CN115152740A - 一种猪组织长期保存液及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及猪组织保存技术领域，且公开了一种猪组织长期保存液，包括保护液P、冷冻液A以及冷冻液B；所述保护液P包括HTF溶液和5％的HSA；所述冷冻液A包括保存液P、8％的乙二醇和8％的二甲基亚砜；所述冷冻液B包括保存液P、16％的乙二醇、14％的二甲基亚砜和8mg/ml的Ficoll400、以及0.6mol/l的蔗糖。该猪组织长期保存液，通过保护液P、冷冻液A和冷冻液B的作用，可保护组织样本中的细胞免受溶液损伤和冰晶损伤，保护剂P可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，冷冻剂可同组织样本中的水分子结合，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成。
Description
技术领域
本发明涉及猪组织保存技术领域，具体为一种猪组织长期保存液及其使用方法。
背景技术
我国地方猪的种质资源非常丰富，但非洲猪瘟作为广泛传播的高致死疫病，严重威胁着我国地方的种质资源保存，目前只能通过冷冻保存猪组织细胞和精液的方法，但是这两种方式都存在弊端，体细胞保存需要将新鲜的组织运送到细胞室进行细胞分离培养再保存，不仅成本高而且不能在猪场现场操作，而精液冻存因猪个体差异大，只有部分猪的精液适合冻存。
所以针对上述提出的问题，现在急需一种猪组织长期保存液，来对地方猪的种质资源进行保存，从而来获得更好的猪品种。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种猪组织长期保存液，具备保存时间长，且便于操作等优点。
为实现上述保存时间长，且便于操作等目的，本发明提供如下技术方案：一种猪组织长期保存液，包括保护液P、冷冻液A以及冷冻液B；
所述保护液P包括HTF溶液和5％的HSA；
所述冷冻液A包括保存液P、8％的乙二醇和8％的二甲基亚砜；
所述冷冻液B包括保存液P、16％的乙二醇、14％的二甲基亚砜和8mg/ml的Ficoll400、以及0.6mol/l的蔗糖。
进一步，所述保护液A中的HTF溶液在使用之前需要经过HEPES溶液缓冲，所述保护液P在细胞内外维持一定浓度的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度。
进一步，所述保护液P、冷冻液A以及冷冻液B均需要在4℃～8℃温度下进行冷藏保存，所述冷冻液A为渗透性冷冻保护剂，可渗透到细胞内。
一种猪组织长期保存液的使用方法，包括以下步骤：
步骤一：从4℃的冰箱中取出组织冷冻液A和冷冻液B，使用前上下晃动2-3次，将其溶液摇晃均匀，分别吸入1～1.5ml保护液P、冷冻液A和冷冻液B到2ml的不同冻存管中进行保存；
步骤二：将获得的猪组织从装有双抗的保护液内取出，转入装有保护液P的冻存管中，待平衡2～3min，得到冻存管a，通过在显微镜下观察组织细胞数量为m1，以及通过试验得出组织细胞在该冻存管a中的存活时间为t1。
步骤三：将步骤二中的组织转移到冷冻液A中3～5min，得到冻存管b，通过显微镜观察组织细胞数量为m2，以及通过试验得出组织细胞在该冻存管b中的存活时间为t2。
步骤四：将组织从步骤三中装有冷冻液A的冻存管中转移至装有冷冻液B的冻存管中，得到冻存管c，通过显微镜观察组织细胞数量为m3，以及通过试验得出组织细胞在该冻存管c中的存活时间为t3。
进一步，所述冻存管a、冻存管b以及冻存管c在得到之后，都需要迅速放入液氮中保存，为后续对组织进行解冻分离培养细胞。
与现有技术相比，本发明提供了一种猪组织长期保存液，具备以下有益效果：
该猪组织长期保存液，通过保护液P、冷冻液A和冷冻液B的作用，可保护组织样本中的细胞免受溶液损伤和冰晶损伤，保护剂P可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，冷冻剂可同组织样本中的水分子结合，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成。
附图说明
图1为本发明中猪组织在不同保存液中培养时间表。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，其为该猪组织在保存液中存活的时间，取猪组织细胞分为三分，分别为猪组织a、猪组织b以及猪组织c，本发明提供了一种猪组织长期保存液，在现有保存液的基础上，包括保护液P、冷冻液A以及冷冻液B；
所述保护液P包括HTF(异种促甲状腺因子)溶液和5％的HSA(血清白蛋白)；
所述冷冻液A包括保存液P、8％的乙二醇和8％的二甲基亚砜；
所述冷冻液B包括保存液P、16％的乙二醇、14％的二甲基亚砜和8mg/ml的Ficoll400、以及0.6mol/l的蔗糖，本实施例中，乙二醇和二甲基亚砜都属于可渗透到细胞内的小分子物质，而蔗糖属于非渗透性冷冻保护剂大分子物质。
保护液A中的HTF溶液在使用之前需要经过HEPES溶液缓冲，HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，对细胞无毒性作用，所述保护液P在细胞内外维持一定浓度的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，冷冻剂可同组织样本中的水分子结合，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加，从而减少结晶的行成。
另外，保护液P、冷冻液A以及冷冻液B均需要在4℃～8℃温度下进行冷藏保存，4℃～8℃的冷藏条件，在家用冰箱就可以实现这一条件，所以保存条件容易达到，并且在本实施例中所述冷冻液A为渗透性冷冻保护剂，可渗透到细胞内。
本实施例中各个成分含量如下：
保护液P中组成成分表
冷冻液A中组成成分表
冷冻液B中组成成分表
综上所示，保存液制作完毕。
一种猪组织长期保存液的使用方法，包括以下步骤：
步骤一：从4℃的冰箱中取出组织冷冻液A和冷冻液B，使用前上下晃动2-3次，将其溶液摇晃均匀，分别吸入1～1.5ml保护液P、冷冻液A和冷冻液B到2ml的不同冻存管中进行保存；
步骤二：将获得的猪组织从装有双抗的保护液内取出，转入装有保护液P的冻存管中，待平衡2～3min，得到冻存管a，通过在显微镜下观察组织细胞数量为m1，以及通过试验得出组织细胞在该冻存管a中的存活时间为t1。
步骤三：将步骤二中的组织转移到冷冻液A中3～5min，得到冻存管b，通过显微镜观察组织细胞数量为m2，以及通过试验得出组织细胞在该冻存管b中的存活时间为t2。
步骤四：将组织从步骤三中装有冷冻液A的冻存管中转移至装有冷冻液B的冻存管中，得到冻存管c，通过显微镜观察组织细胞数量为m3，以及通过试验得出组织细胞在该冻存管c中的存活时间为t3。
在本实施例中，获得的冻存管a、冻存管b以及冻存管c都需要迅速的放入液氮中保存，为后续对组织进行解冻分离培养细胞。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种猪组织长期保存液，其特征在于：包括保护液P、冷冻液A以及冷冻液B；
所述保护液P包括HTF溶液和5％的HSA；
所述冷冻液A包括保存液P、8％的乙二醇和8％的二甲基亚砜；
所述冷冻液B包括保存液P、16％的乙二醇、14％的二甲基亚砜和8mg/ml的Ficoll400、以及0.6mol/l的蔗糖。
2.根据权利要求1所述的猪组织长期保存液，其特征在于：所述保护液A中的HTF溶液在使用之前需要经过HEPES溶液缓冲，所述保护液P在细胞内外维持一定浓度的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度。
3.根据权利要求1所述的猪组织长期保存液，其特征在于：所述保护液P、冷冻液A以及冷冻液B均需要在4℃～8℃温度下进行冷藏保存，所述冷冻液A为渗透性冷冻保护剂，可渗透到细胞内。
4.一种猪组织长期保存液的使用方法，采用如权利要求1-3任一项所述的猪组织保存液，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：从4℃的冰箱中取出组织冷冻液A和冷冻液B，使用前上下晃动2-3次，将其溶液摇晃均匀，分别吸入1～1.5ml保护液P、冷冻液A和冷冻液B到2ml的不同冻存管中进行保存；
步骤二：将获得的猪组织从装有双抗的保护液内取出，转入装有保护液P的冻存管中，待平衡2～3min，得到冻存管a，通过在显微镜下观察组织细胞数量为m1，以及通过试验得出组织细胞在该冻存管a中的存活时间为t1。
步骤三：将步骤二中的组织转移到冷冻液A中3～5min，得到冻存管b，通过显微镜观察组织细胞数量为m2，以及通过试验得出组织细胞在该冻存管b中的存活时间为t2。
步骤四：将组织从步骤三中装有冷冻液A的冻存管中转移至装有冷冻液B的冻存管中，得到冻存管c，通过显微镜观察组织细胞数量为m3，以及通过试验得出组织细胞在该冻存管c中的存活时间为t3。
5.根据权利要求4所述的猪组织长期保存液的使用方法，其特征在于：所述冻存管a、冻存管b以及冻存管c在得到之后，都需要迅速放入液氮中保存，为后续对组织进行解冻分离培养细胞。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20221011 |