BR112019003560B1 - Líquidos de criopreservação e métodos de criopreservação para espermatozoides bovinos - Google Patents
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Abstract
São fornecidos um líquido de criopreservação para células reprodutivas de bovinos, como espermatozoides bovinos e um método de criopreservação do mesmo. É adotado um líquido de criopreservação compreendendo: 0,3 a 0,9% p/p de um polieletrólito anfotérico (um poliaminoácido anticongelante), que é e-poli-L-lisina tendo um peso molecular médio numérico de 1.000 a 20.000 em que 50 a 99% em mol de grupos amino da e-poli-L-lisina são bloqueados como carboxilados ao serem reagidos com o anidrido succínico; e 2 a 4% p/p de glicerol, dissolvidos em uma solução fisiológica. Uma modalidade preferencial do método de criopreservação compreende as etapas de: diluição primária, em que o sêmen bovino é diluído de 2,5 a 10 vezes com uma solução fisiológica e mantido entre 2 e 8°C; e diluição secundária, em que o sêmen bovino é diluído de 5 a 20 vezes, mantendo-se entre 2 e 8°C, adicionando gota a gota uma solução fisiológica contendo o polieletrólito anfotérico (poliaminoácido anticongelante) e glicerol a uma suspensão obtida na diluição primária.
Description
[001]A presente invenção se refere a uma composição para criopreservação útil para criopreservação de, por exemplo, células reprodutivas bovinas e um método de criopreservação das mesmas.
[002]Um método de criopreservação a uma temperatura de 0°C ou inferior é rotineiramente usado para preservar células ou tecidos animais por um longo período de tempo. No entanto, as células ou tecidos animais contêm água. É bem conhecido que, quando o congelamento prossegue, as moléculas de água cristalizam uma com a outra enquanto excluem solutos e/ou meios de substâncias misturadas e formam cristais de gelo consistindo apenas em moléculas de água. Portanto, solutos e/ou meios de substâncias misturadas se difundem desigualmente no corpo contendo água, e a concentração de congelamento se desenvolve.
[003]Para evitar essa concentração de congelamento, são realizados métodos envolvendo a adição de vários compostos de baixo peso molecular. Por exemplo, quando se realiza a criopreservação de células, um método é realizado em que dimetilsulfóxido de baixo peso molecular, glicerol ou semelhantes são adicionados como um agente de criopreservação para minimizar os danos às células devido à cristalização intracelular desenvolvida durante a criopreservação.
[004]Em particular, a fim de melhorar a produtividade de bezerros bovinos como animais jovens, é importante desenvolver um método de criopreservação útil para as células reprodutivas bovinas.
[005]Por exemplo, o glicerol é conhecido como um crioconservador usado para congelar espermatozoides bovinos. Além disso, glicerol, etileno glicol, propanodiol são conhecidos como crioconservadores utilizados para congelar óvulos e embriões bovinos. Além disso, o dimetil sulfóxido é conhecido como um crioconservador utilizado para congelar células somáticas bovinas.
[006]No entanto, todos estes crioconservadores convencionais têm problemas, como alta citotoxicidade.
[007]Entretanto, incidentalmente, PCT/JP2009/002941 (JP5726525B) divulga um líquido de criopreservação contendo um polieletrólito anfotérico possuindo um grupo amino e um grupo carboxil nas cadeias laterais. No entanto, não se sabe que o líquido de criopreservação pode ser utilizado para a criopreservação de células bovinas, tais como células reprodutivas e células somáticas.
[008]Como mencionado acima, a fim de melhorar a produtividade de bezerros bovinos como gado jovem, é importante desenvolver novos crioconservadores e métodos de criopreservação úteis para as células reprodutivas bovinas. No entanto, cada um dos crioconservadores convencionais utilizados para congelar células bovinas tem problemas, como alta citotoxicidade.
[009]Assim, à luz destas circunstâncias, a presente invenção pretende fornecer uma composição de criopreservação e um método de criopreservação útil para congelar as células de bovinos, incluindo as células reprodutivas bovinas.
[010]Como resultado de estudos intensivos para resolver o problema mencionado acima, os inventores da presente invenção descobriram que um polieletrólito anfotérico (poliaminoácido anticongelante) obtido pela reação de um grupo amino de ε-poli-L-lisina (PLL) com anidrido succínico e a introdução de uma quantidade apropriada de um grupo carboxil, sozinho ou em combinação com um crioconservador convencional, é útil para a criopreservação de células reprodutivas de bovino ou células somáticas, e assim, a presente invenção se completa.
[011]Nomeadamente, a presente invenção abrange os seguintes: uma composição para criopreservação de células reprodutivas de bovinos, tais como espermatozoides bovinos, compreendendo: um polieletrólito anfotérico (poliaminoácido anticongelante) compreendendo uma unidade representada pela seguinte fórmula (I) e uma unidade representada pela seguinte fórmula (II), em que a percentagem da unidade representada pela fórmula (II) seguinte é de 50 a 99% em mol, e glicerol; e um método de criopreservação das mesmas.
[012]De acordo com a presente invenção, é possível fornecer uma composição de criopreservação útil para as células reprodutivas bovinas, e melhorar a produtividade de bezerros bovinos como gado jovem. Além disso, de acordo com a presente invenção, é possível fornecer uma composição de criopreservação com baixa toxicidade para as células somáticas bovinas.
[013]A figura 1 é uma vista que mostra uma maneira de envolver embriões congelados em uma palheta dedicada.
[014]A figura 2 é um gráfico que mostra o número (contagem) de células aderentes semeadas após o descongelamento das células somáticas bovinas criopreservadas (células de fibroblastos derivadas da pele bovina) (como semeadas após remoção do crioconservador).
[015]A figura 3 é um gráfico que mostra o número (contagem) de células aderentes semeadas após descongelamento das células somáticas bovinas criopreservadas (células cumulus oophorus bovinas) (como semeadas após a remoção do crioconservador).
[016]A composição para criopreservação de células bovinas de acordo com a presente invenção compreende: ε-poli-L-lisina tendo um peso molecular médio numérico de 1.000 a 20.000; 50 a 99% em mol de grupos amino dos quais são bloqueados como carboxilados por terem sido reagidos com o anidrido succínico (daqui em diante referido como "ácido poliamino anticongelante")
[017]Especificamente, o poliaminoácido anticongelante da presente invenção é um polieletrólito anfotérico compreendendo (ou consistindo em) uma unidade representada pela seguinte fórmula (I) e uma unidade representada pela seguinte fórmula (II), onde a porcentagem da unidade representada pela seguinte fórmula (II) é 50 a 99% em mol. Fórmula química I
[018]De acordo com a composição de criopreservação para células bovinas de acordo com a presente invenção, a taxa de sobrevivência e proliferação de células reprodutivas bovinas ou células somáticas depois do descongelamento das células criopreservadas podem ser significativamente melhoradas. Além disso, de acordo com a composição de criopreservação para células bovinas de acordo com a presente invenção, a taxa de concepção por inseminação artificial ou transplante de embrião pode ser significativamente melhorada sem prejudicar a potência de desenvolvimento de espermatozoides ou embriões bovinos após o descongelamento das células criopreservadas.
[019]Na presente invenção, mencionável (como adotável) como a ε-poli- L-lisina é que (ε-poli-L-lisina) produzida por micro-organismos ou enzimas, e tendo um peso molecular médio numérico de 1.000 a 20.000, em particular de 1.000 a 10.000. Atualmente, essa ε-poli-L-lisina é produzida por actinomicetos pertencentes ao gênero Streptomyces e é utilizada unicamente como aditivo alimentar; e além dos que têm um grau de polimerização de 15 a 35, houve tentativa de produzir aqueles tendo um grau de polimerização de 20 ou menos (por exemplo, JP2003-171463A e JP2005-318815A). O peso molecular numérico médio ou grau de polimerização médio numérico podem ser facilmente medidos por um método de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE); por exemplo, usando um dispositivo de eletroforese e um densitógrafo (tipo AE-6920V), que são fabricados pela Atto Corporation. Em tal medição, um marcador de proteína padrão é usado. Entretanto, também adotável é a ε-poli-L-lisina que é modificada por ter um elevado peso molecular de 30.000 ou mais, aumentando o peso molecular por tratamento térmico. Contudo, tendo em vista evitar o aumento da viscosidade e semelhantes, é preferencial a faixa de pesos moleculares acima mencionada.
[020]Pela reação mostrada abaixo, os grupos amino de ε-poli-L-lisina são parcialmente bloqueados como carboxilados com anidrido succínico.
[021]No acima, de preferência 50 a 99% em mol, particularmente 50 a 93% em mol, mais preferencialmente 50 a 90% em mol, ainda preferencialmente 55 a 80% em mol, e mais preferencialmente 58 a 76% em mol, dos grupos amino de ε-poli-L-lisina são carboxilados e bloqueados.
[022]Cerca de 50% em mol de grupos amino de ε-poli-L-lisina podem ser bloqueados ao reagir 52 a 53% em mol de anidrido succínico com os grupos amino. Além disso, quando 100% em mol de anidrido succínico são submetidos a essa reação, 90 a 95% em mol de grupos amino podem ser bloqueados em condições de reação comuns. O efeito de criopreservação diminui em ambos os casos quando a porcentagem de bloqueio excede ou fica abaixo da faixa acima mencionada.
[023]A composição de criopreservação para células bovinas de acordo com a presente invenção é uma solução aquosa do poliaminoácido anticongelante dissolvido em uma solução aquosa fisiológica. Quanto à solução fisiológica aquosa, adotável não é apenas salina fisiológica, mas também uma solução de cultura comum para várias células ou tecidos. Por exemplo, o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) é mencionado como preferencial.
[024]Na primeira modalidade da presente invenção, a composição de criopreservação para células bovinas de acordo com a presente invenção é: uma composição para criopreservação de espermatozoides bovinos, compreendendo o poliaminoácido anticongelante e glicerol acima descritos. A composição para criopreservação de espermatozoides bovinos de acordo com a presente invenção compreende, por exemplo: o poliaminoácido anticongelante em uma concentração de 0,25 a 1,0% p/p, preferencialmente 0,3 a 0,9% p/p ou 0,3 a 0,8% p/p; e glicerol em uma concentração de 1,5 a 4,5% p/p ou 1,5 a 4,4% p/p e, de um modo preferencial, 2,0 a 4,0% p/p. Tal conteúdo do glicerol é uma quantidade significativamente reduzida ou reduzida pela metade da quantidade convencionalmente utilizada para criopreservação de espermatozoides bovinos, e assim a composição para criopreservação de espermatozoides bovinos de acordo com a presente invenção é: um crioconservador possuindo baixa citotoxicidade.
[025]De acordo com o método de criopreservação preferencial de acordo com a primeira modalidade, o método compreende etapas de: diluir o sêmen bovino até 5 a 20 vezes, com uma solução fisiológica adicionada ao poliaminoácido anticongelante e glicerol para que os espermatozoides bovinos sejam suspensos em um líquido de criopreservação compreendendo 0,3 a 0,9% p/p do polieletrólito anfotérico (o poliaminoácido anticongelante) e 2 a 4% p/p de glicerol, bem como uma porção derivada do sêmen bovino; congelar o líquido de criopreservação, no qual os espermatozoides bovinos estão suspensos, em um recipiente tubular; e depois conservá-los mantendo o líquido de criopreservação a -60°C ou temperatura mais baixa.
[026]A etapa de diluição inclui, de preferência, as seguintes etapas: diluição primária, em que o sêmen de bovino é diluído até 2,5 a 10 vezes com uma solução fisiológica e mantido entre 2 e 8°C; e diluição secundária, na qual o sêmen bovino é posteriormente diluído até 5 a 20 vezes, mantendo-se de 2 a 8°C, adicionando, gota a gota, uma solução fisiológica contendo o polieletrólito anfotérico (poliaminoácido anticongelante) e glicerol, à uma suspensão obtida na etapa primária de diluição.
[027]Além disso, preferencialmente, é feito o resfriamento a -140°C ou temperatura mais baixa, usando uma palheta de criopreservação com um diâmetro de 5 mm ou menos; por um método de congelamento lento a uma taxa de resfriamento de 100°C/min ou menos com um programa de congelamento ou semelhante; ou por um processo de vitrificação e congelamento a uma taxa de arrefecimento de 300°C/min ou mais por imersão de nitrogênio líquido. Além disso, de preferência, é alcançável uma percentagem de espermatozoides móveis de 30% ou mais e uma taxa de movimento linear de alta velocidade de 10% ou mais, em 6 horas após o descongelamento do criopreservado.
[028]Como para a solução fisiológica, é discricionariamente adotável como adequadamente pelo menos um entre: uma solução tampão isotônica tris- citrato (tris (hidroximetil aminometano)); soluções aquosas de ácido cítrico, glicose, cloreto de sódio e semelhantes (incluindo solução salina fisiológica); tal solução adicionada ainda com gema de ovo, aminoácido ou semelhantes; M199, CR1aa, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), meio essencial mimo de Eagle (MEM) e semelhantes. Esse meio de cultura pode conter, por exemplo, 1000 mg/ a 4500 mg/L de glicose ou outros monossacarídeos, dissacarídeos ou semelhantes.
[029]Exemplos de uma solução fisiológica preferencial para preservar espermatozoides bovinos incluem aqueles baseados em solução tampão tris- citrato preparada de uma maneira como se segue. Ou seja, em um exemplo específico, 17,031 g de tris (hidroximetil aminometano) (Wako Pure Chemical Industries), 9,519 g de ácido cítrico mono-hidratado (Wako Pure Chemical Industries), 3,000 g de glicose (Wako Pure Chemical Industries) e 4,625 g de cloreto de sódio (Wako Pure Chemical Industries), bem como 3 ml de penicilina G potássica (Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.) de 1.000.000 UI/4,6 ml SPUF, e 3 ml de estreptomicina (Meiji Seiyaku Co., Ltd.) de título de 1.000 mg/4,3 ml SPUF são adicionados um ao outro; e então, a solução resultante é diluída até 1.000 ml, com água destilada; de modo a resultar em uma solução aquosa contendo 140,6 mM de tris (hidroximetil aminometano), 45,3 mM de ácido cítrico, 16,7 mM de glicose e 79,1 mM de cloreto de sódio.
[030]Outro exemplo de uma solução fisiológica preferencial para a conservação de espermatozoides bovinos é uma solução tampão tris-citrato adicionada com gema de ovo (solução de açúcar tris de gema de ovo (ET)). Este é um líquido de diluição primária para o sêmen, comercializado pela Livestock Improvement Association of Japan, Inc. pelo nome comercial de "Sort 90".
[031]Em uma segunda modalidade da presente invenção, a composição de criopreservação para células bovinas de acordo com a presente invenção é uma composição de criopreservação para embriões bovinos compreendendo: poliaminoácido anticongelante acima descrito, etileno glicol, propanodiol e soro fetal de bovino. Exemplos dos embriões bovinos a serem submetidos à criopreservação incluem, por exemplo, embriões bovinos desenvolvidos durante 6 a 9 dias (preferencialmente 7 a 8 dias) por fertilização in vitro (FIV) ou semelhantes.
[032]A composição de criopreservação para embriões bovinos de acordo com a presente invenção compreende: o poliaminoácido anticongelante em uma concentração de, por exemplo, 5 a 10% p/p (preferencialmente 7% p/p); etileno glicol em uma concentração de 4 a 6% p/p, por exemplo, 5% p/p; propanodiol (1,3-propanodiol; propileno glicol) em uma concentração de 4 a 8% p/p, por exemplo 6% p/p; e soro bovino fetal em uma concentração de 15 a 25% p/p, preferencialmente 20% p/p.
[033]Na terceira modalidade da presente invenção, a composição de criopreservação para células bovinas de acordo com a presente invenção é: uma composição de criopreservação para células somáticas bovinas compreendendo poliaminoácido anticongelante acima descrito e o soro bovino fetal. Exemplos de células somáticas bovinas a serem submetidas à criopreservação incluem, por exemplo: células de fibroblastos, células cumulus oophorus, células mesenquimais, células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea humana, células-tronco derivadas de tecido adiposo e semelhantes.
[034]A composição de criopreservação para células somáticas bovinas de acordo com a presente invenção compreende, por exemplo: o poliaminoácido anticongelante em uma concentração de 5 a 30% p/p (de preferência 5 a 25% p/p); e soro bovino fetal em uma concentração de 65 a 85% p/p (preferencialmente 70 a 80% p/p).
[035]Além disso, a composição de criopreservação para células somáticas bovinas de acordo com a presente invenção pode conter dimetil sulfóxido. A composição de criopreservação para células somáticas bovinas de acordo com a presente invenção pode conter dimetil sulfóxido em uma concentração de, por exemplo, 0,1 a 10% p/p (preferencialmente 4 a 6% p/p ou 5% p/p).
[036]Várias células bovinas são criopreserváveis sendo suspensas na composição de criopreservação descrita acima para células bovinas de acordo com a presente invenção, e sendo congeladas em um freezer a uma temperatura de, por exemplo, -20 a -100°C, preferencialmente -60 a -90°C ou -70 a -90°C, de um modo particularmente preferencial, cerca de -80°C. Em relação aos espermatozoides bovinos, por exemplo, 15 a 30 milhões (preferencialmente 20 a 30 milhões) de espermatozoides bovinos são suspensos em 0,25 a 0,5 mL de uma composição de criopreservação, e são submetidos ao congelamento. Em relação aos embriões bovinos, por exemplo, suspendem-se de 1 a 50 (de preferência 1 a 2) embriões bovinos em 0,01 a 0,25 mL (preferencialmente 0,02 a 0,05 mL) de uma composição de criopreservação e são submetidos a congelamento. No que diz respeito às células somáticas bovinas, por exemplo, suspendem-se 0,5 a 2 milhões (de preferência 0,5 a 1 milhão) de células somáticas bovinas em 0,2 a 2 ml (de preferência 1 ml) de uma composição de criopreservação e são submetidas a congelamento.
[037]Quando se utilizam células bovinas congeladas, descongelá-las para utilizá-las pode ser feito de acordo com um método geral de descongelamento para descongelar várias células bovinas. Entretanto, o poliaminoácido anticongelante tem baixa citotoxicidade e não tem de ser removido quando descongelado, ao contrário do dimetil sulfóxido e semelhantes.
[038]Além disso, a composição de criopreservação para células bovinas de acordo com a presente invenção também pode ser fornecida como um kit para criopreservação de células bovinas. O kit inclui a composição de criopreservação e pode ainda incluir, por exemplo: um recipiente a ser utilizado para criopreservação, um manual de instruções do kit ou semelhante.
[039] Daqui em diante, a presente invenção é descrita em mais detalhes por meio da utilização de exemplos, mas o escopo técnico da presente invenção não se limita a estes exemplos. EXEMPLO 1: Criopreservação de espermatozoides bovinos usando poliamino ácido anticongelante 1-1.Preparação de solução de criopreservação
[040]O poliaminoácido anticongelante foi preparado pela adição de 65% (% em mol) de anidrido succínico (fabricado por Wako Pure Chemical Industries) a uma solução aquosa a 25% de ε-poli-L-lisina (tendo um peso molecular de 4.000 e fabricado por JNC Corporation (Chisso Corporation)) de modo que 60% em mol de grupos amino nas moléculas de ε-polil-L-lisina sejam carboxiladas como bloqueados.
[041]Em seguida, foi adicionada solução de poliaminoácido anticongelante (CPLL) assim preparada (uma solução aquosa de cerca de 33% p/p) e glicerol (Gly) a um meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco (TM) 11330-032, quantidade de glicose: 3151 mg/l) para se tornarem percentagens predeterminadas (glicerol V/V%, CPLL p/p%). Nesta ocasião, neutralizou-se a solução com 1 N de ácido clorídrico ou com uma solução aquosa de hidróxido de sódio para que o pH baixasse entre 7,0 e 8,0. 1-2. Método para criopreservação de espermatozoides bovinos
[042]O sêmen coletado de um touro de sementeira foi testado quanto à contagem de espermatozoides, motilidade e semelhantes, depois foi diluído até cerca de 5 vezes com um diluente primário (o meio de Eagle modificado por Dulbecco usado em "1-1"). O sêmen diluído foi deixado em repouso a baixa temperatura (4°C) e foi lentamente resfriado. Em uma fase em que a temperatura do sêmen caiu para cerca de 4°C, foi diluído gota a gota com o diluente primário para metade da quantidade final de diluição. Então, mantendo a temperatura em torno de 4°C, o sêmen diluído foi diluído gota a gota com um diluente secundário contendo o crioconservador (a "solução de criopreservação" obtida em "1-1") até a quantidade final de diluição, e foi dividido e injetado. em palhetas de criopreservação (“0,5 ml, tipo fino”, diâmetro 4 mm x 133 mm, fabricado pela Fujihira Industry Co., Ltd.). As palhetas de criopreservação foram deixadas em repouso por um tempo, e então foram resfriadas e congeladas, por um método de congelamento lento usando um programa de congelador a uma taxa de resfriamento de 100°C/min ou menos, para cerca de -150°C; e depois foi armazenado em nitrogênio líquido. (Quantidade adicionada do crioconservador no diluente secundário: 13% v/v de glicerol no tipo convencional; e glicerol 6,5% v/v + CPLL 1,0% p/v no novo tipo)
[043]O descongelamento da suspensão de espermatozoides criopreservada foi realizado por imersão das palhetas de criopreservação em água morna em 30 a 38°C por 15 segundos após a retirada das palhetas do nitrogênio líquido. 1-3.Resultados e discussões para criopreservação de espermatozoides bovinos
[044]Os resultados da viabilidade dos espermatozoides bovinos criopreservados após o descongelamento são mostrados na TABELA 1 abaixo. TABELA 1 Viabilidade dos espermatozoides bovinos criopreservados após o descongelamento Fresco Congelamento/após o descongelamento
[045]Como mostrado na Tabela 1, ficou claro que CPLL é capaz de ser usada para criopreservação de espermatozoides bovinos. Além disso, adicionando CPLL, o Gly convencionalmente usado é capaz de ser reduzido (reduzido a metade). Isto significa um líquido de criopreservação com uma nova composição tendo baixa citotoxicidade.
[046]Os resultados da concepção por inseminação artificial com espermatozoides bovinos criopreservados são mostrados na TABELA 2 abaixo. TABELA 2 Resultados da concepção por inseminação artificial com espermatozoides bovinos criopreservados
(P=0.23)
[047]Como mostrado na TABELA 2, uma taxa de concepção vantajosa foi obtida por inseminação artificial com espermatozoides bovinos congelados usando CPLL. Isso significa que a potência de desenvolvimento não foi prejudicada após o descongelamento dos espermatozoides bovinos criopreservados. 1-4.Avaliação da viabilidade (motilidade) de espermatozoides 6 horas após o descongelamento dos espermatozoides bovinos criopreservados
[048]Nenhuma diferença foi encontrada na viabilidade dos espermatozoides imediatamente após o descongelamento dos espermatozoides bovinos criopreservados (TABELA 1), enquanto diferenças foram reconhecidas na taxa de concepção pela inseminação artificial (TABELA 2). Assim, as causas disso foram pesquisadas.
[049]Cada um dos espermatozoides congelados e descongelados pelo método convencional (6,5% de glicerol) ou pelo novo método (3,25% de glicerol + 0,5% de CPLL) foi incubado durante 6 horas e depois a motilidade de cada espermatozóide foi examinada. Para avaliar a motilidade dos espermatozoides bovinos, os parâmetros de motilidade dos espermatozoides (taxa de motilidade (Mot), taxa de motilidade progressiva (Prog), velocidade linear (VSL), velocidade curvilínea (VCL), velocidade média de trajeto (VAP), amplitude de deslocamento lateral da cabeça (AHL), frequência de batimento cruzado (BCF)) a 37°C foram medidos usando um analisador de motilidade dos espermatozoides (CASA; SMAS 3, fabricado pela Detect Ltd.) e uma câmara de medição (“MicroCell” fabricada pela Vitrolife). Um espermatozoide com VAP > 10 μm/seg foi classificado como um espermatozoide de motilidade enquanto um espermatozoide com VAP > 50 μm/seg e STR > 0,75 foi classificado como um espermatozoide de motilidade progressiva.
[050]Os resultados são mostrados na TABELA 3 abaixo.
(Diferença significativa entre aqueles com sinais diferentes: A/B P <0,05, a/b P <0,01) *Mot: taxa de motilidade, Prog: taxa de motilidade progressiva rápida, VAP: Valor médio de velocidade em percurso progressivo de espermatozoides VSL: Valor médio da velocidade de deslocamento ao longo dos pontos na linha reta dos espermatozoides, VCL: Valor médio da velocidade de deslocamento ao longo dos pontos em uma linha curva de espermatozoides AHL: Amplitude média do deslocamento lateral da cabeça dos espermatozoides, e BCL: Contagem de batidas (por segundo) de cabeças de espermatozoides
[051]Como mostrado na TABELA 3, a viabilidade (motilidade) dos espermatozoides 6 horas após o descongelamento foi significativamente melhor no novo método do que no método convencional.
[052]Nenhuma diferença foi encontrada na viabilidade (motilidade) dos espermatozoides imediatamente após o descongelamento, enquanto diferenças foram reconhecidas na viabilidade dos espermatozoides quando um determinado período de tempo havia decorrido após o descongelamento.
[053]São necessárias cerca de 4 horas para os espermatozoides, que foram injetados no canal cervical uterino ou no corpo útero em inseminação artificial, para alcançar a ampola do tubo uterino onde ocorre a fertilização. Assim, sugere-se que, quando um certo período de tempo tenha decorrido após o descongelamento, as diferenças na viabilidade dos espermatozoides possivelmente afetam a taxa de concepção. 1-5.Avaliação da membrana celular das cabeças dos espermatozoides após o descongelamento dos espermatozoides bovinos criopreservados
[054]Nenhuma diferença foi encontrada na viabilidade dos espermatozoides imediatamente após o descongelamento dos espermatozoides bovinos criopreservados (TABELA 1), enquanto diferenças foram reconhecidas na viabilidade dos espermatozoides após 6 horas de descongelamento (TABELA 3). Assim, as causas disso foram pesquisadas.
[055]Cada um dos espermatozoides congelados e descongelados pelo método convencional (6,5% de glicerol) ou pelo novo método (3,25% de glicerol + 0,5% de CPLL) foi submetido à coloração com SYBR 14 e iodeto de propídio (PI), a fim de examinar distúrbios na membrana celular das cabeças dos espermatozoides.
[056]A membrana celular que não tem distúrbios é corada em verde por SYBR14 enquanto a membrana celular que tem distúrbios é corada em vermelho pelo iodeto de propídio.
[057]Os resultados são mostrados na TABELA 4 abaixo.
(Diferença significativa entre aqueles com sinais diferentes: P < 0.01)
[058]Como mostrado na Tabela 4, a percentagem de membrana celular de cabeças de espermatozoides sem distúrbios após o descongelamento foi significativamente maior no novo método do que no método convencional.
[059]Uma das causas das diferenças reconhecidas na viabilidade dos espermatozoides 6 horas após o descongelamento é presumida como sendo danos decorrentes do descongelamento causados na membrana celular dos espermatozoides. EXEMPLO 2: Criopreservação de embriões bovinos usando ácido poliamino anticongelante 2-1.Preparação de solução de criopreservação
[060]O poliaminoácido anticongelante foi preparado pela adição de 65% (em mol%) de anidrido succínico (fabricado por Wako Pure Chemical Industries) a uma solução aquosa a 25% de ε-poli-L-lisina (tendo um peso molecular de 4.000 e fabricado por JNC Corporation) de modo a que 60% em mol de grupos amino nas moléculas de ε-poli-L-lisina sejam carboxiladas como bloqueados.
[061]Em seguida, solução de poliaminoácido anticongelante assim preparada (CPLL), etileno glicol (EG), propanodiol (PD) e soro bovino fetal (FCS ou CS) foram adicionados a solução salina tamponada com fosfato (PBS, fabricada pela Gibco) de modo a se tornarem porcentagens predeterminadas (% p/p). Nesta ocasião, neutralizou-se a solução com 1 N de ácido clorídrico ou com uma solução aquosa de hidróxido de sódio para que o pH baixasse entre 7,0 e 7,5. 2-2. Método para criopreservação de embriões bovinos
[062]Embriões bovinos crescidos de mórula para embriões em estágio de blastocisto foram lavados com PBS tendo sido adicionado com soro fetal bovino a 20%, e então imersos no líquido de criopreservação tendo a CPLL, e foram imediatamente incluídos em palhetas de criopreservação de 0,25 ml (fabricadas por IMV), juntamente com o líquido de criopreservação (FIG. 1). Após o fechamento, o tratamento de equilíbrio foi realizado por 10 minutos a 20 minutos e, em seguida, o congelamento foi realizado da seguinte forma: os embriões bovinos nas palhetas de criopreservação foram resfriados a uma taxa de resfriamento de 100°C/min ou menos por um método de congelamento lento com um programa de congelador a -30°C; e depois imersos em nitrogênio líquido. Após o congelamento, os embriões bovinos nas palhetas de criopreservação foram armazenados em nitrogênio líquido até serem utilizados.
[063]O descongelamento dos embriões criopreservados foi realizado da seguinte maneira: as palhetas de criopreservação foram retiradas do nitrogênio líquido e mantidas no ar por 5 segundos; e depois, imersas em água morna a 30 a 38°C por 15 segundos 2-3. Resultados e discussões sobre a criopreservação de embriões bovinos
[064]Os resultados da viabilidade dos embriões bovinos crioconservados após o descongelamento são mostrados na TABELA 5 abaixo. TABELA 5
*Embriões bovinos: Mr para EBL desenvolvido no 7° ao 8° dia por fertilização in vitro (Diferença significativa entre aqueles com sinais diferentes: P < 0,05)
[065]Como mostrado na Tabela 5, ficou claro que CPLL é capaz de ser usado para criopreservação de embriões bovinos, no método de congelamento lento. Além disso, ao adicionar CPLL ao crioconservador convencional (concentração), a viabilidade que não é diferente da convencional foi assegurada. Isso significa um líquido de criopreservação com uma nova composição.
[066]Os resultados do transplante de embriões de embriões bovinos criopreservados são mostrados na TABELA 6 abaixo. TABELA 6 Resultados do transplante de embriões de embriões bovinos congelados
(P=0,06)
[067]Como mostrado na Tabela 6, uma taxa de concepção vantajosa foi obtida por transplante de embriões de embriões bovinos congelados usando CPLL. Isso significa que a potência de desenvolvimento após o descongelamento dos embriões bovinos criopreservados não foi prejudicada.
[068]Os resultados da viabilidade dos embriões bovinos criopreservados quando expostos ao líquido de crioconservação após o descongelamento são mostrados na TABELA 7 abaixo. TABELA 7 Viabilidade de embriões quando expostos ao líquido de criopreservação após o descongelamento de embriões bovinos
EXEMPLO 3: Criopreservação de células somáticas bovinas utilizando poliaminoácido anticongelante 3-1.Preparação de solução de criopreservação
[069]O poliaminoácido anticongelante foi preparado pela adição de 65% (% em mol) de anidrido succínico (fabricado por Wako Pure Chemical Industries) a uma solução aquosa a 25% de ε-poli-L-lisina (tendo um peso molecular de 4.000 e fabricado por JNC Corporation) de modo a que 60% em mol de grupos amino nas moléculas de ε-poli-L-lisina sejam carboxiladas como bloqueadas.
[070]Em seguida, solução de poliaminoácido anticongelante assim preparada (CPLL), dimetil sulfóxido (DMSO) e soro bovino fetal (CS) foram adicionados a um meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, fabricado por Sigma Aldrich) de modo a se tornar percentagens predeterminadas (% p/p). Nesta ocasião, neutralizou-se a solução com 1 N de ácido clorídrico ou com uma solução aquosa de hidróxido de sódio para que o pH baixasse entre 7,0 e 7,5. 3-2.Método para criopreservação de células somáticas bovinas
[071]As células somáticas bovinas cultivadas até um estágio confluente com um frasco de cultura de tecido (placa) foram recuperadas por um método padrão tal como lavagem com PBS, tratamento enzimático com tripsina e semelhantes. As células somáticas bovinas recuperadas foram imersas no líquido de criopreservação em tubo de criopreservação (1,0 ml, fabricado pela Falcon), e imediatamente colocadas em freezer a -80°C, congeladas e armazenadas (armazenadas em nitrogênio líquido quando a preservação de longo prazo é feita).
[072]O descongelamento das células somáticas criopreservadas foi realizado da seguinte maneira: a palheta de criopreservação foi retirada do nitrogênio líquido e, em seguida, imediatamente imersa em água quente em 30 a 38°C até cristais de gelo com tamanho de grãos de arroz permanecem no tubo (palheta). O líquido de criopreservação é removido por centrifugação por um método padrão e, em seguida, as células somáticas são semeadas em um dispositivo de cultura celular. Entretanto, quando o presente líquido de criopreservação foi adotado, a remoção do líquido de criopreservação após o descongelamento não era necessária, ou seja, era possível semear as células sem a remoção. 3-3.Resultados e discussões sobre criopreservação de células somáticas bovinas
[073]Os resultados da viabilidade das células somáticas bovinas criopreservadas (células de fibroblastos derivados da pele bovina) imediatamente depois do descongelamento são apresentados na TABELA 8 abaixo. Além disso, os resultados da proliferação celular das células somáticas bovinas crioconservadas (células de fibroblastos derivados da pele bovina) depois de descongelamento estão apresentados na TABELA 9 abaixo. Além disso, as contagens de células aderentes de células somáticas bovinas criopreservadas (células de fibroblastos derivados de pele bovina) semeadas após descongelamento (como semeadas após remoção do crioconservador) são mostradas na FIG. 2. TABELA 8 Taxa de viabilidade de células somáticas (células de fibroblastos derivados da pele bovina) imediatamente após o descongelamento
(Diferença significativa entre aqueles com sinais diferentes: P < 0,05) TABELA 9 Proliferação celular (de células de fibroblastos derivados da pele bovina) após descongelamento 
Remoção centrífuga (+): O crioconservador foi removido por centrifugação depois do descongelamento e as células foram cultivadas (troca de meio não foi realizada até as células serem contadas).
[074]Os resultados da viabilidade de células somáticas bovinas crioconservadas (células cumulus oophorus bovinas) imediatamente após o descongelamento são mostrados na TABELA 10 abaixo. Além disso, os resultados da proliferação celular de células somáticas bovinas criopreservadas (células cumulus oophorus bovinas) após descongelamento são mostrados na TABELA 11 abaixo. Além disso, as contagens de células aderentes semeadas após descongelamento de células somáticas bovinas criopreservadas (células cumulus oophorus bovinas) (como semeadas após remoção do crioconservador) são mostradas na FIG. 3. TABELA 10 Taxa de viabilidade de células (células do cumulus oophorus bovinas) imediatamente após o descongelamento
TABELA 11 Proliferação celular (de células do cumulus oophorus bovinas) após o descongelamento Antes de Células viáveis (coletadas) (x10 4 ) 
Remoção centrífuga (+): O crioconservador foi removido por centrifugação depois do descongelamento e as células foram cultivadas (troca de meio não foi realizada até serem realizadas as contagens de células).
[075]Como mostrado nas TABELAS 8 a 11, e FIGS. 2 a 3, ficou claro que CPLL é capaz de ser utilizada para criopreservação de células somáticas bovinas.
[076]Como mostrado em TABELAS 8 e 9, e FIG. 2, em células de fibroblastos derivados da pele de bovinos, CPLL serviu como substituta do DMSO como crioconservador, e a criopreservação foi possível usando apenas CPLL como crioconservadora. Além disso, a capacidade de proliferação após o descongelamento foi maior quando a CPLL foi utilizada do que quando o DMSO foi usado. Além disso, CPLL não precisou ser removida quando o descongelamento foi feito, e foi possível semear células sem remover CPLL.
[077]Por outro lado, como mostrado nas TABELAS 10 e 11, e FIG. 3, CPLL serviu como um substituto para DMSO como um crioconservador em células cumulus oophorus, e criopreservação foi possível usando CPLL sozinha como um crioconservador. Além disso, tendo em vista a capacidade de proliferação após o descongelamento, a concentração ideal de CPLL de células de fibroblastos (5% de CPLL) difere da das células do cumulus oophorus (25% da CPLL).
Claims (8)
1. Líquido de criopreservação para espermatozoides bovinos, no qual os espermatozoides bovinos são suspensos e congelados, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: 0,3 a 0,9% p/p de um polieletrólito anfotérico (poliaminoácido anticongelante) compreendendo uma unidade representada pela fórmula (I) abaixo e uma unidade representada pela fórmula (II) abaixo na qual a porcentagem da unidade representada pela fórmula (II) é 50 a 99% em mol; e 2 a 4% p/p de glicerol
2. Líquido de criopreservação para espermatozoides bovinos, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o líquido de criopreservação é uma solução aquosa do poliaminoácido anticongelante e glicerol como dissolvido em um meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), meio essencial mínimo de Eagle (MEM), outra solução de cultura de células, ou em outra solução fisiológica; e o líquido de criopreservação é ajustado para ter um pH em uma faixa de 7,0 a 8,0 e compreende 5 a 20% p/p de um líquido derivado do sêmen bovino.
3. Método de criopreservação para espermatozoides bovinos, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: diluir os espermatozoides bovinos como suspensos, com um líquido de criopreservação, até 5 a 20 vezes, que compreende polieletrólito anfotérico (poliaminoácido anticongelante) e glicerol, adicionados a uma solução fisiológica, para que os espermatozoides bovinos fiquem suspensos no líquido de criopreservação, que contém 0,3 a 0,9% p/p do polieletrólito anfotérico (o poliaminoácido anticongelante), 2 a 4% p/p de glicerol, e uma porção derivada do sêmen bovino, em que o polieletrólito anfotérico (o poliaminoácido anticongelante) compreende uma unidade representada por uma fórmula (I) abaixo e uma unidade representada por uma fórmula (II) abaixo, e tem uma porcentagem da unidade representada pela fórmula (II) em uma faixa de 50 a 99% em mol, congelar o líquido de criopreservação com espermatozoides bovinos suspensos em um recipiente tubular, e preservar os espermatozoides bovinos mantendo o líquido de criopreservação a -60 °C ou temperatura mais baixa
4. Método de criopreservação para espermatozoides bovinos, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a diluição compreende as etapas de: diluição primária, em que o sêmen bovino é diluído até 2,5 a 10 vezes com uma solução fisiológica e mantido em 2 a 8 °C, e diluição secundária, em que o sêmen bovino é diluído ainda até 5 a 20 vezes, mantendo-se em 2 a 8 °C, adicionando gota a gota uma solução fisiológica contendo o polieletrólito anfotérico (o poliaminoácido anticongelante) e glicerol a uma suspensão obtida na diluição primária.
5. Método de criopreservação para espermatozoides bovinos, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o resfriamento a -140 °C ou temperatura inferior é realizado, utilizando uma palheta de criopreservação com um diâmetro de 5 mm ou inferior.
6. Método de criopreservação para espermatozoides bovinos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é capaz de atingir uma porcentagem de espermatozoides móveis de 30% ou mais e uma taxa de motilidade progressiva rápida de 10% ou mais, 6 horas após o descongelamento dos espermatozoides bovinos criopreservados.
7. Líquido de criopreservação para embriões bovinos, no qual os embriões bovinos são suspensos e congelados, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a 10% p/p de um polieletrólito anfotérico (poliaminoácido anticongelante) compreendendo uma unidade representada por uma fórmula (I) abaixo e uma unidade representada por uma fórmula (II) abaixo na qual a percentagem da unidade representada pela fórmula (II) é 50 a 99% em mol; a 6% p/p de etileno glicol; a 8% p/p de propanodiol; e a 25% p/p de soro bovino fetal
8. Método de criopreservação para embriões bovinos, CARACTERIZADO pelo fato de que ao utilizar o líquido de criopreservação, como definido na reivindicação 7, os embriões bovinos são resfriados e congelados por um método de congelamento lento a uma taxa de resfriamento de 100 °C/min ou inferior.
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