CN117502427A - 一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂及牛体外胚胎一步法冷冻方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂及牛体外胚胎一步法冷冻方法，属于动物胚胎冷冻保存及胚胎移植技术领域。本发明所述的添加剂为包含氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、丙酮酸钠、氯化钙、牛血清白蛋白、蔗糖、乙二醇和透明质酸的水溶液；蔗糖的浓度为4.5～5.0M。本发明在牛体外胚胎一步法冷冻的基础上，通过提高常规一步法冷冻液中蔗糖浓度并额外添加透明质酸，增加了冷冻液的渗透压，有利于胚胎内部水分的排出，减少了冷冻过程中的胚胎内部冰晶形成，降低了冷冻过程对胚胎的损伤，提高牛体外胚胎冷冻解冻后的存活率、孵化率及解冻后胚胎的移植妊娠率。
Description
技术领域
本发明属于动物胚胎冷冻保存及胚胎移植技术领域，具体涉及一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂及牛体外胚胎一步法冷冻方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胚胎的冷冻保存可以使胚胎的应用不受时间和空间的限制，并可以防止由于疾病和其它原因造成的动物品系和稀有突变体的丢失。但每年移植的牛胚胎中，冷冻保存的胚胎占比不足50％，多数胚胎仍以鲜胚移植的方式进行使用。究其原因在于：体外胚胎对低温保存敏感，冷冻后体外胚胎的存活率和移植妊娠率要明显低于体内胚胎。目前常用的提高冷冻后体外胚胎存活率和移植妊娠率的方法为使用冷冻保护剂，如二甲基亚砜、甘油、丙二醇、甲醇、聚乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、木糖等。但目前冷冻保护剂的使用效果并不理想，解冻后胚胎24h存活率、48h孵化率以及移植后的受胎率都较低，需要进一步研发冷冻保护剂来有效提高牛体外胚胎冷冻效率，提高牛胚胎冷冻解冻后的存活率、孵化率及胚胎解冻后的移植妊娠率。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂及牛体外胚胎一步法冷冻方法，本发明提供的牛体外胚胎一步法冷冻液添加剂可以添加到胚胎冷冻液中并获得理想的移植受胎率。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的第一个方面，提供一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂，所述添加剂为包含氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、丙酮酸钠、氯化钙、牛血清白蛋白、蔗糖、乙二醇和透明质酸的水溶液；
所述蔗糖的浓度为4.5～5.0M。
本发明在牛体外胚胎一步法冷冻的基础上，开发了一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂，通过提高常规一步法冷冻液中蔗糖浓度并额外添加透明质酸，增加了冷冻液的渗透压，有利于胚胎内部水分的排出，减少了冷冻过程中的胚胎内部冰晶形成，降低了冷冻过程对胚胎的损伤，提高牛体外胚胎冷冻解冻后的存活率、孵化率及解冻后胚胎的移植妊娠率。
具体的，透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖，天然存在于哺乳动物组织细胞外基质和细胞间质中，是雌性动物生殖道中含量最丰富的大分子之一。牛体外胚胎一步法冷冻液中添加透明质酸并结合高浓度蔗糖的存在，可以在冷冻过程中，促进胚胎内多余水分的排出，减少冰晶的形成，提高胚胎冷冻解冻后的存活率、孵化率。一步法冷冻牛体外胚胎解冻后直接移植，冷冻液充当移植液，移植液中的透明质酸可以间接促进血管生成，促进细胞与细胞间和细胞与基质间的黏附，从而有助于胚胎着床。同时，透明质酸的高粘度能防止胚胎从子宫腔中排出，提高移植受胎率。
在本发明的一些实施例中，所述牛体外胚胎一步法冷冻液添加剂中各组分浓度为：5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、1～5g/L牛血清白蛋白、4.5～5.0M蔗糖、1.0～2.0M乙二醇、3～8mg/mL透明质酸。
在本发明的一些实施例中，所述牛体外胚胎一步法冷冻液添加剂中各组分浓度为：8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、4.6M蔗糖、1.5M乙二醇、5mg/mL透明质酸。
在本发明的一些实施例中，所述氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、丙酮酸钠、氯化钙、牛血清白蛋白、蔗糖、乙二醇和透明质酸的纯度均为细胞培养级及以上。例如Sigma-aldrich公司的产品。
本发明的第二个方面，提供一种牛体外胚胎一步法冷冻方法，包括如下步骤：
(1)配制上述的牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂；
(2)将所述添加剂与胚胎冷冻液混匀，得到含有添加剂的冷冻液；
(3)将所述含有添加剂的冷冻液与胚胎冷冻液混匀，得到平衡液；
(4)将待冷冻胚胎移入平衡液滴，静置后，将待冷冻胚胎从平衡液滴移入含有添加剂的冷冻液中；
(5)将待冷冻胚胎装入麦管，控制温度进行冷冻。
在本发明的一些实施例中，所述胚胎冷冻液为自制胚胎冷冻液或商业化胚胎冷冻液。
优选的，所述自制胚胎冷冻液为包含5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、1～5g/L牛血清白蛋白、0.1～0.5M蔗糖和1.0～2.0M乙二醇的水溶液。
进一步优选的，所述自制胚胎冷冻液为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖、1.5M乙二醇的水溶液。
在本发明的一些实施例中，按照5～10:1～3的体积比将胚胎冷冻液与一步法冷冻液添加剂混合均匀后形成含有添加剂的冷冻液；所述体积比优选为8：2。
在本发明的一些实施例中，按照1～2：1～2的体积比将胚胎保存液和含有添加剂的冷冻液混合均匀后形成平衡液滴；所述体积比优选为1：1。体积比为1:1时，平衡液渗透压处于胚胎保存液与含有添加剂的冷冻液之间，处理胚胎时，胚胎所处环境处于渗透压稳步升高。即：保存液(渗透压与胚胎等同)-平衡液(渗透压处于保存液与冷冻液之间)-冷冻液(渗透压最高)。
在本发明的一些实施例中，将待冷冻胚胎移入平衡液滴，静置1～2分钟，优选为1分钟。静置时，平衡液滴迅速对胚胎进行保护剂的渗透及脱水,使胚胎在冷冻试剂中达到平衡状态。
在本发明的一些实施例中，所述将待冷冻胚胎装入麦管为：按照胚胎保存液、气泡、胚胎保存液、气泡、含有胚胎的含有添加剂的冷冻液、气泡、胚胎保存液、气泡、胚胎保存液的顺序进行五段式装管，其中每段液柱的长度相同，将胚胎装入麦管中。
其中，所述胚胎保存液可为自配胚胎保存液，也可选为商业化胚胎保存液。所述自配胚胎保存液为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白的水溶液。商业化胚胎保存液品牌为ICPbio，商业化名称为EMCARETMHolding Solution。商业化冷冻液与商业化保存液配合使用，自制胚胎冷冻液与自配胚胎保存液配合使用
本发明对胚胎装管方式进行了特殊设计，将胚胎保存液和含有胚胎的含有添加剂的冷冻液按顺序装入麦管中，由于冷冻过程中特殊的装管方式，解冻后胚胎可以在不更换麦管内容物的情况下，在麦管内部实现对高浓度蔗糖的稀释。最后，解冻后麦管中的冷冻液经过稀释作为胚胎移植液，其中含有的透明质酸在后续移植过程中可以充当结合剂和保护剂，有助于胚胎植入。因此，利用本发明提供的牛体外胚胎一步法冷冻方法，对牛体外胚胎进行冷冻，能降低冷冻过程中的胚胎损伤，提高解冻后胚胎的存活率及孵化率，并能获得较理想的移植受胎率。
在本发明的一些实施例中，所述控制温度进行冷冻具体为：将装有待冷冻胚胎的麦管于-5℃～-10℃下植冰后，优选为-6℃，按照0.5℃/min的降温速度降至-30℃～-40℃，优选为-35℃，然后将装有待冷冻胚胎的麦管投入液氮中。
本发明采用常规冷冻的方式进行体外胚胎冷冻保存，原因如下：1、常规冷冻保存的胚胎在解冻后可以直接移植，降低生产条件需求，大大节省胚胎移植时间成本；2、该方法对操作人员的技术要求不高。但与未冷冻的胚胎相比，常规冷冻胚胎的孵化率、存活率显著降低。本发明通过添加剂的使用以及特殊的装管方式，对牛体外胚胎进行冷冻，能降低冷冻过程中的胚胎损伤，提高解冻后胚胎的存活率及孵化率，并能获得较理想的移植受胎率。
在本发明的一些实施例中，牛体外胚胎解冻后在5分钟内移植到处于发情第7天的受体牛体内。胚胎移植后30天，可使用B超对受体牛进行孕检，统计胚胎移植受胎率。
在本发明的一些实施例中，牛体外胚胎解冻后可进行胚胎培养，具体为：将解冻后的胚胎从麦管中转移到胚胎培养液中，经过胚胎培养液洗涤后，放入新的胚胎培养液中，于38.5℃、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气(体积百分比)、饱和湿度的环境中继续培养48小时。
在本发明的一些实施例中，所述解冻为：从液氮中取出冷冻保存的胚胎，空气中暴露10秒，投入30℃的温水中，停留30秒；30秒后，甩动麦管，使麦管内各段液柱混合均匀。按照本发明所提供的方法对牛体外胚胎进行一步法冷冻时，解冻后胚胎可以跳过分步解冻、脱除冷冻保护剂等步骤实现直接移植。
本发明的有益效果为：
本发明在牛体外胚胎一步法冷冻的基础上，开发了一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂，通过提高常规一步法冷冻液中蔗糖浓度并额外添加透明质酸，增加了冷冻液的渗透压，有利于胚胎内部水分的排出，减少了冷冻过程中的胚胎内部冰晶形成，降低了冷冻过程对胚胎的损伤，提高牛体外胚胎冷冻解冻后的存活率、孵化率及解冻后胚胎的移植妊娠率。
将本发明所涉及的牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂，按照比例添加到牛体外胚胎一步法冷冻液中，并按照本发明所提供的方法对牛体外胚胎进行一步法冷冻，解冻后胚胎可以跳过分步解冻、脱除冷冻保护剂等步骤实现直接移植。冷冻过程中，由于添加剂的使用，冷冻液中含有较高浓度的蔗糖，并添加了透明质酸，增加了冷冻液的渗透压，有利于胚胎内部水分的排出，减少了冷冻过程中的胚胎内部冰晶形成，降低了冷冻过程对胚胎的损伤。同时，由于冷冻过程中特殊的装管方式，使解冻后胚胎可以在不更换麦管内容物的情况下，在麦管内部实现对高浓度蔗糖的稀释。最后，解冻后麦管中的冷冻液经过稀释作为胚胎移植液，其中含有的透明质酸在后续移植过程中可以充当结合剂和保护剂，有助于胚胎植入。因此，利用本发明提供的一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂及牛体外胚胎一步法冷冻方法，对牛体外胚胎进行冷冻，能降低冷冻过程中的胚胎损伤，提高解冻后胚胎的存活率及孵化率，并能获得较理想的移植受胎率。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明一种牛体外胚胎一步法冷冻方法的流程图；
图2为利用本发明进行牛体外胚胎一步法冷冻过程中装管示意图；
图3为常规牛体外胚胎一步法冷冻过程中装管示意图。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
名词解释
一步法冷冻：一步法冷冻是针对于移植来说，即通常所说程序化冷冻，通过这种方式冷冻的胚胎在解冻时，可以一步法解冻之后直接移植。
以下实施例所用试剂纯度均为细胞培养级别以上，例如Sigma-aldrich公司的产品。
实施例1
一种牛体外胚胎一步法冷冻方法，包括使用含有添加剂的自制胚胎冷冻液对牛体外胚胎进行冷冻及移植，具体内容如下：
(1)一步法冷冻液添加剂的配制
一步法冷冻液添加剂为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、4.6M蔗糖、1.5M乙二醇和5mg/mL透明质酸的水溶液。
准确称取各组分后加入水中混匀即得一步法冷冻液添加剂。
所用试剂纯度均为细胞培养级别以上。
(2)自制胚胎冷冻液的配制
自制胚胎冷冻液为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖、1.5M乙二醇的水溶液。
准确称取各组分后加入水中混匀即得自制胚胎冷冻液。
(3)含有添加剂的冷冻液的配置
将步骤(2)制备得到的自制胚胎冷冻液和步骤(1)制备得到的一步法冷冻液添加剂按照8:2的体积比混合均匀，形成含有添加剂的冷冻液。
(4)胚胎冷冻
①将自配胚胎保存液和含有添加剂的冷冻液按照1:1的比例配制体积为500微升的平衡液滴；
所述自配胚胎保存液为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白的水溶液。
②将待冷冻胚胎移入平衡液滴，静置1分钟；
③将待冷冻胚胎从平衡液滴移入含有添加剂的冷冻液中；
④按照胚胎保存液、气泡、胚胎保存液、气泡、含有胚胎的含有添加剂的冷冻液、气泡、胚胎保存液、气泡、胚胎保存液的顺序进行五段式装管，其中每段液柱的长度相同，将胚胎装入0.25mL麦管中；
⑤麦管用麦管塞封口后，室温静置5-10分钟；
⑥将胚胎放入预冷至-6℃的程序控温仪中，植冰后，按照0.5℃/分钟的降温速度降至-35℃；
⑦冷冻程序运行完毕，将麦管投入液氮；
(5)胚胎解冻
胚胎解冻：从液氮中取出冷冻保存的胚胎，空气中暴露10秒，投入30℃的温水中，停留30秒；30秒后，甩动麦管，使麦管内各段液柱混合均匀。
胚胎培养：将解冻后的胚胎从麦管中转移到胚胎培养液中，经过胚胎培养液洗涤后，放入新的胚胎培养液中，于38.5℃、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度的环境中继续培养48小时，分别统计培养24小时后的胚胎存活率及48小时后的胚胎孵化率，具体结果见表1。
(6)胚胎移植
对冷冻后胚胎进行一步法解冻，解冻步骤为：从液氮中取出冷冻保存的胚胎，空气中暴露10秒，投入30℃的温水中，停留30秒；30秒后，甩动麦管，使麦管内各段液柱混合均匀。
解冻后胚胎在5分钟内移植到发情后第7天(发情当天为第0天，由此推算的第7天)的受体牛体内；胚胎移植后30天，使用B超对受体牛进行孕检，统计胚胎移植受胎率。具体结果见表2。
为了验证本发明的效果，设置对比例进行对比，具体如下：
对比例1
参照实施例1的方式，对牛体外胚胎进行冷冻及移植，不同的是，对比例1中胚胎冷冻仅使用自制胚胎冷冻液对胚胎进行冷冻，不额外添加本发明提供的添加剂。但胚胎装管方式及其余胚胎冷冻、胚胎解冻、胚胎移植参照实施例1。
对比例2
参照实施例1的方式，对牛体外胚胎进行冷冻及移植，不同的是，对比例2中胚胎冷冻仅使用自制胚胎冷冻液对胚胎进行冷冻，不额外添加本发明提供的添加剂。且胚胎装管方式为胚胎冷冻液、气泡、胚胎冷冻液、气泡、含有胚胎的冷冻液、气泡、胚胎冷冻液、气泡、胚胎冷冻液的顺序进行五段式装管，其中每段液柱的长度相同，将胚胎装入0.25mL麦管中。
实施例2
参照实施例1的方式，对牛体外胚胎进行冷冻及移植，不同的是，使用含有添加剂的商业化冷冻液对牛体外胚胎进行冷冻及移植。
(1)一步法冷冻液添加剂的配制：同实施例1。
(2)含有添加剂的胚胎冷冻液的配制
将商业化冷冻液与步骤(1)制备得到的一步法冷冻液添加剂按照8:2的体积比混合均匀后形成含有添加剂的胚胎冷冻液。所述商业化冷冻液品牌为ICPbio，商业化名称为EMCARETMEthylene Glycol 1.5M
所用试剂纯度均为细胞培养级别以上，例如Sigma-aldrich公司的产品。
(3)胚胎冷冻：参照实施例1，具体如下
①将商业化胚胎保存液和含有添加剂的冷冻液按照1:1的比例配制体积为500微升的平衡液滴；商业化胚胎保存液品牌为ICPbio，商业化名称为EMCARETMHoldingSolution。
②将待冷冻胚胎移入平衡液滴，静置1分钟；
③将待冷冻胚胎从平衡液滴移入含有添加剂的冷冻液中；
④按照胚胎保存液、气泡、胚胎保存液、气泡、含有胚胎的含有添加剂的冷冻液、气泡、胚胎保存液、气泡、胚胎保存液的顺序进行五段式装管，其中每段液柱的长度相同，将胚胎装入0.25mL麦管中；
⑤麦管用麦管塞封口后，室温静置5-10分钟；
⑥将胚胎放入预冷至-6℃的程序控温仪中，植冰后，按照0.5℃/分钟的降温速度降至-35℃；
⑦冷冻程序运行完毕，将麦管投入液氮；
(4)胚胎解冻同实施例1
(5)胚胎移植同实施例1
为了验证本发明的效果，设置对比例进行对比，具体如下：
对比例3
参照实施例2的方式，对牛体外胚胎进行冷冻及移植，不同的是，对比例3中胚胎冷冻仅使用商业化冷冻液对胚胎进行冷冻，不额外添加本发明提供的添加剂。但胚胎装管方式及其余胚胎冷冻、胚胎解冻、胚胎移植参照实施例2。
对比例4
参照实施例2的方式，对牛体外胚胎进行冷冻及移植，不同的是，对比例4中胚胎冷冻仅使用商业化冷冻液基础液对胚胎进行冷冻，不额外添加本发明提供的添加剂。且胚胎装管方式为胚胎冷冻液、气泡、胚胎冷冻液、气泡、含有胚胎的冷冻液、气泡、胚胎冷冻液、气泡、胚胎冷冻液的顺序进行五段式装管，其中每段液柱的长度相同，将胚胎装入0.25mL麦管中。
为了验证实施例1、2以及对比例1-4所述方法的效果，对每个实施例中试验胚胎数、24小时存活数(枚)、48小时孵化数(枚)、24小时存活率(％)、48小时孵化率(％)以及胚胎移植后移植头数、怀孕头数、受胎率进行了检测，检测结果见表1和表2。
表1
表2
对比例5-对比例13
为了探究胚胎冷冻液与一步法冷冻液添加剂最佳混合比例，设置对比例5-对比例13，其与实施例1的区别在于：
将步骤(2)制备得到的自制胚胎冷冻液和步骤(1)制备得到的一步法冷冻液添加剂按照表3或表5中的体积比混合均匀。
表3
表4
表5
表6
表中的指标说明：
将本发明一种牛体外胚胎一步法冷冻液添加剂添加到自配胚胎冷冻液及商业化胚胎冷冻液中，并按照本发明所提供的胚胎装管方式对牛体外胚胎进行一步法冷冻，与未添加本发明的自制胚胎冷冻液及商业化胚胎冷冻液按照本发明提供的冷冻方法进行冷冻(即实施例1、对比例1、实施例2和对比例3进行比对)，结果显示：胚胎解冻后24小时存活率、解冻后48小时孵化率及胚胎移植受胎率均有所提升。
将本发明一种牛体外胚胎一步法冷冻液添加剂添加到自配胚胎冷冻液及商业化胚胎冷冻液中，并按照本发明所提供的方法对牛体外胚胎进行一步法冷冻，与未添加本发明的自制胚胎冷冻液及商业化胚胎冷冻液按照常规胚胎装管方式对牛体外胚胎冷冻方法进行冷冻(即实施例1和对比例2进行比对，实施例2和对比例4进行比对)，结果显示：胚胎解冻后24小时存活率、解冻后48小时孵化率及胚胎移植受胎率均有显著提升。
使用不添加本发明的自配胚胎冷冻液及商业化胚胎冷冻液，按照本发明所提供的胚胎装管方式对牛体外胚胎进行一步法冷冻(即对比例1和对比例2进行比对，对比例3和对比例4进行比对)，结果显示：胚胎解冻后24小时存活率、解冻后48小时孵化率及胚胎移植受胎率均有所提升。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂，其特征在于，所述添加剂为包含氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、丙酮酸钠、氯化钙、牛血清白蛋白、蔗糖、乙二醇和透明质酸的水溶液；
所述蔗糖的浓度为4.5～5.0M。
2.如权利要求1所述的添加剂，其特征在于，所述添加剂中各组分浓度为：5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、1～5g/L牛血清白蛋白、4.5～5.0M蔗糖、1.0～2.0M乙二醇、3～8mg/mL透明质酸；
优选的，所述添加剂中各组分浓度为：8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、4.6M蔗糖、1.5M乙二醇、5mg/mL透明质酸。
3.如权利要求1所述的添加剂，其特征在于，所述氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、丙酮酸钠、氯化钙、牛血清白蛋白、蔗糖、乙二醇和透明质酸的纯度均为细胞培养级及以上。
4.一种牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制权利要求1-3任一所述的添加剂；
(2)将所述添加剂与胚胎冷冻液混匀，得到含有添加剂的冷冻液；
(3)将所述含有添加剂的冷冻液与胚胎冷冻液混匀，得到平衡液；
(4)将待冷冻胚胎移入平衡液滴，静置后，将待冷冻胚胎从平衡液滴移入含有添加剂的冷冻液中；
(5)将待冷冻胚胎装入麦管，控制温度进行冷冻。
5.如权利要求4所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，所述胚胎冷冻液为自制胚胎冷冻液或商业化胚胎冷冻液；
优选的，所述自制胚胎冷冻液为包含5～10g/L氯化钠、0.1～0.5g/L氯化钾、0.1～0.3g/L氯化镁、2.5～3.0g/L磷酸氢二钠、0.1～0.5g/L磷酸二氢钾、0.8～1.2g/L葡萄糖、0.03～0.04g/L丙酮酸钠、0.1～0.3g/L氯化钙、1～5g/L牛血清白蛋白、0.1～0.5M蔗糖和1.0～2.0M乙二醇的水溶液；
进一步优选的，所述自制胚胎冷冻液为包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖、1.5M乙二醇的水溶液。
6.如权利要求4所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，按照5～10:1～3的体积比将胚胎冷冻液与一步法冷冻液添加剂混合均匀后形成含有添加剂的冷冻液；所述体积比优选为8：2；
或，按照1～2：1～2的体积比将胚胎保存液和含有添加剂的冷冻液混合均匀后形成平衡液滴；所述体积比优选为1：1。
7.如权利要求4所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，所述将待冷冻胚胎装入麦管为：按照胚胎保存液、气泡、胚胎保存液、气泡、含有胚胎的含有添加剂的冷冻液、气泡、胚胎保存液、气泡、胚胎保存液的顺序进行五段式装管，其中每段液柱的长度相同，将胚胎装入麦管中。
8.如权利要求4所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，所述控制温度进行冷冻具体为：将装有待冷冻胚胎的麦管于-5℃～-10℃下植冰后，优选为-6℃，按照0.5℃/min的降温速度降至-30℃～-40℃，优选为-35℃，然后将装有待冷冻胚胎的麦管投入液氮中。
9.如权利要求4所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，牛体外胚胎解冻后在5分钟内移植到处于发情第7天的受体牛体内。
10.如权利要求9所述的牛体外胚胎一步法冷冻方法，其特征在于，所述解冻为：从液氮中取出冷冻保存的胚胎，空气中暴露10秒，投入30℃的温水中，停留30秒；30秒后，甩动麦管，使麦管内各段液柱混合均匀。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202311346452.0A CN117502427A (zh) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂及牛体外胚胎一步法冷冻方法 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN117502427A true CN117502427A (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=89757479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311346452.0A Pending CN117502427A (zh) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 一种牛体外胚胎一步法中冷冻液的添加剂及牛体外胚胎一步法冷冻方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| CN (1) | CN117502427A (zh) |
-
2023
- 2023-10-17 CN CN202311346452.0A patent/CN117502427A/zh active Pending
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