标尺：50μm。
图3为支持细胞与生精细胞共培养：(a)第2代牦牛生精细胞；(b)：第4代牦牛生精细胞；(c)：第9代牦牛生精细胞；比例尺：50μm。
图4为标志基因相对定量表达RT-qPCR分析，其中*表示p<0.05。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
将新鲜牛睾丸组织收集在无菌0.9％NaCl溶液中，并在融化的冰上运送至实验室；
将三个直径100毫米的无菌培养皿放在冰上，并用5mL的DMEM/F12装满，使用无菌镊子将新鲜睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第一个培养皿中；
将将新鲜牛睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第二个培养皿中；
用无菌剪刀或手术刀将将新鲜牛睾丸组织分为4cm3的碎片，去除残留的白膜，并保留一个新鲜牛睾丸组织碎片作为新鲜对照；
将剪好的新鲜牛睾丸组织碎片转移到装有DMEM/F12的最后一个培养皿中；
将冷冻管置于4℃，用800μL冷冻保护剂分别填充15个冷冻管，在每个冷冻管中装入四个剪好的新鲜牛睾丸组织碎片，并标记冷冻管；
将冷冻管在4℃下孵育15分钟；
将冷冻管放入Mr.Frosty冷冻容器中，并将冷冻容器置于-80℃的冰箱中孵育4-8h；
孵育后，转移到液氮中长期保存；
在37℃的水浴中解冻牛睾丸组织碎片，直到所有冰融化为止；
用70％乙醇大量喷洒冷冻管；
用添加了体积比为10％的FBS的DMEM/F12将冷冻管内的液体体积加倍，从而稀释冷冻保护剂，并在4℃下孵育5分钟；
将冷冻管内的牛睾丸组织碎片转移到新的DMEM/F12中来去除CPA，完成冷冻复苏；
提前将水浴锅设定为37℃，冷冻离心机温度降到4℃；
将冷冻复苏的牛睾丸组织转移50ml离心管中；
加入1mg/mL的Ⅳ型胶原蛋白酶和1μg/mL的DnaseⅠ混匀，用封口膜将管口封上；
将冷冻离心机的离心管放入水浴摇床，37℃，225rpm孵育40-50min；
向冷冻离心机的离心管中加入等体积的DPBS稀释酶的浓度，从而终止消化；
用剪刀将枪头斜着剪一刀，随后反复吹打细胞悬液30-50次，使生精细胞从曲细精管中释放出来；
将细胞悬液先后用0.105mm的细胞筛和70μm的滤膜过滤到新的离心管中，在300g、4℃离心5min；
用5ml的DPBS重悬浮细胞悬液，形成单细胞悬液，随后进行台盼蓝染色和细胞计数。
将单细胞悬液在300g、4℃离心5min，用2-3mL基础细胞培养液重悬浮生精细胞，并吹打混匀；将重悬浮以后的细胞接种在6孔板中，放入37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h以后，将未贴壁的细胞从6孔板中上清液吸除，转移到另外的6孔板中培养；已经贴壁的细胞，每孔加入1mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，放入培养箱中消化2-4分钟，消化完全以后用等体积的细胞培养液终止消化；将消化以后的细胞在300g、4℃离心5min，随后用细胞培养液重悬浮，并重新接种在6孔板中，放入培养箱中培养；后续待支持细胞覆盖80-90％时，进行传代。
将制备支持细胞饲养层过程中吸出的悬浮细胞接种到传代以后的支持细胞上，放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，观察细胞生长状况，在培养24-48h以后换新的培养，后续进行传代培养。
实施例2
将新鲜牛睾丸组织收集在无菌0.9％NaCl溶液中，并在融化的冰上运送至实验室；
将三个直径100毫米的无菌培养皿放在冰上，并用5mL的DMEM/F12装满，使用无菌镊子将新鲜牛睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第一个培养皿中；
将将新鲜牛睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第二个培养皿中；
用无菌剪刀或手术刀将新鲜牛睾丸组织分为4cm3的碎片，去除残留的白膜，并保留一个新鲜牛睾丸组织碎片作为新鲜对照；
将剪好的新鲜牛睾丸组织碎片转移到装有DMEM/F12的最后一个培养皿中；
将冷冻管置于4℃，用800μL、50％冷冻保护剂分别填充15个冷冻管，在每个冷冻管中装入四个剪好的新鲜牛睾丸组织碎片，在室温下放置10分钟；
去除上清液，并在15个冷冻管中分别加入800μL、100％冷冻保护剂，在室温下放置5分钟；
去除上清液，每个冷冻管中加入800μL玻璃化冷冻液；
将冷冻管在液氮的气相中熏蒸15min，然后浸入液氮中保存；
通过在预热至37℃的复苏液1(DMEM/F12+0.5mol/L蔗糖+20％FBS)中温育2min来解冻牛睾丸组织碎片，复苏液1由DMEM/F12+0.5mol/L蔗糖+20％FBS组成；
除去上清液，每个冷冻管中加入800μL复苏液2(90％DMEM/F12+20％FBS)孵育2min后，完成冷冻复苏，复苏液2由90％DMEM/F12+20％FBS组成；
提前将水浴锅设定为37℃，冷冻离心机温度降到4℃；
将冷冻复苏的牛睾丸组织转移50ml离心管中；
加入1mg/mL的Ⅳ型胶原蛋白酶和1μg/mL的DnaseⅠ混匀，用封口膜将管口封上；
将冷冻离心机的离心管放入水浴摇床，37℃，225rpm孵育40-50min；
向冷冻离心机的离心管中加入等体积的DPBS稀释酶的浓度，从而终止消化；
用剪刀将枪头斜着剪一刀，随后反复吹打细胞悬液30-50次，使生精细胞从曲细精管中释放出来；
将细胞悬液先后用0.105mm的细胞筛和70μm的滤膜过滤到新的离心管中，在300g、4℃离心5min；
用5ml的DPBS重悬浮细胞悬液，形成单细胞悬液，随后进行台盼蓝染色和细胞计数。对比实施例1中的生精细胞冷冻复苏后活率统计如表1所示。
表1
从冷冻复苏后的睾丸组织中能获得大量的生精细胞，并且有较高的活率，其中以玻璃化冷冻为最优。在玻璃化冷冻复苏后生精细胞活率最高。
将单细胞悬液在300g、4℃离心5min，用2-3mL基础细胞培养液重悬浮生精细胞，并吹打混匀；将重悬浮以后的细胞接种在6孔板中，放入37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h以后，将未贴壁的细胞从6孔板中上清液吸除，转移到另外的6孔板中培养；已经贴壁的细胞，每孔加入1mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，放入培养箱中消化2-4分钟，消化完全以后用等体积的细胞培养液终止消化；将消化以后的细胞在300g、4℃离心5min，随后用细胞培养液重悬浮，并重新接种在6孔板中，放入培养箱中培养；后续待支持细胞覆盖80-90％时，进行传代。
通过细胞免疫荧光染色对程序化冷冻(PF)与玻璃化冷冻组(VF)在消化分离得到的细胞培养两周进行鉴定，精原干细胞的抗体选用Anti-GDNF Receptor alpha 1/GFRA1，生精细胞抗体选用Anti-DDX4。发现在没有添加外源生长因子，仅用基础细胞培养基的条件下，悬浮细胞中仍然含有一定数量的精原干细胞(图1和图2)。
玻璃化冷冻的牦牛睾丸组织复苏后进行支持细胞与生精细胞制备。将制备支持细胞饲养层过程中吸出的悬浮细胞接种到传代以后的支持细胞上，放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，观察细胞生长状况，在培养24-48h以后换新的培养液，后续进行传代培养。支持细胞与生精细胞共培养的形态图如图3所示。在生精细胞传到第二代时(培养的第11天)就已经开始展现(图3,a)，在传到第4代的时候(培养的第20天)细胞聚团的现象更加明显，可以在培养基中看见大量的细胞团块，并有向中间靠拢的趋势(图3,b)。在SSCs培养到第9代(第56天)，细胞基本全部聚集在中间部分，在孔的边缘只有少数的单个细胞(图3,c)。
如图2所示为冷冻复苏后悬浮细胞培养30天，精原干细胞标志基因表达RT-qPCR相对定量表达分析。其中mix为将牦牛支持细胞与生精细胞混合培养组、new为新分离得到的细胞混合液、sertoli为经差速贴壁后获得的贴壁细胞(支持细胞)、SSC为单独培养30天的悬浮细胞(生精细胞)。数据以β-actin为内参，以new组的表达量设为1，利用two-way ANOVA分析RT-qPCR结果。从图4中可以看出冷冻复苏后的生精细胞与支持细胞共培养30天以后，可以看见细胞聚团形成细胞簇，随后收集悬浮的生精细胞，利用q-PCR鉴定标志基因表达，并与刚冷冻复苏后的悬浮细胞做相对定量表达分析发现。精原干细胞标志基因相对表达量显著升高，表明生精细胞能有效冷冻保存，并在复苏后能长期培养。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将新鲜牛睾丸组织进行程序化冷冻或玻璃化冷冻；
S2、将牛睾丸组织进行冷冻复苏，然后制备单细胞悬液；
S3、利用制备的单细胞悬液制备饲养层细胞；
S4、利用制备的饲养层细胞进行支持细胞与生精细胞共培养。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤S1中程序化冷冻的具体步骤为：
S1A1、将新鲜牛睾丸组织收集在无菌0.9％NaCl溶液中，并在融化的冰上运送至实验室；
S1A2、将三个直径100毫米的无菌培养皿放在冰上，并用5mL的DMEM/F12装满，使用无菌镊子将新鲜睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第一个培养皿中；
S1A3、将将新鲜牛睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第二个培养皿中；
S1A4、用无菌剪刀或手术刀将将新鲜牛睾丸组织分为4cm3的碎片，去除残留的白膜，并保留一个新鲜牛睾丸组织碎片作为新鲜对照；
S1A5、将剪好的新鲜牛睾丸组织碎片转移到装有DMEM/F12的最后一个培养皿中；
S1A6、将冷冻管置于4℃，用800μL冷冻保护剂分别填充15个冷冻管，在每个冷冻管中装入四个剪好的新鲜牛睾丸组织碎片，并标记冷冻管；
S1A7、将冷冻管在4℃下孵育15分钟；
S1A8、将冷冻管放入Mr.Frosty冷冻容器中，并将冷冻容器置于-80℃的冰箱中孵育4-8h；
S1A9、孵育后，转移到液氮中长期保存。
3.根据权利要求1所述的冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤S1中玻璃化冷冻的具体步骤为：
S1B1、将新鲜牛睾丸组织收集在无菌0.9％NaCl溶液中，并在融化的冰上运送至实验室；
S1B2、将三个直径100毫米的无菌培养皿放在冰上，并用5mL的DMEM/F12装满，使用无菌镊子将新鲜牛睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第一个培养皿中；
S1B3、将将新鲜牛睾丸组织转移到装有DMEM/F12的第二个培养皿中；
S1B4、用无菌剪刀或手术刀将新鲜牛睾丸组织分为4cm3的碎片，去除残留的白膜，并保留一个新鲜牛睾丸组织碎片作为新鲜对照；
S1B5、将剪好的新鲜牛睾丸组织碎片转移到装有DMEM/F12的最后一个培养皿中；
S1B6、将冷冻管置于4℃，用800μL、50％冷冻保护剂分别填充15个冷冻管，在每个冷冻管中装入四个剪好的新鲜牛睾丸组织碎片，在室温下放置10分钟；
S1B7、去除上清液，并在15个冷冻管中分别加入800μL、100％冷冻保护剂，在室温下放置5分钟；
S1B8、去除上清液，每个冷冻管中加入800μL玻璃化冷冻液；
S1B9、将冷冻管在液氮的气相中熏蒸15min，然后浸入液氮中保存。
4.根据权利要求2所述的冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，冷冻复苏的具体步骤为：
1)在37℃的水浴中解冻牛睾丸组织碎片，直到所有冰融化为止；
2)用70％乙醇大量喷洒冷冻管；
3)用添加了体积比为10％的FBS的DMEM/F12将冷冻管内的液体体积加倍，从而稀释冷冻保护剂，并在4℃下孵育5分钟；
4)将冷冻管内的牛睾丸组织碎片转移到新的DMEM/F12中来去除CPA，完成冷冻复苏。
5.根据权利要求3所述的冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，冷冻复苏的具体步骤为：
(1)通过在预热至37℃的复苏液1(DMEM/F12+0.5mol/L蔗糖+20％FBS)中温育2min来解冻牛睾丸组织碎片，复苏液1由DMEM/F12+0.5mol/L蔗糖+20％FBS组成；
(2)除去上清液，每个冷冻管中加入800μL复苏液2(90％DMEM/F12+20％FBS)孵育2min后，完成冷冻复苏，复苏液2由90％DMEM/F12+20％FBS组成。
6.根据权利要求1所述的冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，制备单细胞悬液具体步骤为：
S21、提前将水浴锅设定为37℃，冷冻离心机温度降到4℃；
S22、将冷冻复苏的牛睾丸组织转移50ml离心管中；
S23、加入1mg/mL的Ⅳ型胶原蛋白酶和1μg/mL的DnaseⅠ混匀，用封口膜将管口封上；
S24、将冷冻离心机的离心管放入水浴摇床，37℃，225rpm孵育40-50min；
S25、向冷冻离心机的离心管中加入等体积的DPBS稀释酶的浓度，从而终止消化；
S26、用剪刀将枪头斜着剪一刀，随后反复吹打细胞悬液30-50次，使生精细胞从曲细精管中释放出来；
S27、将细胞悬液先后用0.105mm的细胞筛和70μm的滤膜过滤到新的离心管中，在300g、4℃离心5min；
S29、用5ml的DPBS重悬浮细胞悬液，形成单细胞悬液。
7.根据权利要求6所述的冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤S3中制备饲养层细胞的具体步骤为：
将单细胞悬液在300g、4℃离心5min，用2-3mL基础细胞培养液重悬浮生精细胞，并吹打混匀；将重悬浮以后的细胞接种在6孔板中，放入37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h以后，将未贴壁的细胞从6孔板中上清液吸除，转移到另外的6孔板中培养；已经贴壁的细胞，每孔加入1mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，放入培养箱中消化2-4分钟，消化完全以后用等体积的细胞培养液终止消化；将消化以后的细胞在300g、4℃离心5min，随后用细胞培养液重悬浮，并重新接种在6孔板中，放入培养箱中培养；后续待支持细胞覆盖80-90％时，进行传代。
8.根据权利要求7所述的冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括：将制备支持细胞饲养层过程中吸出的悬浮细胞接种到传代以后的支持细胞上，放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，观察细胞生长状况，在培养24-48h以后换新的培养，后续进行传代培养。
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|---|---|
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060046243A1 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Tyho-Galileo Research Laboratories | Method for vitrification of mammalian cells |
| CN102648708A (zh) * | 2011-02-25 | 2012-08-29 | 深圳华大方舟生物技术有限公司 | 一种用于胚胎或细胞的冷冻液及其用途 |
| CN104350145A (zh) * | 2012-02-14 | 2015-02-11 | 华盛顿州立大学 | 用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法 |
| US20170029768A1 (en) * | 2013-12-20 | 2017-02-02 | Kallistem | Process for implementing in vitro spermatogenesis and associated device |
| CN109688812A (zh) * | 2016-08-22 | 2019-04-26 | 博傲沃德株式会社 | 牛生殖细胞的冷冻保存用组合物和冷冻保存方法 |
| CN214115569U (zh) * | 2020-11-23 | 2021-09-03 | 西南民族大学 | 一种用于牦牛体外受精和胚胎培养的培养板 |
-
2021
- 2021-09-06 CN CN202111039846.2A patent/CN113957039A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060046243A1 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Tyho-Galileo Research Laboratories | Method for vitrification of mammalian cells |
| CN102648708A (zh) * | 2011-02-25 | 2012-08-29 | 深圳华大方舟生物技术有限公司 | 一种用于胚胎或细胞的冷冻液及其用途 |
| CN104350145A (zh) * | 2012-02-14 | 2015-02-11 | 华盛顿州立大学 | 用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法 |
| US20170029768A1 (en) * | 2013-12-20 | 2017-02-02 | Kallistem | Process for implementing in vitro spermatogenesis and associated device |
| CN109688812A (zh) * | 2016-08-22 | 2019-04-26 | 博傲沃德株式会社 | 牛生殖细胞的冷冻保存用组合物和冷冻保存方法 |
| CN214115569U (zh) * | 2020-11-23 | 2021-09-03 | 西南民族大学 | 一种用于牦牛体外受精和胚胎培养的培养板 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ANDREIA MARIA DA SILVA等: "Cryopreservation and culture of testicular tissues:an essential tool for biodiversity preservation" * |
| 朱海鲸等: "奶山羊睾丸组织冷冻保存及复苏后精原干细胞的分离培养" * |
| 江芳等: "以支持细胞为饲养层培养冷冻后大鼠精原干细胞研究" * |
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