JPWO2019189758A1

JPWO2019189758A1 - ポリリジン類縁体を含む、細胞増殖促進用組成物

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Publication number: JPWO2019189758A1
Application number: JP2020511090A
Authority: JP
Inventors: 平間　竜介; 竜介平間; りほ小玉; 学北澤; 尚杉本; 弘樹小澤
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2021-04-01
Also published as: US20210009941A1; EP3789488A4; WO2019189758A1; EP3789488A1

Abstract

本発明は、少なくとも１つのアミノ基がジカルボン酸でモノ置換されたポリリジンを含む、細胞増殖促進用組成物を提供する。

Description

本発明は、細胞増殖を促進するための組成物に関する。より具体的には、本発明は、ポリリジン類縁体を含む、幹細胞の増殖を促進し得る培地添加用の組成物等に関する。

再生医療技術は目覚ましい発展を遂げており、例えば、２０１４年には、世界で初めてｉＰＳ細胞を用いた移植手術が行われている。再生医療技術は従来技術では治療が困難であった疾患に対して新たな治療戦略を提供することが可能であると考えられており、さらなる発展が期待されている。

一方で、再生医療は比較的新しい技術であるため解決すべき課題も多い。一例としては、再生医療では、移植可能な組織や臓器を誘導するために大量の幹細胞を要する。そのため幹細胞の大量生産技術を確立する必要が生じるが、幹細胞の大量生産には高価な培地が大量に必要となることから、医療費が高騰する問題も懸念されている。

かかる背景から、より安価で扱いやすい成分を用いた幹細胞培養培地が提案されている（特許文献１）。

ポリリジンは、その結合様式から、ε−ポリリジンとα−ポリリジンに大別される。いずれも必須アミノ酸の一つであるリジンが約１５〜３５個重合したポリマーである。前者はリジン残基の側鎖に存在するε−アミノ基とα−カルボキシル基との間でペプチド結合によりポリマー化したものであり、後者はα位のアミノ基とα−カルボキシル基との間でペプチド結合によりポリマー化したものである。

ε−ポリリジンは食品添加物の一つとしてよく知られており、保存料として用いられている（特許文献２）。また、α−ポリリジンは、培養細胞の付着性を向上させる目的で、培養容器の表面コート剤としてよく利用されている。また、ポリリジンの細胞培養技術への適用としては、細胞および組織の凍結保存用組成物への応用が報告されている（特許文献３）。

特許第６１９７９４７号公報特開２００３−１７１４６２号公報国際公開第２００９／１５７２０９号

本発明は、安全で安価な材料を用いて、細胞増殖を促進し得る新規手段を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、ポリリジン（特に、ε−ポリ−Ｌ−リジンまたはα−ポリ−Ｌ−リジン）のアミノ基をジカルボン酸で修飾したポリリジン類縁体を細胞培養用の培地に溶解させることにより、細胞（特に、幹細胞）の増殖を促進し得ることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。

［１］少なくとも１つのアミノ基がジカルボン酸でモノ置換されたポリリジンを含む、細胞増殖促進用組成物。
［２］ジカルボン酸が、１種または２種以上である、［１］記載の組成物。
［３］ポリリジンが、ε−ポリ−Ｌ−リジンまたはα−ポリ−Ｌ−リジンである、［１］または［２］記載の組成物。
［４］ジカルボン酸が、以下の式ＩＩＩで示される構造のいずれかである、［１］〜［３］のいずれか記載の組成物。

（式中、Ｘは、置換基を有していてもよい低級アルキレン基、置換基を有していてもよい低級アルケニレン基、または−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−であり、Ｘ_１およびＸ_３は置換基を有していてもよい低級アルキレン基であり、Ｘ_２は単結合、置換基を有していてもよい低級アルキレン基、Ｓ、またはＯである）。
［５］ジカルボン酸が、コハク酸、グルタル酸、ジグリコール酸、チオジグリコール酸、マレイン酸、およびシトラコン酸からなる群から選択される１種または２種以上である、［４］記載の組成物。
［６］１種または２種以上のジカルボン酸の、ポリリジン中のアミノ基への導入率が、１０モル％〜１００モル％である、［１］〜［５］のいずれか記載の組成物。
［７］細胞が、幹細胞である、［１］〜［６］のいずれか記載の組成物。
［８］幹細胞が、多能性幹細胞である、［７］記載の組成物。
［９］多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、［８］記載の組成物。
［１０］［１］〜［６］のいずれか記載の組成物を含む、細胞培養用培地。
［１１］細胞が、幹細胞である、［１０］記載の培地。
［１２］幹細胞が、多能性幹細胞である、［１１］記載の培地。
［１３］多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、［１２］記載の培地。
［１４］［１０］記載の培地において、細胞を培養することを特徴とする、細胞増殖を促進する方法。
［１５］細胞が、幹細胞である、［１４］記載の方法。
［１６］幹細胞が、多能性幹細胞である、［１５］記載の方法。
［１７］多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、［１６］記載の方法。

本発明によれば、簡便に細胞（特に、幹細胞）の増殖を促進できるため、大量の細胞を効率よく、且つ安価に調製することができる。

図１は、ポリリジン類縁体１、８、または２０を所定の濃度で含有する培地を用いてｉＰＳ細胞を培養したときの細胞数を示す図である。

本明細書において使用する用語を以下に定義する。

「ハロゲノ基」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである。

本明細書における「低級アルキレン基」とは、炭素数１〜６の、直鎖または分岐状のアルキレン基を意味し、具体的には、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、プロピリデン、ｎ−ブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、ｓｅｃ−ペンチレン、ｔｅｒｔ−ペンチレン、ｎ−ヘキシレン、ｓｅｃ−ヘキシレン、ｔｅｒｔ−ヘキシレン等の基が挙げられる。

本明細書における「低級アルケニレン基」とは、炭素数２〜６の、直鎖または分岐状のアルケニレン基を意味し、具体的には、ビニレン、アリレン、プロペニレン、ブテニレン、プレニレン、ブタジエニレン、ペンテニレン、ペンタジエニレン、ヘキセニレン、ヘキサジエニレン等が挙げられる。

「低級アルキレン基」および「低級アルケニレン基」は、置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、例えば以下が挙げられる。
(1)ハロゲノ基、
(2)ヒドロキシ基、
(3)シアノ基、
(4)ニトロ基、
(5)カルボキシル基、
(6)アルケニル基（Ｃ_２−１０アルケニル基；例、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、ブタジエニル、ヘキサトリエニル、およびその各異性体）、
(7)アルキニル基（Ｃ_２−１０アルキニル基；例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、および、その各異性体）、
(8)ハロゲノアルキル基（例、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、トリフルオロエチル、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、およびその各異性体）、
(9)環状アルキル基（環中にヘテロ原子を含んでもよい）（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル）、
(10)アリール基（例、フェニル、ナフチル）、
(11)ヘテロアリール基（例、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル（例、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル）、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル）、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル）、
(12)アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、２−ペンチルオキシ、３−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、２−ヘキシルオキシ）、
(13)アルキルチオ基（例、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ｔｅｒｔ−ペンチルチオ、ネオペンチルチオ、２−ペンチルチオ、３−ペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ、２−ヘキシルチオ）、
(14)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(15)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(16)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(17)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(18)環状アルキル（環中にヘテロ原子を含んでもよい）オキシ基（例、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、テトラヒドロフラニルオキシ、テトラヒドロピラニルオキシ、アジリジニルオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、モルホリニルオキシ）、
(19)アリールオキシ基（例、アリール基（上記(10)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(20)ヘテロアリールオキシ基（例、ヘテロアリール基（上記(11)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(21)ハロゲノアルコキシ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(22)ハロゲノアルキルチオ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が硫黄原子に結合した基）、
(23)ヒドロキシ基で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(24)アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(25)アミノ基、
(26)アルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、
ここで、「アルキル基」とは、Ｃ_１−６アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等が挙げられる。
(27)カルバモイル基、
(28)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたカルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル）
(29)スルファモイル基、
(30)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたスルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、エチルメチルスルファモイル）、
(31)アルカノイル基（例、水素原子若しくはアルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(32)アロイル基（例、アリール基（上記（10）と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(33)アルキルスルホニルアミノ基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）
(34)アリールスルホニルアミノ基（例、アリール基（上記（10）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(35)へテロアリールスルホニルアミノ基（例、ヘテロアリール基（上記（11）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(36)アシルアミノ基（例、アシル基で置換されたアミノ基）、
ここで、「アシル基」とは、Ｃ_１−６アルキル基、またはＣ_６−１０アリール基を有するアシル基である。ここで、「Ｃ_１−６アルキル基」とは、上記「アルキル基」のうち、炭素数が１〜６のものであり、「Ｃ_6−１０アリール基」とは、上記「アリール基」のうち、炭素数が６〜１０のものである。アシル基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、イソブチロイル基、バレロイル基、イソバレロイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる、
(37)アルコキシカルボニルアミノ基（例、アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換されたカルボニルアミノ基）、
(38)アルキルスルホニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニル基）、
(39)アルキルスルフィニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルフィニル基）、
(40)アルコキシカルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）、等が挙げられる。
置換基が２以上存在する場合は、それらは同一でも異なっていてもよい。

1．細胞増殖促進用組成物
本発明は、少なくとも１つのアミノ基がジカルボン酸でモノ置換されたポリリジンを含む、細胞増殖促進用組成物（以下、「本発明の組成物」とも称することがある）を提供する。一態様において、本発明の組成物においては、ポリリジンは、１種または２種以上であってもよい。

本発明の組成物に用いられるポリリジンは、ε−ポリ−Ｌ−リジン、ε−ポリ−Ｄ−リジン、α−ポリ−Ｌ−リジン、α−ポリ−Ｄ−リジンのいずれであってもよく、また、これらの２種以上の組合せであってもよい。本発明の組成物に用いられるポリリジンとしては、ε−ポリ−Ｌ−リジン（式Ｉ）またはα−ポリ−Ｌ−リジン（式ＩＩ）が好ましい。

（式中、ｎ_１は、１０〜７０（好ましくは、１５〜４０、より好ましくは２０〜４０、特に好ましくは、２０〜３５）の整数である）。
本発明に用いられるε−ポリリジンの数平均分子量は、所望の効果が得られる限り特に限定されないが、通常１,０００〜２０，０００であり、好ましくは１,０００〜１０，０００であり、特に好ましくは、２，０００〜５，０００であり得る。

（式中、ｎ_２は、１０〜１００（好ましくは、２０〜１００、より好ましくは２０〜８０、特に好ましくは、６０〜８０）の整数である）。
本発明に用いられるα−ポリリジンの数平均分子量は、所望の効果が得られる限り特に限定されないが、通常１,０００〜２０，０００であり、好ましくは２,０００〜２０，０００であり、特に好ましくは、７，０００〜１０，０００であり得る。

本発明に用いられるポリリジンは、自体公知の方法により製造することができるほか、市販のものを用いることもできる。市販されるポリリジンの例としては、例えば、「Ｐｏｌｙｅｐｓｉｌｏｎｌｙｓｉｎｅ」（ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈＬｔｄ．ＦＰ１４９８５）や「Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ．ＨＣｌ」（和光純薬工業(株) ３３９−３０７５３）等が挙げられるが、これらに限定されない。

また、本発明の組成物に用いられるジカルボン酸は、所望の効果を奏する限り特に限定されないが、一態様において、以下の式ＩＩＩで示されるジカルボン酸を含む。

（式中、Ｘは、置換基を有していてもよい低級アルキレン基、置換基を有していてもよい低級アルケニレン基、または−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−であり、Ｘ_１およびＸ_３は置換基を有していてもよい低級アルキレン基であり、Ｘ_２は単結合、置換基を有していてもよい低級アルキレン基、Ｓ、またはＯである）。

一態様において、本発明の組成物に用いられるジカルボン酸は、環状酸無水物を形成し得るジカルボン酸であり、具体的には、コハク酸、グルタル酸、ジグルコール酸、チオジグリコール酸、マレイン酸、またはシトラコン酸であり得る。本発明の特に好ましい態様において、ジカルボン酸は、コハク酸およびグルタル酸であり得る。

式Ｉまたは式ＩＩに示されるように、ポリリジンは単位構造の側鎖に１級アミノ基を１つ有している。このアミノ基に対してアミド化を介してジカルボン酸を導入することにより、ポリリジンが修飾される（本明細書において、ジカルボン酸で少なくとも１つのアミノ基が修飾されたポリリジンを「ポリリジン類縁体」と称することがある。従って、本発明の組成物は「ポリリジン類縁体を含む、細胞増殖促進用組成物」とも言い換えられ得る）。ポリリジンを修飾するために用いられるジカルボン酸は、上述したジカルボン酸の１種のみであってよく、または２種以上であってもよい。一態様において、ポリリジンを修飾するジカルボン酸の種類は、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、または８種類で有り得る。ポリリジン中の一部の１級アミノ基、または全ての１級アミノ基に対して、１種または２種以上のジカルボン酸を導入することができる。一態様において、ジカルボン酸のポリリジンへの導入率は、所望の効果を奏する限り特に限定されないが、通常、ポリリジン中の１級アミノ基のモル数に対して１０モル％〜１００モル％、好ましくは２０モル％〜１００モル％、より好ましくは３０モル％〜９０モル％、更に好ましくは３５モル％〜９０モル％、特に好ましくは４０モル％〜８０モル％であり得る。ジカルボン酸を２種以上用いる場合は、各ジカルボン酸のポリリジンへの導入率の総和が、上記範囲となるようにすればよい。本発明に用いられるポリリジン類縁体の調製方法は、自体公知の方法を用いることができる。簡潔には、以下の実施例で詳細に記述されるように、ポリリジンとジカルボン酸無水物を混合して加熱することにより調製することができるが、これに限定されない。

好ましい一態様において、本発明の組成物に含有されるポリリジン類縁体は、ポリリジンがε−ポリリジンである場合は、コハク酸（導入率１０モル％〜９５モル％、好ましくは２０モル％〜９５モル％、より好ましくは４０モル％〜９５モル％、特に好ましくは５０モル％〜９５モル％）、グルタル酸（導入率１０モル％〜９０モル％、好ましくは２０モル％〜９０モル％、より好ましくは４０モル％〜８０モル％、特に好ましくは４５モル％〜７５モル％）、ジグリコール酸（導入率１０モル％〜９０モル％、好ましくは１０モル％〜５０モル％、より好ましくは１０モル％〜３０モル％、特に好ましくは１５モル％〜３０モル％）、チオジグリコール酸（導入率１０モル％〜９０モル％、好ましくは２０モル％〜９０モル％、より好ましくは３０モル％〜７０モル％、特に好ましくは４０モル％〜６０モル％）、マレイン酸（導入率１０モル％〜９０モル％、好ましくは２０モル％〜８０モル％、より好ましくは３０モル％〜６０モル％、特に好ましくは５０モル％〜６０モル％）、シトラコン酸（導入率１０モル％〜９０モル％、好ましくは２０モル％〜９０モル％、より好ましくは４０モル％〜９０モル％、特に好ましくは４５モル％〜８５モル％）、コハク酸およびチオジグリコール酸の組合せ（導入率１０モル％〜９０モル％（２種合計）、好ましくは２０モル％〜９０モル％（２種合計）、より好ましくは４０モル％〜７０モル％（２種合計）、特に好ましくは５０モル％〜６０モル％（２種合計））、ならびに、グルタル酸およびシトラコン酸の組合せ（導入率１０モル％〜９０モル％（２種合計）、好ましくは２０モル％〜９０モル％（２種合計）、より好ましくは４０モル％〜７０モル％（２種合計）、特に好ましくは５０モル％〜６０モル％（２種合計））からなる群から選択されるジカルボンの種類および導入率で修飾されたポリリジンであり得る。また、ポリリジンがα−ポリリジンである場合は、コハク酸（導入率１０モル％〜９０モル％、好ましくは２０モル％〜８０モル％、より好ましくは３０モル％〜６０モル％、特に好ましくは５０モル％〜６０モル％）で修飾されたポリリジンであり得る。

本発明の組成物中のポリリジン類縁体の配合量は、本発明の所望の効果を発揮できる限り制限されないが、組成物の総重量に対して、通常１〜９９．９重量％であり得る。一例としては、本組成物を液体とする場合は、溶解性の点から１〜５％程度とすることができ、また、分散剤とする場合は、７０〜９０％とすることができるが、これらに限定されない。

本発明の組成物は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、または適切な溶媒に溶解した液体、もしくは基板や単体に結合させた状態であり得る。本発明の組成物を製剤化する際の添加物としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、利用可能であれば当業者が自由に選択してよい。

本発明の組成物を溶解させた細胞培養用の培地（培養液を含む）を用いて細胞を培養することで、細胞の増殖を促進することができる。

本発明の組成物は、所望の効果を奏する限り、あらゆる培地に適用することができる。一例としては、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓＭｅｄｉｕｍＦ−１２、Ｈａｍ’ｓＭｅｄｉｕｍＦ−１０、Ｈａｍ’ｓＭｅｄｉｕｍＦ１２Ｋ、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＤＭ−１６０、ＤＭ−２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５、ＲＩＴＣ８０−７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ−１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍＥ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓＢＭＯＣ−３Ｍｅｄｉｕｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（リプロセル社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ培地（味の素株式会社）、ＴｅＳＲＴＭ−Ｅ６（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＨＢ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ｈＥＳＦ−ＧＲＯ培地（ニプロ株式会社）、ＨＥＳＦ−ＤＩＦ培地（ニプロ株式会社）、ＣＳＴＩ−７（株式会社細胞科学研究所）、Ｆ−１２培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＢＧＪｂ培地、又はこれらの混合培地等に、本発明の組成物を適用することができる。また、好ましい一態様において、多能性幹細胞培養用の基礎培地である、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ培地（味の素株式会社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＨＢ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＴｅＳＲ^ＴＭ−Ｅ６（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｈＥＳＦ−ＧＲＯ培地（ニプロ株式会社）、ＨＥＳＦ−ＤＩＦ培地（ニプロ株式会社）、ＣＳＴＩ−７（株式会社細胞科学研究所）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等に、本発明の組成物を適用することができる。

本発明の組成物の培地への添加量は、所望の効果を奏する限り特に限定されないが、通常、ポリリジン類縁体の培地中の濃度が０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．００５〜５ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．０１〜３ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．０３〜３ｍｇ／ｍＬとなる添加量とすることができる。なお、ポリリジン類縁体の培地中の濃度は、培養条件や培養形態（例えば、接着培養または浮遊培養）等を考慮して適宜変更することができる。

本発明の組成物を溶解させた培地を用いて培養することで増殖が促進される細胞の種類に制限はないが、細胞は幹細胞であることが好ましく、多能性幹細胞であることがより好ましい。

本明細書において「多能性幹細胞」とは、自己複製能及び分化／増殖能を有する未熟な細胞であって、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（ＴａｋａｈａｓｈｉＫｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００７Ｎｏｖ３０；１３１（５）：８６１−７２）、精子幹細胞（ｍＧＳ細胞）（Ｋａｎａｔｓｕ−ＳｈｉｎｏｈａｒａＭｅｔａｌ．，ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ．２００７Ｊａｎ；７６（１）：５５−６２）、胚性生殖細胞（ＭａｔｓｕｉＹｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９２Ｓｅｐ４；７０（５）：８４１−７）などが挙げられる。

多能性幹細胞は自体公知の方法により入手できる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、哺乳動物の胚盤胞中の内部細胞塊を培養する方法（例えばＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ２０１４ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓに記載の方法）、体細胞核移植によって作製された初期胚を培養する方法（Ｗｉｌｍｕｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９７Ｆｅｂ２７；３８５（６６１９）：８１０−３、Ｗａｋａｙａｍａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９８Ｊｕｌ２３；３９４（６６９１）：３６９−７４、ＷａｋａｙａｍａＴｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１Ａｐｒ２７；２９２（５５１７）：７４０−３）などが挙げられるが、これらに限定されない。

さらに胚性幹細胞は所定の機関から入手することもできる。例えば、ヒトＥＳ細胞であるＫｈＥＳ−１細胞、ＫｈＥＳ−２細胞およびＫｈＥＳ−３細胞は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の入手方法の例としては、核初期化物質（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４等）を体細胞へ導入する方法（ＴａｋａｈａｓｈｉＫｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００６Ａｕｇ２５；１２６（４）：６６３−７６、ＷＯ２００７／０６９６６６国際公開公報）が挙げられるが、これに限定されない。また、人工多能性幹細胞は、ＴａｋａｈａｓｈｉＫｅｔａｌ．，ＮａｔＰｒｏｔｏｃ．２００７；２（１２）：３０８１−９、Ａｏｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８Ａｕｇ１；３２１（５８８９）：６９９−７０２、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００７Ｎｏｖ３０；１３１（５）：８６１−７２、Ｙｕ，Ｊｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７Ｄｅｃ２１；３１８（５８５８）：１９１７−２０、Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８Ｊａｎ；２６（１）：１０１−６、などに記載の方法に準じて作製することができるが、これらに限定されない。

さらに人工多能性幹細胞は所定の機関から入手することもできる。例えばヒトｉＰＳ細胞である２５３Ｇ１細胞、２０１Ｂ７細胞は、ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社から購入することができる。

胚性生殖細胞は、常法に従って始原生殖細胞を単離し、これをＬＩＦ、ｂＦＧＦおよびＳＣＦの存在下で培養することにより誘導することができる。また、ｍＧＳ細胞はＷＯ２００５／１００５４８に記載される方法に準じて、精巣細胞から作製することができる。

多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であり、より好ましくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。

これらの多能性幹細胞の由来は、通常、哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、マウス等のげっ歯類又はヒト等の霊長類由来の多能性幹細胞であり、より好ましくは、ヒト由来の多能性幹細胞であり、最も好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞である。

本発明の組成物を溶解させた培地を用いての細胞培養の条件は、自体公知の方法に基づき、適宜設定すればよい。例えば、培養温度は、細胞の増殖促進等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。酸素濃度は、通常１〜４０％であるが、培養条件などにより適宜選択される。また、培養形態として、接着培養、浮遊培養、包埋培養、組織培養のいずれを用いてもよい。

２．細胞培養用培地
本発明はまた、本発明の組成物を含む、細胞培養用培地（以下、「本発明の培地」と称することがある）を提供する。

一態様において、本発明の培地は、細胞培養用の培地にポリリジン類縁体を溶解させることにより調製される。細胞培養用の培地は公知または市販の培地であってもよい。公知または市販の培地、および培地に溶解させるポリリジン類縁体の濃度は、「本発明の組成物」において記載したものと同様である。

本発明の培地の形態は、所望の効果が得られる限り特に限定されず、例えば、液体培地、半流動培地、及び固形培地の形態として調製することができる。また、本発明の培地を、粉末状の形態として調製してもよい。粉末状の形態に調製することにより、輸送や保存が容易となり得る。かかる粉末状の培地は、使用直前に滅菌水等を添加し、必要に応じて、メンブレンフィルター等を用いて滅菌することにより、簡便に液体培地とすることができる。本発明の培地は、接着培養、浮遊培養、包埋培養、組織培養等のいずれの培養形態にも用いることができる。

本発明の培地により増殖が促進される細胞の種類は、「本発明の組成物」において記載したものと同様である。

３．細胞培養方法
本発明はまた、本発明の培地において、細胞を培養することを特徴とする細胞増殖を促進する方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。

本発明の方法は、ポリリジン類縁体を溶解させた培地において細胞を培養することを含む、細胞増殖を促進する方法であり得る。

本発明の方法に用いられる既存の細胞培養用の培地、培地に溶解させるポリリジン類縁体の濃度、増殖が促進される細胞の種類および細胞培養の条件等は、「本発明の組成物」において記載したものと同様である。

以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。

[実施例１]ポリリジン類縁体の調製
以下に示す方法により、様々なポリリジン類縁体を調製した。

ポリリジン類縁体１
ε−ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（ＣａｒｂｏｓｙｎｔｈＬｔｄ．ＦＰ１４９８５）２．０ｇ（Ｌｙｓ１ユニットあたり１２．２ｍｍｏｌ）を水３０ｍＬに溶解し、塩基性イオン交換樹脂３０ｍＬ (Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）、ＩＲＡ−４００をアルカリ洗浄してフリー体にしたもの)を加えて振とう後、１時間静置した。桐山漏斗を用いて樹脂をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣を水１０ｍＬに溶解させた。コハク酸無水物７２６ｍｇ（７．２６ｍｍｏｌ、Ｌｙｓ１ユニットあたり０．６当量）を加え、６０℃で２時間撹拌した。放冷後、凍結乾燥し、ε−ポリ−Ｌ−リジンのコハク酸修飾体を白色固体として２．１２ｇ得た。

¹H-NMR(D₂O、400MHz)δ= 1.12-1.53(76.6, m), 1.53-1.90(42.1,m), 2.36-2.62(53.5,m),2.845-3.00(2.55,m), 3.00-3.30(36.5,m), 3.60-3.74(1.0,m), 3.74-3.97(5.5,m), 3.98-4.23(12.4,m)

^１Ｈ−ＮＭＲの３．８ｐｐｍ付近のブロードピークをアシル基未導入のリジン残基α位プロトン、４．１ｐｐｍ付近のブロードピークをアシル化されたリジン残基α位プロトンと捉え、アシル化導入比率を算出した。
アシル基導入率（ポリリジン類縁体１）＝０．６９

ポリリジン類縁体２〜１９、３０、３１
以下の表１に示される環状酸無水物の種類および量を用いて、ポリリジン類縁体２〜１９、３０、３１を調製した。ポリリジン類縁体２〜１９については、反応条件はポリリジン類縁体１の調製において用いた条件と同様のものを用い、ポリリジン類縁体３０、３１については、原料としてε−ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（ＣａｒｂｏｓｙｎｔｈＬｔｄ．ＦＰ１４９８５、Ｌｙｓ１ユニットあたり１２．２ｍｍｏｌ）の代わりに、公知の方法で合成可能な２０量体のε−ポリ−Ｌ−リジンＴＦＡ塩（Ｌｙｓ１ユニットあたり１１．６ｍｍｏｌ）を用いた。必要に応じて凍結乾燥前にＭｗＣＯ１０００Ｄａの透析チューブで透析を行った。アシル基導入率も同様にして算出した。

ポリリジン類縁体２０
α−ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（和光純薬３３９−３０７５３）１．０ｇ（Ｌｙｓ１ユニットあたり６．１ｍｍｏｌ）を水：アセトニトリル＝１：１からなる混合液１０ｍＬに溶解し、炭酸水素ナトリウム６１３ｍｇ、コハク酸無水物３６５ｍｇ（Ｌｙｓ１ユニットあたり０．６当量）を順に加え、６０℃で２時間撹拌した。空冷後、反応液を、外液を交換しながら２日間透析し（ＭＷＣＯ＝１０００）、得られた溶液を凍結乾燥することにより、α−ポリ−Ｌ−リジンのコハク酸修飾体を白色個体として９０６ｍｇ得た（アシル基導入率＝０．６０）。

ポリリジン類縁体２１および２２
以下の表２に示される環状酸無水物の種類および量を用いて、ポリリジン類縁体２１および２２を調製した。反応条件はポリリジン類縁体１の調製において用いた条件と同様のものを用い、０．５〜１ｇの修飾体を２０ｍＬの水に溶解後、１Ｍ−ＮａＯＨでｐＨ７となるように中和後、凍結乾燥することにより合成した。

[実施例２]ポリリジン類縁体の細胞増殖促進効果１（培養後コロニー形成数の評価）
実施例１で調製したポリリジン類縁体を細胞培養培地に溶解させ、その細胞増殖促進効果を確認した。

より詳細には、ｉＰＳ細胞は、ｉＰＳアカデミアジャパン社より購入した２０１Ｂ７株を用いた。細胞培養は、ビトロネクチン（ライフテクノロジー社）をコートした培養容器（日本ベク卜ンディッキンソン製２４ウェルセルカルチャープレート）を用い、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（インビ卜ロジェン社製）に、被験化合物水溶液を所定の濃度となるよう添加して被験培地とした。これを直ちに、もしくは、４℃中２〜４週間保管した後に、培養に用いることにより、その効果を検討した。ｉＰＳ細胞懸濁液は６００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるよう播種した。播種時に使用する培地にはＹ−２７６３２を添加（最終濃度１０μＭ、ナカライテスク社製：０８９４５−８４）した。播種より２日目にＹ−２７６３２を添加していない被験培地に交換した。播種より３日後に、接着した細胞の様子を蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７００（キーエンス社）を用いて、取扱説明書に準じて位相差画像を９視野／ｗｅｌｌ（面積０．５７cm^２）撮影した。各ｗｅｌｌにおけるコロニー数を、上記装置付属の解析ソフトを用いて計測し、被験化合物を添加せずに同様の培養を行った際のコロニー数と比較した。

活性強度は、ポリリジン類縁体非添加群に対して３倍以上のコロニーが形成されたものを「＋＋」、１．２倍以上のコロニーが形成されたものを「＋」として示した。また、ポリリジン類縁体の添加濃度を併記した。結果を以下表３に示す。

[実施例３]ポリリジン類縁体の細胞増殖促進効果２（培養後細胞数の評価）
ｉＰＳ細胞は、ｉＰＳアカデミアジャパン社より購入した２０１Ｂ７株を用いた。細胞培養は、ビトロネクチン（ライフテクノロジー社）をコートした培養容器（日本ベク卜ンディッキンソン社、Ｆａｌｃｏｎ培養シャ一レもしくはＦａｌｃｏｎ培養プレ一卜）を用い、５％ＣＯ_２／３７℃の条件で行った。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（インビ卜ロジェン社製）に、ポリリジン類縁体１、８または２０の水溶液を所定の最終濃度となるよう添加して被験培地とした。これを直ちに、もしくは、４℃中２〜４週間保管した後に、培養に用いることにより、その効果を検討した。播種時に使用する培地にはＹ−２７６３２を添加（最終濃度１０μＭ、ナカライテスク社製：０８９４５−８４)した。翌日以降はＹ−２７６３２を添加していない被験培地で培養した。２〜３日毎に培地交換を行い、６日間培養後、細胞数を測定した。細胞数の測定は、「改訂細胞培養入門ノー卜、７７〜８３頁、２０１０年、羊土社」に記載の方法により行い、被験化合物を添加せずに同様の培養を行った際の細胞数と比較した。結果を図１に示す。

[実施例４]ポリリジン類縁体の細胞増殖促進効果３（培養後コロニー形成数の評価）
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８の代わりにＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２を用いる以外は、実施例２と同様の条件で実験を行い、ポリリジン類縁体の細胞増殖促進効果を確認した。活性強度は、ポリリジン類縁体非添加群に対して３倍以上のコロニーが形成されたものを「＋＋」、１．２倍以上のコロニーが形成されたものを「＋」として示した。また、ポリリジン類縁体の添加濃度を併記した。結果を以下表４に示す。

本発明によれば、大量の細胞（特に、幹細胞）を効率よく、且つ安価に調製することができるため、再生医療の分野において極めて有益である。

本出願は、日本で出願された特願２０１８−０６９８５２（出願日：２０１８年３月３０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

少なくとも１つのアミノ基がジカルボン酸でモノ置換されたポリリジンを含む、細胞増殖促進用組成物。
ジカルボン酸が、１種または２種以上である、請求項１記載の組成物。
ポリリジンが、ε−ポリ−Ｌ−リジンまたはα−ポリ−Ｌ−リジンである、請求項１または２記載の組成物。
ジカルボン酸が、以下の式ＩＩＩで示される構造のいずれかである、請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。

（式中、Ｘは、置換基を有していてもよい低級アルキレン基、置換基を有していてもよい低級アルケニレン基、または−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−であり、Ｘ_１およびＸ_３は置換基を有していてもよい低級アルキレン基であり、Ｘ_２は単結合、置換基を有していてもよい低級アルキレン基、Ｓ、またはＯである）。
ジカルボン酸が、コハク酸、グルタル酸、ジグリコール酸、チオジグリコール酸、マレイン酸、およびシトラコン酸からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項４記載の組成物。
１種または２種以上のジカルボン酸の、ポリリジン中のアミノ基への導入率が、１０モル％〜１００モル％である、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
細胞が、幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項７記載の組成物。
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項８記載の組成物。
請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物を含む、細胞培養用培地。
細胞が、幹細胞である、請求項１０記載の培地。
幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１１記載の培地。
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項１２記載の培地。
請求項１０記載の培地において、細胞を培養することを特徴とする、細胞増殖を促進する方法。
細胞が、幹細胞である、請求項１４記載の方法。
幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１５記載の方法。
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項１６記載の方法。