BR102014022851A2 - processo de descongelação e recongelação de sêmen criopreservado - Google Patents

Abstract

processo de descongelação e recongelação de sêmen criopreservado. trata-se a presente patente de invenção, de um processo de descongelação e recongelação de sêmen criopreservado, proveniente de amostras congeladas previamente, provenientes de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, eqüinos, ovinos e suínos, pertencente à área de biotecnologia aplicada à reprodução animal. a presente invenção apresenta um processo de descongelação e recongelação de sêmen criopreservado, proveniente de amostras congeladas previamente em ampolas de vidro ou mesmo palhetas francesas de 0,50 cc provenientes de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, eqüinos, ovinos e suínos, através de sete etapas principais: 1.- descongelação; 2.- análise laboratorial; 3.- centrifugação; 4.- diluição; 5.- criopreservação; 6.- congelação; e 7.- armazenamento.

Description

PROCESSO DE DESCONGELAÇÃO E RECONGELAÇÃO DE SÊMEN CRIOPRESERVADO

[1] Trata-se a presente patente de invenção, de um processo de descongelação e recongelação de sêmen criopreservado, proveniente de amostras congeladas previamente, provenientes de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos e suínos, pertencente à área de Biotecnologia aplicada à reprodução animal.

[2] A sua importância refere-se à possibilidade de se tomar viável a utilização de amostras congeladas em uma forma não mais usual, no caso de ampolas de vidro ou mesmo multiplicar uma amostra em palheta francesa 0,50 cc que possua uma alta concentração espermática de reprodutores de alto valor zootécnico de maneira a se conservar material genético, o qual faz parte de um dos maiores bancos de germoplasma do mundo que é o brasileiro.

[3] O melhoramento animal com a utilização de material genético de qualidade superior impacta diretamente no desenvolvimento de rebanhos mais rentáveis corroborando a maior produção de alimentos por área. Ainda, em virtude do Brasil ser protagonista no cenário mundial de agropecuária, esta técnica promovería impacto econômico de grande peso na balança comercial. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[4] Atualmente no mercado existe uma técnica a qual objetiva a descongelação e sexagem de amostras de sêmen criopreservado de bovinos e pequenos ruminates. Este é um serviço oferecido por centrais de Inseminação Artificial. O grande inconveniente desta técnica já oferecida é o tempo necessário para selecionar e recongelar as doses de sêmen que implica em perda da viabilidade de muitos espermatozóide e evidentemente corrobora o custo mais elevado por amostra pago pelos produtores (podendo atingir o patamar de até R$ 1.000,00 por amostra).

[5] Já a presente patente visa descongelar, avaliar a qualiadade e viabilidade in vitro da amostra e recongelá-la em containers menores, mais modernos (palhetas francesas de 0,25cc) e com diluidores mais adequados à diferentes espécies e indivíduos. Assim, a técnica não separa espermatozóides por sexo. Ela racionaliza espaço em conteiners criobiológicos, adequa as doses ao emprego da Inseminação Artificial realizada nos dias de hoje e custa muito menos (em torno de R$ 20).

[6] Assim, a presente patente de invenção tem como objetivo proporcionar facilidades técnicas e operacionais configurando um excelente modelo experimental para pesquisas na área de fisiologia espermática. DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[7] A presente invenção apresenta um processo de descongelação e recongelação de sêmen criopreservado, proveniente de amostras congeladas previamente em ampolas de vidro ou mesmo palhetas francesas de 0,50 cc provenientes de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, eqüinos, ovinos e suínos, através de sete etapas principais: 1. - Descongelação; 2. - Análise laboratorial; 3. - Centrifugação; 4. - Diluição; 5. - Criopreservação; 6. - Congelação; e 7. - Armazenamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[8] O processo de descongelação e recongelaçao de sêmen criopreservado, proveniente de amostras congeladas previamente em ampolas de vidro ou mesmo palhetas francesas de 0,50 cc provenientes de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, eqüinos, ovinos e suínos, compreende as seguintes etapas: 1Descongelação: 1.1. - descongelação do sêmen em água aquecida a uma temperatura entre 20°C e 92°C por um período entre 2 segundos e 10 minutos, preferencialmente à 20°C por 10 (dez) minutos, ou à 35°C por 1 (um) minuto, ou à 37°C por 1 (um) minuto, ou à 46°C por 20 (vinte) segundos, ou à 92°C por 2 (dois segundos); 2. - Análise laboratorial: 2.1. - após a descongelação, colocar as doses em tubo Falcon plástico estéril livre ou não de RNAses; 2.2. - todo material recolhido segue então para análise onde são avaliados os seguintes parâmetros: concentração, motilidade, trajetória, tipo de movimento, amplitude de movimento, patologias e danos a ultraestruturas tais como membrana, acrossoma, mitocôndrias e DNA; 3. - Centrifugação: 3.1.- uma vez estabelecidos estes parâmetros, as amostras são diluídas em Dullbeco’s Modified Phosphate Buffered Solution (DMPBS), contendo Solução salina fisiológica - NaCl 0,9% - (soro fisiológico) e Ringer Lactato (Agua de côco), aquecidos à mesma temperatura de descongelação utilizada no início do processo em uma proporção (volume sêmen : volume diluente) de 1:1, ou 2:1, ou 3:1 e centrifugados de acordo com os seguintes protocolos: 1. - 500g por 10 (dez) minutos; 2. - 1500g por 5 (cinco) minutos; 3. - 1800g por 3 (três) minutos; 4. - Diluição: vencida a etapa da centrifugação os tubos contendo sêmen descongelado e diluído terão sua porção sobrenadante desprezada mantendo apenas o “pellet” do fundo do tubo que corresponde à fração rica em espermatozóides que serão então diluída em meio comercial ou de fabricação própria para a criopreservação podendo ser à base de: 1) Glicina-gema-leite ( 2-20%) com glicerol (4 — 15%) 2) Tris-gema-citrato ( 2-20%) com glicerol (4 - 15%) 3) Tris-gema-frutose ( 2-20%) com glicerol (4 - 15%) 4) Glicina-gema-leite ( 2-20%) com glicerol e Dimetil Formamida (2- 10%) 5) Tris-fratose-Dimetilsulfóxido (2-10%) 6) Tris-lecitina de soja-frutose ( 2-20%) com glicerol (4 - 15%) a eleição do diluente depende das características inerentes à cada espécie (bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos, suínos) e perticularidades individuais e a diluição visará a obtenção de alíquotas (doses de sêmen) com concentrações compreendidas entre 8,4x106 e 400x106 espermatozóides por mL; 5.- Criopreservação: 5.1. - as doses de sêmen são envasadas em palhetas francesas de 0,25 e/ou 0,5 mL devidamente identificadas; 5.2. - as palhetas são obliteradas/lacradas com álcool polivinílico, ou esferas de metal, ou massa atóxica, ou à alta temperatura; 5.3. - após o envase e obliterção das palhetas, as doses são submetidas à curvas de resfriamento compreendidas entre -0,1 e -1°C por minuto até atingirem o patamar de 5°C (graus Celcius); 5.4. - as doses serão mantidas à esta temperatura por um período de tempo compreendido entre 1 minuto e 10 minutos para estabilização e, quando diluídas com meios contendo glicerol, glicerolização das membranas, o tempo de estabilização/glicerolização será entre 15 minutos (mínimo) e 240 minutos (máximo) dependendo das características espécie-específicas e individuais; 6. - Congelação: vencida esta etapa da biotecnologia da criopreservação, segue a congelação a qual ocorre por curvas compreendidas entre -5 e -30°C por minuto até atingirem o patamar de -120°C (graus Celcius); e 7. - Armazenamento: uma vez congeladas as doses de sêmen serão acondicionadas em raques de crioarmazenamento e estocadas em botijões criobiológicos contendo nitrogênio líquido à uma temperatura de -196°C (graus Celsius) por tempo indeterminado.

EXEMPLO DE OBTENÇÃO

[9] Como o procedimento abrange um grande número de indivíduos (com suas próprias particularidades no tocante criopreservação de espermatozóides) e de diferentes espécies de animais domésticos, será adotado um exemplo que apresenta alta repetibilidade: SÊMEN BOVINO CRIOPRESERVADO EM AMPOLAS DE VIDRO DE 1,0 cc: 1. - Descongelação: 1.1. - descongelação das ampolas de sêmen em água aquecida a uma temperatura de 35°C por 1 (um) minuto; 2. - Análise laboratorial: 2.1. - após a descongelação, as doses foram colocadas em tubo falcon plástico estéril livre ou não de RNAses; 2.2. - todo material recolhido seguiu então para análise onde foram avaliados os seguintes parâmetros: concentração, motilidade, trajetória, tipo de movimento, amplitude de movimento, patologias e danos a ultraestruturas tais como membrana, acrossoma, mitocôndrias e DNA; 3. - Centrifugação: 3.1. - uma vez estabelecidos estes parâmetros, as amostras foram diluídas em Dullbeco’s Modified Phosphate Buffered Solution (DMPBS) aquecido à mesma temperatura de descongelação utilizada no início do processo em uma proporção (volume sêmen : volume diluente) de 3:1 e centrifugados de acordo com o protocolo de 1500g por 5 (cinco) minutos; 4. - Diluição: vencida a etapa da centrifugação os tubos contendo sêmen descongelado e diluído tiveram sua porção sobrenadante desprezada mantendo apenas o “pellet” do fundo do tubo que corresponde à fração rica em espermatozóides que foi então diluída em meio comercial para a criopreservação podendo ser à base de Gema de ovo (20%) com glicerol (7%) a diluição visou a obtenção de alíquotas (doses de sêmen) com concentrações de entre 20 xlO6 eespermatozóides por mL; 5. - Criopreservação: 5.1. - as doses de sêmen foram envasadas em palhetas francesas de 0,25 cc; 5.2. - as palhetas foram obliteradas/lacradas com álcool polivinílico; 5.3. - após o envase e obliterção das palhetas, as doses foram submetidas à curva de resfriamento de -0,5 °C por minuto até atingirem o patamar de 5°C (graus Celcius); 5.4. - as doses foram mantidas à esta temperatura por um período de tempo de 60 minutos para estabilização; 6. - Congelação: vencida esta etapa da biotecnologia da criopreservação, seguiu a congelação a qual ocorreu na curva de -20°C por minuto até atingir o patamar de -120°C (graus Celsius); e 7. - Armazenamento: uma vez congeladas as doses de sêmen foram acondicionadas em raques de crioarmazenamento e estocadas em botijões criobiológicos contendo nitrogênio líquido à uma temperatura de -196°C (graus Celsius).

VANTAGENS OBTIDAS COM O INVENTO

[10] O processo assim obtido, oferece as seguintes e extraordinárias vantagens: - Preservação de material genético de um dado animal tido como superior; - Maior produção de descendentes; - Comercialização do material genético; - Otimização de espaço para estocagem em botijões criobiológicos; - Maior facilidade de manuseio de sêmen antigos; - Possibilita a utilização de sêmen antigos nos aplicadores e descongeladores de sêmen e nas bainhas francesas empregados na inseminação artificial dos dias atuais; e - Reutilização de reprodutores do passado que foram expoentes de sua raça.

[11] A abrangência da presente patente de invenção, não deve ser limitada ao exemplo, mas sim, aos termos definidos nas reivindicações e seus equivalentes.

REIVINDICAÇÕES

Claims (2)

1- PROCESSO DE DESCONGELAÇÃO E RECONGELAÇÃO DE SÊMEN CRIOPRESERVADO, proveniente de amostras congeladas previamente em ampolas de vidro ou mesmo palhetas francesas de 0,50 cc provenientes de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, eqüinos, ovinos e suínos, caracterizado por compreender as seguintes etapas: E- Descongelação: EL- descongelação do sêmen em água aquecida a uma temperatura entre 20°C e 92°C por um período entre 2 segundos e 10 minutos; 2. - Análise laboratorial: 2. E- após a descongelação, colocar as doses em tubo falcon plástico estéril livre ou não de RNAses; 2.2.- avaliação dos seguintes parâmetros: concentração, motilidade, trajetória, tipo de movimento, amplitude de movimento, patologias e danos a ultraestruturas tais como membrana, acrossoma, mitocôndrias e DNA; 3. - Centrifugação: 3. E- uma vez estabelecidos estes parâmetros, as amostras são diluídas em Dullbeco’s Modified Phosphate Buffered Solution (DMPBS), contendo Solução salina fisiológica - NaCl 0,9% - (soro fisiológico) e Ringer Lactato (Agua de côco), aquecidos à mesma temperatura de descongelação utilizada no início do processo em uma proporção (volume sêmen : volume diluente) de 1:1, ou 2:1, ou 3:1 e centrifugados de acordo com os seguintes protocolos: E- 500g por 10 (dez) minutos; 2. - 1500g por 5 (cinco) minutos; 3. - 1800g por 3 (três) minutos; 4, - Diluição: vencida a etapa da centrifugação os tubos contendo sêmen descongelado e diluído terão sua porção sobrenadante desprezada mantendo apenas o “pellet” do fundo do tubo que corresponde à fração rica em espermatozóides que serão então diluída em meio comercial ou de fabricação própria para a criopreservação podendo ser à base de: 1) Glicina-gema-leite ( 2-20%) com glicerol (4 - 15%) 2) Tris-gema-citrato ( 2-20%) com glicerol (4 - 15%) 3) Tris-gema-frutose ( 2-20%) com glicerol (4 - 15%) 4) Glicina-gema-leite ( 2-20%) com glicerol e Dimetil Formamida (2- 10%) 5) Tris-frutose-Dimetilsulfóxido (2-10%) 6) Tris-lecitina de soja-frutose ( 2-20%) com glicerol (4 - 15%) a eleição do diluente depende das características inerentes à cada espécie (bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos, suínos) e perticularidades individuais e a diluição visará a obtenção de alíquotas (doses de sêmen) com concentrações compreendidas entre 8,4x106 e 400x106 espermatozóides por mL; 5. - Criopreservação: 5.1. - as doses de sêmen são envasadas em palhetas francesas de 0,25 e/ou 0,5 mL devidamente identificadas; 5.2. - as palhetas são obliteradas/lacradas com álcool polivinílico, ou esferas de metal, ou massa atóxica, ou à alta temperatura; 5.3. - após o envase e obliterção das palhetas, as doses são submetidas à curvas de resfriamento compreendidas entre -0,1 e -1°C por minuto até atingirem o patamar de 5°C (graus Celcius); 5.4. - as doses serão mantidas à esta temperatura por um período de tempo compreendido entre 1 minuto e 10 minutos para estabilização e, quando diluídas com meios contendo glicerol, glicerolização das membranas, o tempo de estabilização/glicerolização será entre 15 minutos (mínimo) e 240 minutos (máximo) dependendo das características espécie-específicas e individuais; 6, - Congelação: vencida esta etapa da biotecnologia da criopreservação, segue a congelação a qual ocorre por curvas compreendidas entre -5 e -30°C por minuto até atingirem o patamar de -120°C (graus Celcius); e 7. - Armazenamento: uma vez congeladas as doses de sêmen serão acondicionadas em raques de crioarmazenamento e estocadas em botijões criobiológicos contendo nitrogênio líquido à uma temperatura de -196°C (graus Celsius) por tempo indeterminado.

2. PROCESSO DE DESCONGELAÇÃO E RECONGELAÇÃO DE SÊMEN CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela descongelação do sêmen em água aquecida ser preferencialmente à 20°C por 10 (dez) minutos, ou à 35°C por 1 (um) minuto, ou à 37°C por 1 (um) minuto, ou à 46°C por 20 (vinte) segundos, ou à 92°C por 2 (dois segundos).