CN109699636A - 一种胚胎的玻璃化冷冻和解冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胚胎的玻璃化冷冻和解冻方法，属胚胎生物技术领域。技术方案包括：将冷冻液和解冻液分段装入细管，每段液体用空气隔开，其中一段冷冻液中置入了胚胎，后封口细管、投入液氮，特征是，装入细管内的冷冻液和解冻液各有两段，冷冻液与解冻液的体积比小于或等于1∶5，或混合后混合液中抗冻保护剂的浓度在2.0Mol/L以内。本发明的简易解冻和移植法为，在室温下，将冷冻保存胚胎的细管由液氮中取出，空气浴4~6s，20~25℃水浴，取出细管，来回颠倒甩动细管，使冷冻液混合均匀，即移植胚胎。本发明极大地简化了胚胎玻璃化冷冻后的解冻程序，实现了胚胎在管内脱毒、直接移植，简易方便，可操作性强，利于推广应用。

Description

一种胚胎的玻璃化冷冻和解冻方法

技术领域

本发明涉及一种玻璃化胚胎冷冻、解冻和直接移植方法，特别是用于哺乳动物的胚胎冷冻、解冻和移植方法，属胚胎生物技术领域

背景技术

1972年Whittingham首次采用二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide： DMSO)为主体抗冻保护剂冷冻保存小鼠的2～8-细胞胚胎获得成功， 并移植产下后代。他们所采用的冷冻液浓度为1.5Mol/L，使用程序 化降温冷冻仪。冷冻解冻后胚胎成活率为50％～70％，胚胎妊娠率为 65％，产仔率48％。程序化冷冻方法自发明以来，经各国研究者反复 试验，并对各种冷冻保护剂进行筛选，使胚胎冷冻解冻后存活率达到 90％以上，而冷冻程序基本不变，即：-6℃植冰后，以-0.33℃/min 的速率降至-30～-35℃，平衡后，再以-1.0℃/min的速度降至-80℃ 后投入液氮，整个过程约3个小时完成，到目前为止该方法仍被使用， 称之为常规冷冻法。

常规冷冻的程序复杂、耗时长、效率低，更不适于边远牧区的胚 胎冷冻保存和移植。为此，1985年Rall等发明胚胎玻璃化冷冻方法， 使冷冻勿需借助冷冻仪，可在室温下进行操作。程序得到极大地简化。 后经许多研究者的改进，目前胚胎的玻璃化冷冻方法仅需1分钟左 右即可完成一个程序。胚胎冷冻解冻后存活率95％以上，移植妊娠率 达60％～70％，产仔率平均为56％。产仔率比传统的程序化冷冻方法 提高了8％。

但是，由于玻璃化冷冻液浓度非常高(6Mol/L以上)，胚胎在玻 璃化冷冻液中的平衡时间一般不宜超过2分钟，即投入液氮中冷冻保 存。因此，对于玻璃化冷冻保存的胚胎，移植前必须将胚胎由冷冻细 管中推出，置于一定浓度(0.3～1.0Mol/L)的蔗糖溶液中5分钟左 右，以脱除抗冻保护剂，并在显微镜下回收胚胎，将胚胎重新装管后 再行移植。解冻过程不仅十分烦琐，且容易丢失胚胎，需要有操作熟 练的技术人员。这些条件都制约了玻璃化冷冻方法在生产中的推广应 用。

发明内容

本发明的目的是要提供一种胚胎的玻璃化冷冻、简易解冻和直接 移植法，以简化胚胎玻璃化冷冻方法的解冻步骤，为使玻璃化冷冻的 胚胎移植易于生产中推广应用。

为了达到本发明的目的所采取的技术方案包括以下胚胎的玻璃 化冷冻法：将冷冻液和解冻液分段装入细管内，每段液体之间都用一 段空气隔开，其中在一段冷冻液中置入了经过预处理液处理过的胚 胎，然后将细管封口、投入液氮，其特征在于，装入细管内的冷冻液 和解冻液各有两段，其装管顺序为：首先装入一段解冻液(6)，然后 装入一段空气(3)，接着装入一段冷冻液(5)，再装入一段空气(3)， 然后再装入一段冷冻液(4)，并在该段冷冻液中置入胚胎，接着再装 入一段空气(3)，最后在管端装入一段解冻液(2)并封闭管口；装 入细管内的冷冻液与解冻液地体积比值小于或等于1∶5。

上述的胚胎的玻璃化冷冻方法中，所述的冷冻液为EFS30，解冻 液为0.3～1Mol/L蔗糖溶液。

上述的胚胎的玻璃化冷冻法中，所述的装入细管中的第二段解冻 液(2)的长度为0.4～1.5cm，以0.5cm左右为宜。

上述的胚胎的玻璃化冷冻法中，装管时，按顺序吸入7.5cm长的 解冻液-1cm长的空气-0.4cm长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.6cm 长的冷冻液-1cm长的空气，将胚胎移入0.6cm长的冷冻液节段后， 吸入0.5cm长的解冻液后封口，投入液氮冷冻。

上述的胚胎的玻璃化冷冻法中，装管时，按顺序吸入6cm长的 解冻液-1cm长的空气-0.4cm长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.8cm 长的冷冻液-1cm长的空气，将胚胎移入0.8cm长的冷冻液节段后， 吸入1.8cm长的解冻液后封口，投入液氮冷冻。

上述的胚胎的玻璃化冷冻法中，所述的装管时，按顺序吸入8.2cm 长的解冻液-0.5cm长的空气-0.3cm长的冷冻液-0.5cm长的空气 -0.5cm长的冷冻液-1cm长的空气，将胚胎移入0.5cm长的冷冻液 节段后，吸入少许解冻液后封口，投入液氮冷冻。

经过上述的胚胎的玻璃化冷冻法冷冻的胚胎的简易解冻和移植 法为，在室温下，将冷冻保存胚胎的细管由液氮中取出后，空气浴4～ 6s，然后浸入20～25℃水浴中，待内容物融解后，取出细管，来回颠 倒甩动细管，使细管内的液体混合均匀后，即实施胚胎移植。

上述的胚胎的简易解冻和移植法中，所述的室温以20～25℃为 佳。

由于本发明采用了独特的装管方法，尽量减少了细管内冷冻液节 段的长度，增加了解冻液节段的长度，解冻时，待内容物溶解后，使 管内的冷冻液和解冻液充分混合，达到稀释冷冻液，脱除抗冻保护剂 的效果，所以本发明有如下优点：

(1)最大限度地简化了胚胎玻璃化冷冻保存方法的解冻程序。 本发明采用细管法玻璃化冷冻保存胚胎，解冻时胚胎不需出管脱毒， 而是直接在管内使冷冻液和解冻液相混合，以达到稀释冷冻液，同时 在管内脱除胚胎内部具有化学毒性作用的抗冻保护剂，所以本解冻方 法比传统的解冻方法简单、胚胎不丢失。利用该方法解冻后，胚胎在 管内3～12min，都能保证其存活率在95％左右，培养后囊胚孵化率达 70％以上，不仅时间上能完全保证完成一个移植过程，而且总体水平 比常规冷冻法和其他玻璃化冷冻法效果好、效率高。

(2)解决了冷冻前管内冷冻液和解冻液的合理配置和解冻后管 内直接混合，使胚胎脱除抗冻保护剂后即可移植。该方法实现了玻璃 化冷冻胚胎在管内脱毒、直接移植，简易方便，可操作性强，有利于 在生产中推广。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的装管方法模式图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

在如图1所示的装管方法中，1为棉栓及封口；2为封口液(其 成分与6同)；3为空气段；4为含胚胎的冷冻液；5为冷冻液；6为 解冻液。

本发明的玻璃化胚胎冷冻方法的发明点在于冷冻液和解冻液在 细管内的配置与其他方法不同。由图1可以看出，本装管布置与现有 玻璃化胚胎冷冻技术的“5段法”相比，减少了空气节数，也缩短了 冷冻液节段的长度，这样可以保证用较多的解冻液来稀释高浓度的冷 冻液，完成脱除胚胎内部抗冻保护剂的过程。由于冷冻液节段很短， 如果装入胚胎后，在冷冻液移行的过程中，胚胎容易丢失。因此，本 发明设计上使含有胚胎的冷冻液段4基本处于细管的后端，尽量减少 冷冻液的移行，防止胚胎丢失进入解冻液中，造成胚胎冷冻后由于结 晶而死亡。另外，如图所示，布置冷冻液节段“5”的作用是避免在 装管时解冻液进入含胚胎的冷冻液节段4，改变该冷冻液浓度；而节 段“2”的主要作用是封口时浸润封口粉，使其膨胀，防止封口不严 密。

在如图所示的实施例的装管操作中：

首先在细管的棉栓端吸入约7.5cm长的解冻液(0.3～1Mol/L蔗 糖溶液)，然后吸入约0.4cm和约0.6cm(导入胚胎)两段冷冻液， 各液体间由空气隔开，基本布满了整个细管，最后封口的解冻液为 0.5cm，使液体向前移动时，胚胎脱落、丢失的机会减少。

采用上玻璃化冷冻方法冷冻的胚胎，可以实现细管内解冻和直接 移植：

解冻时，胚胎无需出管脱毒，而是将管内冷冻液和解冻液段经甩 动充分混合，以脱除胚胎内部抗冻保护剂，即可实施移植。方法简单， 可操作性强，生产中易于推广。

以下是本发明的几个实施例的实际操作方法：

(1)准备EFS30玻璃化冷冻保存溶液、冷冻预处理液及解冻液：

①EFS30：以乙二醇(Ethylene glycol：EG)为主体抗冻保护剂，加 入聚蔗糖(Ficoll)和蔗糖(Sucrose)制成的玻璃化溶液。②10％ 的乙二醇(Ethylene glycol：EG)：按体积比(v/v)配制10％的EG作 为预处理液。③0.5Mol/L的蔗糖(Sucrose)溶液：以杜氏磷酸缓 冲液(PBS)为基础液配制成0.5Mol/L的蔗糖溶液，作为管内解冻液。

(2)胚胎的装管及冷冻：装管时，用0.25ml的塑料细管按图1 所示顺序吸入解冻液和冷冻液，然后平行地置于操作台上，待经冷冻 预处理液处理过的胚胎移入后，再吸入蔗糖溶液后封口，然后将细管 直接投入液氮中冷冻保存。该装管方法各节段长度为参考值，在实际 操作中，由于各操作人员手法不一，可能会稍有变动，这并不影响胚 胎的存活率和发育率，但必须保证的是，冷冻液与解冻液长度(或体 积)的比值小于或等于1∶5，这样混合后混合液中抗冻保护剂的浓度 在2.0Mol/L以内，对胚胎毒性小。例如：

①装管时，按顺序吸入0.5Mol/L的蔗糖溶液(约7.5cm)-空 气(约1cm)-冷冻液(约0.4cm)-空气(约0.5cm)-冷冻液 (约0.6cm)-空气(约1cm)，将胚胎移入0.6cm长的冷冻液节段 后，再吸入0.5cm的蔗糖溶液后封口，然后直接投入液氮中冷冻保存。

②装管时，吸入0.5Mol/L的蔗糖溶液(约6cm)-空气(约1cm) -冷冻液(约0.4cm)-空气(约0.5cm)-冷冻液(约0.8cm) -空气(约1cm)，将胚胎移入0.8cm长的冷冻液节段后，吸入约1.8cm 的蔗糖溶液后封口，投入液氮冷冻保存。

③装管时，吸入0.5Mol/L的蔗糖溶液(约8.2cm)-空气(约 0.5cm)-冷冻液(约0.3cm)-空气(约0.5cm)-冷冻液(约 0.5cm)-空气(约1cm)，将胚胎移入0.5cm长的冷冻液节段后， 吸入少许蔗糖后封口，投入液氮冷冻保存。

以上三种装管形式，在各节段长度上各有差异，但解冻后胚胎存 活率及培养发育率均不受影响，这就允许在冷冻时操作上的视觉误 差，保证了冷冻时的可操作性。但是，如果冷冻液与解冻液的比值大 于1∶5时，混合后冷冻液中的抗冻保护剂的浓度依然较高，对胚胎有 较大影响，尽管解冻后胚胎存活率不受影响，但胚胎的发育率较低。

(3)解冻：室温下(20～25℃效果更佳)，将冷冻保存胚胎的细 管由液氮中取出后，空气浴4～6s后，浸入20～25℃水浴中，待内 容物融解后，取出细管，拭干表面水珠，然后来回颠倒甩动细管3～ 4次，使管内的冷冻液与解冻液混合均匀后，即可施行胚胎移植。自 胚胎解冻后到移植完毕在5～10分钟完成为宜。

用上述方法对小鼠的桑椹胚进行玻璃化冷冻保存，解冻后混合冷 冻液与解冻液，胚胎处于管内的混合液环境中5min，出管检查，胚 胎存活率达95.8％(91/95)，培养孵化率达70.5％(67/95)，移植妊 娠率100％(11/11)，产仔率58.71％(91/155)。证明这种冷冻解冻方 法是简便可行的。

在装管过程中，解冻液2要求尽量短，0.5cm左右，能满足封口 要求即可。这样在装管过程中含有胚胎的冷冻液节段在管内移行的距 离较短，避免了胚胎的丢失。

在实际操作，上述实施例中的冷冻液(EFS30)和解冻液浓度 (0.3-1.0Mol/L)可以换成其他的冷冻液(如：EFS40等)或其他的 解冻液浓度(如：0.8Mol/L的蔗糖，甚至其他糖，如：岩藻糖)，不 影响本发明的实现。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而 非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普 通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替 换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的 权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种胚胎的玻璃化冷冻法，是将冷冻液和解冻液分段装入细管 内，每段液体之间都用一段空气隔开，其中在一段冷冻液中置 入了经过预处理液处理过的胚胎，然后将细管封口、投入液氮， 其特征在于，装入细管内的冷冻液和解冻液各有两段，其装管 顺序为：首先装入一段解冻液(6)，然后装入一段空气(3)， 接着装入一段冷冻液(5)，再装入一段空气(3)，然后再装入 一段冷冻液(4)，并在该段冷冻液中置入胚胎，接着再装入一 段空气(3)，最后在管端装入一段解冻液(2)并封闭管口；装 入细管内的冷冻液与解冻液的体积比值小于或等于1∶5，或混 合后混合液中抗冻保护剂的浓度在2.0Mol/L以内。

2.根据权利要求1所述的胚胎的玻璃化冷冻法，其特征在于，装 入细管中的第二段解冻液(2)的长度为0.4～1.5cm。

3.根据权利要求1或2所述的胚胎的玻璃化冷冻法，其特征在于， 装管时，按顺序吸入7.5cm长的解冻液-1cm长的空气-0.4cm 长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.6cm长的冷冻液-1cm长的空 气，将胚胎移入0.6cm长的冷冻液节段后，吸入0.5cm长的解 冻液后封口，投入液氮冷冻。

4.根据权利要求1所述的胚胎的玻璃化冷冻法，其特征在于，装 管时，按顺序吸入6cm长的解冻液-1cm长的空气-0.4cm长 的冷冻液-0.5cm长的空气-0.8cm长的冷冻液-1cm长的空 气，将胚胎移入0.8cm长的冷冻液节段后，吸入1.8cm长的解 冻液后封口，投入液氮冷冻。

5.根据权利要求1或2所述的胚胎的玻璃化冷冻法，其特征在于， 装管时，按顺序吸入8.2cm长的解冻液-0.5cm长的空气- 0.3cm长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.5cm长的冷冻液-1cm 长的空气，将胚胎移入0.5cm长的冷冻液节段后，吸入少许解 冻液后封口，投入液氮冷冻。

6.一种采用权利要求1所述的胚胎的玻璃化冷冻法冷冻的胚胎的简易解冻法，其特征在于，在室温下，将冷冻保存胚胎的细管 由液氮中取出后，空气浴4～6s，然后浸入20～25℃水浴中， 待内容物融解后，取出细管，来回颠倒甩动细管，使细管内的 液体混合均匀后，用于胚胎移植。

7.根据权利要求6所述的胚胎的简易解冻法，其特征在于，所述 的室温为20～25℃。