CN101003791A

CN101003791A - 一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法

Info

Publication number: CN101003791A
Application number: CNA2007100131243A
Authority: CN
Inventors: 谭秀文; 黄金明; 游伟; 刘晓牧; 吴乃科
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2007-01-11
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2007-07-25

Abstract

本发明公开了一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法，属胚胎生物技术领域。该方法使用高硼硅毛细玻璃管，具体操作步骤包括：(一)冷冻液体的配置；(二)冷冻；(三)解冻液体的配置；(四)解冻。本发明采用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法与现有技术相比，具有不需昂贵仪器，成本花费低；操作简单方便，可以在生产现场操作；冷冻保存效果好，解冻后成活率高的特点。

Description

一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种保存胚胎和卵母细胞的方法，具体地说是一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法。

背景技术

玻璃化冷冻技术作为一种新发展起来的生物技术，具有许多潜在的应用价值。应用此项技术进行胚胎和卵母细胞的冷冻保存，可以将优良品种动物的早期胚胎和废弃卵巢中的大量卵母细胞保存起来，建立“胚胎库”和“卵子库”，为胚胎移植、体外受精、核移植、转基因等各种胚胎生物技术的开展提供充足的材料，并解除了时间和空间上的限制；而且可以为珍稀动物、濒危动物的遗传资源的保存提供可能。因此，在发育生殖研究领域有着广阔的应用前景。

玻璃化是指溶液在极低的温度(-196℃)下变为不含任何内部冰晶的固态。胚胎玻璃化冷冻程序首先由Rall和Fahy(Rall and Fahy，1985年)提出，他们证明小鼠胚胎可以悬浮于高浓度的CPAs溶液中通过快速投入液氮进行降温。玻璃化后的小鼠胚胎解冻后能发育成正常的后代(Rall et al.，1987年)。后来，牛(Martinez et al.，1998年；Agca et al.，1998年)、猪(Kobayashi et al.，1998年)、山羊(El-Gayar et al.，2001年)、马(Maclellan et al.，2002年)、大鼠(Jiang et al.，1998年)、绵羊(Baril et al.，2001年)和兔(Vicente et al.，1999年)，以及人(Yokota et al.，2001年；Mukaida etal.，2001年)的胚胎都使用过玻璃化冷冻保存，且都有后代出生。说明玻璃化冷冻保存胚胎还是切实可行的。另外，许多报道都指出玻璃化而非传统的慢速冷冻可能是冷冻保存哺乳动物卵母细胞的更有效的方法(Rall et al.，1987年)。玻璃化被用于冷冻保存小鼠(Chen et al.，2000年；Lane and Gardner，2001年；Nakagata，1989年)、大鼠(Nakagata，1992年)、山羊(Begin et al，2003年)、马(Maclellan et al.，2002年)、人(Kuleshova et al.，1999年；Liebermannand Tucker，2002年；Yoon et al.，2000年)，尤其是牛(Dinnyes et al.，2000年；Le Gal and Massip；1999年；Le Galet al.，2000年；Martino et al.，1996年；Matsumoto et al.，2001年；Mavrides and Morroll，2002年；Otoi et al.，1998年；Papis et al.，2000年；Vajta et al 1998年；Vieira et al.，2002年)的卵母细胞。

但目前玻璃化冷冻法存在的问题是高浓度玻璃化冷冻液不可避免地会对胚胎和卵母细胞造成化学毒性损伤和渗透压损伤。因此，科学工作者不断改进冷冻方法，通过加快冷冻-解冻速度，缩短胚胎和卵母细胞与玻璃化溶液的接触时间，以降低其化学毒性和渗透压损伤。这些方法主要包括如下四种：

(1)用降温速率很高的电子显微镜铜网作为玻璃化的工具冷冻胚胎和卵母细胞(电子显微镜铜网法)：Martino等(1996年)用降温速率很高的电子显微镜铜网作为玻璃化的工具冷冻牛卵母细胞，发现解冻后成活率和体外受精后卵裂率和囊胚发育率显著高于传统的细管冷冻法。但是，电子显微镜贵重，购买仪器花费较大，不是普通实验室或生产中可以接受的。

(2)将胚胎和卵母细胞置于小直径的开放拉长细管(OPS法)中：Vajta等(1998年)用OPS法冷冻牛卵母细胞获得了比传统细管法更高的妊娠率。用这种方法冷冻的卵母细胞体外受精并移植后出生了牛犊。朱士恩等(2002年)采用OPS法冷冻保存小鼠原核胚，卵裂率和囊胚发育率都非常高。但由于OPS管都是用0.25毫升塑料管手工拉制，所以管径大小不是很一致，造成冷冻效果的可重复性较差。

(3)将含有胚胎和卵母细胞的1-2微升的液滴直接滴到-150℃的固体表面上(颗粒法)：Dinnyes等(2000年)曾将含有卵母细胞的极小的玻璃化液滴滴到预冷的金属表面上，然后收集冷冻的小颗粒进行保存。但在生产中发现，小颗粒很容易丢失。

(4)滴于小尼龙环上冷冻液形成的薄膜上(薄膜法)：Lane等(1999年)首次提出了冷冻环法，用来作为胚胎冷冻的的工具。冷冻环是一个小的尼龙环，在其上形成冷冻保护液的薄膜，可将卵或胚胎置于此膜上，然后将环直接浸入液氮中。冷冻环法被成功地用于小鼠(Lane andGardner，2000年)、仓鼠(Laneet al.，1999年)、牛(Le Gal et al.，2000年)、人(Kuleshova etal，1999年)以及最近马(Maclellan et al.，2002年)胚胎和卵母细胞的冷冻保存。但此法存在的问题是操作难度较大。

发明内容

本发明的技术任务是提供一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法。

本发明的具体操作步骤如下：

(一)、冷冻液体的配置：

基础液：在100份组织和细胞培养液(TCM-199液)中添加20份-30份胎牛血清(V/V)和0.5份-1.5份庆大霉素溶液(V/V)；

玻璃化冷冻液I：在100份基础液中添加10份-15份乙二醇(V/V)和10份-15份二甲基亚砜(V/V)；

玻璃化冷冻液II：在100份基础液中添加30份-35份乙二醇(V/V)和30份-35份二甲基亚砜(V/V)；

(二)、冷冻：

使用四孔板，在四孔板的前三个孔中分别放置0.8毫升基础液、玻璃化冷冻液I和玻璃化冷冻液II；将待冷冻的卵母细胞或胚胎先放在基础液中；用移液器将2-4枚胚胎或卵母细胞转入玻璃化冷冻液I中平衡1-2分钟；然后将胚胎或卵母细胞转移到玻璃化冷冻液II中；之后用枪头吸入这几枚胚胎或卵母细胞连同4-6微升的玻璃化冷冻液II转移到空白孔处；毛细玻璃管利用虹吸作用将含卵母细胞或胚胎的液滴吸入毛细玻璃管的一端，以上操作在20-25秒内完成，然后无需封口，投入液氮，即可快速冷冻；

(三)、解冻液体的配置：

解冻液I：在100份基础液中添加0.25-0.35份蔗糖溶液；

解冻液II：在100份基础液中添加0.1-0.2份蔗糖溶液；

(四)、解冻：

在四孔板的前两个孔中分别放置0.8毫升解冻液I和0.8毫升解冻液II，后两个孔中分别放置0.8毫升的基础液；从液氮中取出毛细玻璃管，在空气中停留3-4秒；之后将毛细玻璃管有卵母细胞或胚胎的一端插入解冻液I中，用食指堵住另一端，利用手指的温度驱使卵母细胞或胚胎进入到解冻液I中，停留3-5分钟；然后用移液器将卵母细胞或胚胎转移到解冻液II中，停留3-5分钟；之后将卵母细胞或胚胎转移到基础液中，停留3-5分钟；最后将卵母细胞或胚胎转移到另一基础液中，进行质量评定；以上操作均在体视显微镜35℃-37℃的加热板上进行。

所述的庆大霉素为粉末用0.9％的生理盐水配成10％的溶液；所述的毛细玻璃管为内径为0.8毫米、长为10厘米的高硼硅玻璃管；所述的毛细玻璃管装卵母细胞或胚胎的一端设置有标记线，另一端设置有手拿标记线。

本发明采用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法与现有技术相比，具有以下特点：

(1)、不需昂贵仪器，成本花费低；

(2)、操作简单，快速方便，可以在生产现场操作；

(3)、冷冻保存效果好，解冻后成活率高。

附图说明

附图为所述的毛细玻璃管的结构示意图；

图中：1、手拿标记线，2、毛细玻璃管，3、标记线。

具体实施方式

实施例1：

(一)、冷冻液体的配置：

基础液：在10ml组织和细胞培养液(TCM-199液)中添加2.5ml胎牛血清(V/V)和0.1ml庆大霉素溶液(V/V)；

玻璃化冷冻液I：在10ml基础液中添加1.2ml乙二醇(V/V)和1.3ml二甲基亚砜(V/V)；

玻璃化冷冻液II：在10ml基础液中添加3.2ml乙二醇(V/V)和3.4ml二甲基亚砜(V/V)；

(二)、冷冻：

使用四孔板，在四孔板的前三个孔中分别放置0.8毫升基础液、玻璃化冷冻液I和玻璃化冷冻液II；将待冷冻的牛成熟卵母细胞先放在基础液中；用移液器将3枚牛成熟卵母细胞放入玻璃化冷冻液I中平衡1.5分钟；然后将牛成熟卵母细胞转移到玻璃化冷冻液II中，之后用枪头吸入这几枚牛成熟卵母细胞连同5微升的玻璃化冷冻液II转移到空白孔处；毛细玻璃管设有标记线的一端利用虹吸作用将含牛成熟卵母细胞的液滴吸入毛细玻璃管的一端，以上操作在25秒内完成，然后无需封口，将设有标记线的一端投入液氮，即可快速冷冻；

(三)、解冻液体的配置：

解冻液I：在10ml基础液中添加0.03ml蔗糖溶液；

解冻液II：在10ml基础液中添加0.015ml蔗糖溶液；

(四)、解冻：

在四孔板的前两个孔中分别放置0.8毫升解冻液I和0.8毫升解冻液II，后两个孔中分别放置0.8毫升的基础液；从液氮中取出毛细玻璃管，在空气中停留4秒；之后将毛细玻璃管有牛成熟卵母细胞的一端插入解冻液I中，用食指堵住另一端，利用手指的温度驱使牛成熟卵母细胞进入到解冻液I中，停留5分钟；然后用移液器将牛成熟卵母细胞转移到解冻液II中，停留3分钟；重复上面的操作将牛成熟卵母细胞转移到基础液中，停留3分钟；最后将牛成熟卵母细胞转移到另一基础液中，进行质量评定；以上操作均在体视显微镜37℃的加热板上进行。

重复以上操作共装34管毛细玻璃管，冷冻牛成熟卵母细胞100枚，解冻后成活率达89.3％。

实施例2：

(一)、冷冻液体的配置：

基础液：在10ml组织和细胞培养液(TCM-199液)中添加2ml胎牛血清(V/V)和0.15ml庆大霉素溶液(V/V)；

玻璃化冷冻液I：在10ml基础液中添加1.5ml乙二醇(V/V)和1.2ml二甲基亚砜(V/V)；

玻璃化冷冻液II：在10ml基础液中添加3.5ml乙二醇(V/V)和3ml二甲基亚砜(V/V)；

(二)、冷冻：

使用四孔板，在四孔板的前三个孔中分别放置0.8毫升基础液、玻璃化冷冻液I和玻璃化冷冻液II；将待冷冻的牛胚胎先放在基础液中；用移液器将2枚牛胚胎放入玻璃化冷冻液I中平衡1.5分钟；然后将牛胚胎转移到玻璃化冷冻液II中；之后用枪头吸入这几枚牛胚胎连同6微升的玻璃化冷冻液II转移到空白孔处；毛细玻璃管利用虹吸作用将含牛胚胎的液滴吸入毛细玻璃管的一端，以上操作在25秒内完成，然后无需封口，投入液氮，即可快速冷冻；

(三)、解冻液体的配置：

解冻液I：在10ml基础液中添加0.035ml蔗糖溶液；

解冻液II：在10ml基础液中添加0.02ml蔗糖溶液；

(四)、解冻：

在四孔板的前两个孔中分别放置0.8毫升解冻液I和0.8毫升解冻液II，后两个孔中分别放置0.8毫升的基础液；从液氮中取出毛细玻璃管，在空气中停留4秒；之后将毛细玻璃管有牛胚胎的一端插入解冻液I中，用食指堵住另一端，利用手指的温度驱使牛胚胎进入到解冻液I中，停留4分钟；然后用移液器将牛胚胎转移到解冻液II中，停留2分钟；重复上面的操作将牛胚胎转移到基础液中，停留4分钟；最后将牛胚胎转移到另一基础液中，进行质量评定；以上操作均在体视显微镜36℃的加热板上进行。

重复以上操作共装2500管，冷冻牛胚胎5000枚，解冻后成活率达93.9％。

Claims

1、一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法，其特征在于该方法的具体操作步骤如下：

(一)、冷冻液体的配置：

(二)、冷冻：

(三)、解冻液体的配置：

解冻液I：在100份基础液中添加0.25-0.35份蔗糖溶液；

解冻液II：在100份基础液中添加0.1-0.2份蔗糖溶液；

(四)、解冻：

2、根据权利要求1所述的一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法，其特征在于所述的庆大霉素为粉末用0.9％的生理盐水配成10％的溶液。

3、根据权利要求1所述的一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法，其特征在于所述的毛细玻璃管为内径为0.8毫米、长为10厘米的高硼硅玻璃管。

4、根据权利要求1所述的一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法，其特征在于所述的毛细玻璃管装卵母细胞或胚胎的一端设置有标记线，另一端设置有手拿标记线。