CN105052894A - 一种gv期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
一种GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法。它涉及一种卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法。本发明解决了现有卵母细胞冷冻保存解冻后存活率及发育率低的问题。卵母细胞冷冻采用cryoloop为载体，以常规培养液为基质，以DMSO和乙二醇为冷冻保护剂，冷冻、解冻过程中添加维生素B12和叶酸。本发明可有效提高解冻后卵母细胞存活率和体外发育率。
Description
技术领域
本发明涉及一种卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法。
背景技术
哺乳动物卵母细胞的冷冻保存指在超低温(-196℃)条件下抑制细胞内一切新陈代谢活动，并使细胞被长期保存，按一定的方式解冻后，又能恢复其受精、卵裂等发育潜能的一种保存技术。卵母细胞冷冻保存能够充分利用各种来源的卵母细胞，可为体外受精、核移植、转基因等胚胎工程技术的研究和应用提供大量的实验材料，且不受时间和空间的限制。
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因而冷冻保存的难度较大，其冷冻效果远远不及胚胎的冷冻水平。卵母细胞体积大，内部水分含量高，内容物丰富，如卵母细胞中含有的大量脂肪粒和囊泡等对低温十分敏感，使得卵母细胞的冷冻保存受到了很大的限制。因此，建立完善的卵母细胞冷冻保存方法尤为重要。目前较为常用的卵母细胞冷冻保存技术方法有慢(快)速冷冻法和玻璃化冷冻法。由于玻璃化冷冻法是一种快速降低细胞温度的冷冻模式，避免了慢速冷冻过程中细胞遭受的机械损伤，同时缩短了冷冻处理时间，简化了步骤，并且不需要昂贵的程序降温仪器，逐渐成为胚胎和卵母细胞冷冻保存的趋势。
卵母细胞成熟过程主要分为以下几个时期，生发泡(Germinalvesicle，GV)期、进入成熟状态的生发泡破裂(Germinalvesiclebreakdown，GVBD)和之后的减数分裂(Meiosis，M)期；减数分裂又分为MⅠ期和MⅡ期，MⅠ进一步细分为中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ。相比之下，以生发泡(Germinalvesicle，GV)期卵母细胞为冷冻对象比成熟卵母细胞更具有优势。
尽管目前采用玻璃化冷冻法冷冻保存GV期卵母细胞已经取得很大的进展，但是冷冻解冻后的卵母细胞受精卵裂率、囊胚发育率仍然不理想。
发明内容
本发明为了解决现有卵母细胞冷冻保存解冻后卵母细胞受精卵裂率、囊胚发育率低的问题，提供一种GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法。
卵母细胞冷冻保存平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)和海藻糖组成；平衡液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为7.5％、二甲基亚砜的体积浓度为7.5％、海藻糖的浓度为0.25M。
卵母细胞冷冻保存液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇和二甲基亚砜组成；冷冻保存液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为15％、二甲基亚砜的体积浓度为15％。
卵母细胞冷冻保存解冻液分有解冻液Ⅰ和解冻液Ⅱ两种；解冻液Ⅰ和解冻液Ⅱ均由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM，解冻液Ⅰ中海藻糖的浓度为1M，解冻液Ⅱ中海藻糖的浓度为0.5M。
卵母细胞按以下步骤进行冷冻保存：
将GV期卵母细胞在平衡液中平衡3分钟，然后转移到冷冻保存液中，再立即转移到冷冻环上，并迅速投入液氮中冷冻；
其中，平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖组成；平衡液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为7.5％、二甲基亚砜的体积浓度为7.5％、海藻糖的浓度为0.25M；
冷冻保存液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇和二甲基亚砜组成；冷冻保存液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为15％、二甲基亚砜的体积浓度为15％；
所述常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
冷冻卵母细胞按以下步骤进行解冻：
将冷冻保存的卵母细胞从液氮中取出立即放到解冻液Ⅰ中3分钟，再转移到解冻液Ⅱ中3分钟，之后转移到基础液中3分钟，即完成冷冻卵母细胞的解冻；
其中，解冻液Ⅰ由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液Ⅰ中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、海藻糖的浓度为1M；解冻液Ⅱ由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液Ⅱ中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、海藻糖的浓度为0.5M。
基础液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12和叶酸组成；基础液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM。
常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
本发明GV期卵母细胞可为哺乳动物或人的GV期卵母细胞。
本发明卵母细胞冷冻保存平衡液、冷冻液和解冻液可有效提高解冻后卵母细胞经体外受精和孤雌激活后的胚胎发育率。采用本发明解冻后经体外成熟后受精，囊胚率提高了7.2％，孤雌激活囊胚率提高了3％。
本发明GV期卵母细胞冷冻保存方法能够降低玻璃化冷冻引起的损伤，提高卵母细胞冷冻保存存活率，提高冷冻保存后卵母细胞发育能力，而且成本低廉，便于广泛推广。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式卵母细胞冷冻保存平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、DMSO和海藻糖组成；平衡液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为7.5％、二甲基亚砜的体积浓度为7.5％、海藻糖的浓度为0.25M；常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
具体实施方式二：本实施方式卵母细胞冷冻保存液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇和DMSO组成；其中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为15％、DMSO的体积浓度为15％；常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
具体实施方式三：本实施方式卵母细胞冷冻保存解冻液分有解冻液Ⅰ和解冻液Ⅱ两种；解冻液Ⅰ和解冻液Ⅱ均由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM，解冻液Ⅰ中海藻糖的浓度为1M，解冻液Ⅱ中海藻糖的浓度为0.5M；其中，常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
具体实施方式四：本实施方式卵母细胞按以下步骤进行冷冻保存：
将GV期卵母细胞在平衡液中平衡3分钟，然后转移到冷冻保存液中，再立即转移到冷冻环上，并迅速投入液氮中冷冻；
其中，平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖组成；平衡液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为7.5％、二甲基亚砜的体积浓度为7.5％、海藻糖的浓度为0.25M；
冷冻保存液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇和二甲基亚砜组成；冷冻保存液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为15％、二甲基亚砜的体积浓度为15％；
所述常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
本实施方式中GV期卵母细胞可为哺乳动物或人的GV期卵母细胞。
具体实施方式五：本实施方式冷冻卵母细胞按以下步骤进行解冻：
将冷冻保存的卵母细胞从液氮中取出立即放到解冻液Ⅰ中3分钟，再转移到解冻液Ⅱ中3分钟，之后转移到基础液中3分钟，即完成冷冻卵母细胞的解冻；
其中，解冻液Ⅰ由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液Ⅰ中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、海藻糖的浓度为1M；解冻液Ⅱ由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液Ⅱ中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、海藻糖的浓度为0.5M；
基础液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12和叶酸组成；基础液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM；
所述常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
本实施方式中解冻过程均在37℃环境中进行。
实施例1
将小鼠GV期卵母细胞在平衡液中平衡3分钟，然后转移到冷冻保存液中，再立即转移到冷冻环并迅速投入液氮中冷冻保存；
将冷冻保存的小鼠卵母细胞从液氮中取出立即放到解冻液Ⅰ中3分钟，再转移到解冻液Ⅱ中3分钟，之后转移到基础液中3分钟，即完成冷冻卵母细胞的解冻；
其中，平衡液由MEM培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖组成；平衡液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为7.5％、二甲基亚砜的体积浓度为7.5％、海藻糖的浓度为0.25M；
冷冻保存液由MEM培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇和二甲基亚砜组成；冷冻保存液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为15％、二甲基亚砜的体积浓度为15％；
解冻液Ⅰ由MEM培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液Ⅰ中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、海藻糖的浓度为1M；解冻液Ⅱ由MEM培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液Ⅱ中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、海藻糖的浓度为0.5M；
基础液由MEM培养液、胎牛血清、维生素B12和叶酸组成；基础液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM。
配制卵母细胞体外成熟液：45ml的TCM199培养液(购自GIBCO公司)中加入5ml胎牛血清和5000IU青霉素及5000μg链霉素，轻微搅拌混匀，再加入2.5IU的FSH、2.5IU的LH、50μg的17β-雌二醇、1.21mg的丙酮酸钠和500ng的EGF，轻轻混匀，静置2～3小时后，用Φ0.22μm的过滤器抽滤消毒后，分装到1.5ml离心管中，4℃下储存，备用。
卵母细胞体外成熟：将解冻的小鼠GV期卵母细胞放入37℃预热2小时的卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于CO2体积浓度为5％的环境内成熟培养14小时或24小时。
体外受精和孤雌激活
孤雌激活：小鼠卵母细胞采用SrCl2激活，卵母细胞先在含10mMSrCl2和CB的无钙CZB中培养2.5h，再在含有CB的含钙CZB中培养3.5h，之后转移至CZB中继续培养，培养48小时至4-细胞胚胎期转移至含糖CZB中培养至囊胚。
体外受精：选取性成熟(10～12周龄)昆明白雄鼠，已通过交配实验证明其有受精能力，颈椎脱臼法处死，从附睾尾和输精管收集精子，将收集的精子团块置入1ml含10mg/mlBSA的T6液滴内，用口吸管轻轻吹打，使精子团分散开，于37℃、5％CO2及饱和湿度的CO2培养箱内中孵育1.5小时左右，进行获能；在此期间用细胞计数板检测精子密度；再将IVM后14小时的卵母细胞在受精液(T6+20mg/mlBSA)中洗3次，移入已经平衡过夜的受精滴(20枚/40μl)中，加入适量体积的获能精子，使精子密度在1×106左右。培养6小时后，用无糖CZB液洗去卵母细胞周围附着精子，选取含两原核和第二极体的受精卵，置于无糖CZB中培养。
体外受精及孤雌激活后的胚胎继续培养7天，培养48小时记录2-细胞胚胎及4-细胞胚胎比率。
实施例2
本实施例与实施例1的不同点在于常规培养基为M16培养液。
实施例3
本实施例与实施例1的不同点在于基础液、平衡液、冷冻液和解冻液中不含维生素B12和叶酸。
实施例1～3解冻后卵母细胞的受精卵裂率、受精囊胚发育率、孤雌激活卵裂率和孤雌激活囊胚发育率如表1所示。
表1
实验结果表明本发明GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法可有效提高解冻后卵母细胞存活率及卵母细胞经体外受精和孤雌激活后的胚胎发育率。
Claims (8)
1.卵母细胞冷冻保存平衡液，其特征在于平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖组成；其中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为7.5％、DMSO的体积浓度为7.5％、海藻糖的浓度为0.25M。
2.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存平衡液，其特征在于常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
3.卵母细胞冷冻保存液，其特征在于冷冻保存液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇和DMSO组成；其中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为15％、DMSO的体积浓度为15％。
4.卵母细胞冷冻保存解冻液，其特征在于解冻液分有解冻液Ⅰ和解冻液Ⅱ两种；解冻液Ⅰ和解冻液Ⅱ均由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM，解冻液Ⅰ中海藻糖的浓度为1M，解冻液Ⅱ中海藻糖的浓度为0.5M。
5.卵母细胞冷冻保存方法，其特征在于卵母细胞按以下步骤进行冷冻保存：
将GV期卵母细胞在平衡液中平衡3分钟，然后转移到冷冻保存液中，再立即转移到冷冻环上，并迅速投入液氮中冷冻；
其中，平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖组成；平衡液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为7.5％、二甲基亚砜的体积浓度为7.5％、海藻糖的浓度为0.25M；
冷冻保存液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇和二甲基亚砜组成；冷冻保存液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为15％、二甲基亚砜的体积浓度为15％；
所述常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
6.冷冻卵母细胞的解冻方法，其特征在于冷冻卵母细胞按以下步骤进行解冻：
将冷冻保存的卵母细胞从液氮中取出立即放到解冻液Ⅰ中3分钟，再转移到解冻液Ⅱ中3分钟，之后转移到基础液中3分钟，即完成冷冻卵母细胞的解冻；其中，解冻液Ⅰ由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液Ⅰ中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、海藻糖的浓度为1M；解冻液Ⅱ由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液Ⅱ中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、海藻糖的浓度为0.5M；所述常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。
7.冷冻卵母细胞的解冻方法，其特征在于解冻过程均在37℃环境中进行。
8.冷冻卵母细胞的解冻方法，其特征在于基础液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12和叶酸组成；基础液中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM。
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| PB01 | Publication | ||
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
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Granted publication date: 20180306 Termination date: 20200826 |