CN101215548A - 人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液，属于生物学中的细胞保存领域。以含有HEPES及人血蛋白的人输卵管液为基础液，以低浓度的Ficoll 70、蔗糖、乙二醇和二甲亚砜为保护剂。与现有技术相比，本发明的人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液具有毒性低、保藏效果好等特点，可广泛应用于人类卵母细胞的玻璃化保藏之中。

Description

人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液
技术领域
本发明涉及生物学中的细胞保存领域，具体地说是一种人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液。
背景技术
玻璃化冷冻技术是生物学领域中针对各种卵细胞及胚胎的保藏技术。人卵母细胞的玻璃化冷冻保存是建立人类卵子库，为广大不孕患者解决生育力保存的重要技术手段。现有技术中应用于人卵细胞的玻璃化冷冻液和融解液虽然有许多种，但是还没有一种获得大家的公认，可以得到稳定的很好的复苏效果。如，在冷冻液中常用到1.2-丙二醇(PROH)和乙烯乙二醇(EG)为保护剂，而其浓度高达15％。这类冷冻液主要存在以下不足：一、高浓度导致了较高的毒性，对卵母细胞冷冻复苏后应用于人类生殖目的的安全性造成了威胁；二、卵母细胞冷冻复苏后获得的胚胎的质量下降，不能获得令人满意的临床妊娠率。
发明内容
本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种毒性低、保藏效果好的人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液。
本发明的技术任务是按以下方式实现的：人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液，其特点是，
基础液：在含有HEPES的人输卵管液(mHTF)中添加10％人血蛋白；
冷冻液一：基础液中添加10％Ficoll 70和6.5mol/L蔗糖；
冷冻液二：基础液中添加10％Ficoll 70、6.5mol/L蔗糖、10％乙二醇和7.5mol/L二甲亚砜；
融解液一：基础液中添加1.0mol/L蔗糖；
融解液二：基础液中添加0.6mol/L蔗糖；
融解液三：基础液中添加0.3mol/L蔗糖；
融解液四：基础液中添加0.15mol/L蔗糖。
本发明的人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液与现有技术相比具有以下突出的有益效果：
(1)通过添加Ficoll 70，降低了乙二醇和二甲亚砜的浓度，也就是大大减少了冷冻液的毒性；
(2)能够保证冷冻复苏效果，即获得良好的复苏成活率，获得具有良好发育潜能的胚胎，更适用于建立人卵子库，并将复苏后卵母细胞应用于患者妊娠之用；
(3)融解液采取低浓度、多次替换，可以逐渐将高浓度的冷冻保护剂逐级替换出来，避免卵母细胞在较大浓度梯度的液体转换中，细胞质水份的过度变化造成细胞的死亡，从而提高复苏后细胞的成活率和发育潜能。
具体实施方式
参照以下具体实施例对本发明的人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液作详细地说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例：
(一)冷冻液和融解液的配制：
基础液：
在100ml含有HEPES的人输卵管液中添加10ml人血蛋白；
冷冻液一：
在9ml基础液中添加1ml Ficoll 70和0.065mol蔗糖
冷冻液二：
在8ml基础液中添加1ml Ficoll 70、0.065mol蔗糖、1ml乙二醇和0.075mol二甲亚砜；
融解液一：在10ml基础液中添加0.01mol蔗糖；
融解液二：在10ml基础液中添加0.006mol蔗糖；
融解液三：在10ml基础液中添加0.003mol蔗糖；
融解液四：在10ml基础液中添加0.0015mol蔗糖。
(二)冷冻液和融解液的使用方法
冷冻时，将待冷冻保存的卵母细胞首先放入基础液中平衡5min，再入冷冻液一3min；再入冷冻液二，马上用Cryoloop(市售的用于玻璃化冷冻的承载器具，开放式)沾取体积不超过1uL的冷冻液二，在Cryoloop的环上形成一个薄膜，后将卵母细胞点在薄膜上，时间约20～30s，卵母细胞不超过3个，随后投入液氮中保存。
融解时，将Cryoloop拿出液氮后，直接将其放入融解液一，其上所带的卵母细胞马上会沉入融解液中，再逐次转入融解液二、三、四，时间各30～60S。最后转入普通卵母细胞培养液备用进行体外受精。融解过程完成。
发明人利用上述冷冻液及融解液将197个人卵母细胞玻璃化冷冻保藏1～6个月后融解，共存活169个(85.8％)，受精122个(72.2％)，卵裂72个(59.0％)，获得优质胚胎41个(33.6％)，移植6例，其中4例为自身卵母细胞移植，2例为卵巢早衰患者接受供卵移植。平均移植胚胎数2.5±0.6个，共获得临床妊娠2例(33.3％)。各项指标均令人满意，证明本发明的冷冻液和融解液具有良好的冷冻复苏效果。

Claims (1)

1.人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液，其特征在于，
基础液：在含有HEPES的人输卵管液中添加10％人血蛋白；
冷冻液一：基础液中添加10％Ficoll 70和6.5mol/L蔗糖；
冷冻液二：基础液中添加10％Ficoll 70、6.5mol/L蔗糖、10％乙二醇和7.5mol/L二甲亚砜；
融解液一：基础液中添加1.0mol/L蔗糖；
融解液二：基础液中添加0.6mol/L蔗糖；
融解液三：基础液中添加0.3mol/L蔗糖；
融解液四：基础液中添加0.15mol/L蔗糖。
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