CN104745528B - 一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法及其使用的复苏液 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法及其使用的复苏液，所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法包括卵母细胞或胚胎快速冷冻过程和复苏过程，所述复苏过程包括：复苏前，先将复苏液和培养装置预热，将预热好的1号复苏液注入到培养装置中，并放在显微镜下；取出载体管，将卵母细胞或胚胎排出到1号复苏液中；将卵母细胞或胚胎在1号复苏液中均衡，在复苏基础液中均衡两次；将卵母细胞或胚胎进行洗脱，然后转移到新鲜的培养基中；所述1号复苏液的蔗糖浓度大于所述2号复苏液的蔗糖浓度。本发明的技术方案能够更好地保护卵母细胞或胚胎，有效地提高卵母细胞或胚胎经过快速玻璃化冷冻后的复苏存活率。

Description

一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法及其使用的复苏液

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细胞冷冻保存的方法，尤其涉及一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法及其使用的复苏液。

背景技术

对于卵母细胞或胚胎，目前主要是采用程序化冷冻的方法进行冷冻保存，但是这种方法在冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，并伴随造成生物性损伤，比如慢速冷冻过程中形成冰晶、冷冻保护剂对细胞的毒性以及渗透压压力等都会卵母细胞或胚胎造成伤害，采用这种方法即使卵母细胞或胚胎成功复苏但是其全能性也会受损害。

近几年随着科学技术的发展，玻璃化快速冷冻因为在快速降温冷冻过程中不形成冰晶而受到大家的关注。玻璃化是指液体转变为非晶态(玻璃态)的固化过程，玻璃态固体分子之间的关系和液态无明显区别，在降温冷冻过程中不形成冰晶，细胞结构不会受到破坏从而细胞得以存活，是一种理想的冷冻保存途径。所述玻璃化快速冷冻方法业内通常简称为快速冷冻。

目前玻璃化快速冷冻和复苏的方法主要是围绕小鼠或牛羊等胚胎进行的研究，而对于一些数量少而且敏感的细胞，如卵母细胞或胚胎，研究较少；而且现有的公开文献中报道的存活率都不高。实际上，存活率的高低会直接影响到细胞保存的价值。

对于这种玻璃化快速冷冻和复苏方法，细胞存活率的高低除了与所用的冷冻试剂和复苏试剂有关，还与具体的冷冻和复苏方法有很大关系。

发明内容

针对上述现有技术中卵母细胞或胚胎经过快速冷冻后复苏存活率不高的问题，本发明提供了一种卵母细胞或胚胎快速快速冷冻和复苏的方法及其使用的复苏液，以达到提高卵母细胞或胚胎经过快速冷冻后复苏存活率的目的。

对此，本发明提供了一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，包括卵母细胞或胚胎快速冷冻过程和复苏过程，所述复苏过程包括以下步骤：

步骤1)：在将玻璃化冷冻保存的卵母细胞或胚胎取出复苏前，先将2号复苏液预热达到25-27℃，注入到培养装置A中，得到2号复苏液A；然后将预热达到25-27℃的复苏基础液注入到培养装置B和培养装置C中，分别得到复苏基础液B和复苏基础液C；将1号复苏试剂保持密封进行预热，并将培养装置预热，预热温度均为36～39℃，预热时间大于30min；将预热好的1号复苏液注入到预热好的培养装置中，并将培养装置放在显微镜下；

步骤2)：取出载体管，并将含有卵母细胞或胚胎的部分浸入到1号复苏液中，将含有卵母细胞或胚胎的混合液排出到1号复苏液中；

步骤3)：将1号复苏液注入到2号复苏液A的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置2～5min；

步骤4)：将1号复苏液注入到复苏基础液B的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置3～10min；

步骤5)：将1号复苏液注入到复苏基础液C的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置3～10min；

步骤6)：将卵母细胞或胚胎进行洗脱，然后转移到新鲜的培养基中；

所述步骤6)后，将卵母细胞或胚胎在培养基中培养2-4小时后，即可进行ICSI(卵泡浆内单精子显微注射)和胚胎转化；

所述1号复苏液和2号复苏液均为包含了蔗糖的复苏基础液，所述1号复苏液的蔗糖摩尔浓度大于所述2号复苏液的蔗糖摩尔浓度，这样，卵母细胞或胚胎在1号复苏液中均衡后，转移到浓度较小的2号复苏液中均衡，逐步适应和平衡。所述1号复苏液和2号复苏液可采用现有技术的常规复苏液，满足所述1号复苏液的蔗糖浓度大于所述2号复苏液的蔗糖浓度；所述复苏基础液可采用现有技术常规的复苏基础液。所述2号复苏液A为预热达到25-27℃的2号复苏液，该预热后的2号复苏液放置于培养装置A中，命名为2号复苏液A；所述复苏基础液B为预热达到25-27℃并注入到培养装置B的复苏基础液；所述复苏基础液C为预热达到25-27℃并注入到培养装置C的复苏基础液。

采用本技术方案，多次的、缓慢的将卵母细胞或胚胎在复苏液中进行均衡，能更好地保护卵母细胞或胚胎，有效地提高卵母细胞或胚胎经过快速玻璃化冷冻后的复苏存活率，并且保持冷冻复苏后卵母细胞或胚胎的生长分化和表达能力等全能性不受影响。

所有浸入操作在显微镜下操作，可以减少错误，减少对卵母细胞或胚胎的伤害。

作为本发明的进一步改进，所述步骤2)取出载体管后，打开载体管的密封部分，将载体管含有卵母细胞或胚胎的一端置于1号复苏试剂上方2～5s，浸入到1号复苏试剂中，并使载体管含有卵母细胞或胚胎的一端完全浸入到复苏试剂中，载体管的浸入角度为相对于水平面20°至30°，整个浸入操作在显微镜下操作；然后，将载体管的另一端堵住，载体管里的溶液就从载体管中流出到1号复苏试剂中，或者采用移液装置从载体管的另一端加入空气排除含有卵母细胞或胚胎的溶液。

采用此技术方案，便于载体管中卵母细胞或胚胎的快速排除，而不对敏感的卵母细胞或胚胎造成损害。

作为本发明的进一步改进，所述卵母细胞或胚胎快速冷冻过程包括以下步骤：

步骤A：将卵母细胞或胚胎在36～39℃预热的冷冻液中平衡；

步骤B：将卵母细胞或胚胎载入到载体管中；

步骤C：将装载了卵母细胞或胚胎的载体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层至距离液氮液面5～10mm，将载体管以载体管一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮液面，并使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中，旋转时间不大于5s；将载体管密封放入到液氮中保存。

采用此技术方案，采用步骤C的方法让装载了卵母细胞或胚胎的载体管旋转，使其先接触液氮蒸汽，然后再渐渐的接触液氮液面，直至完全浸入到液氮中，让卵母细胞或胚胎逐渐适应低温的液氮环境，减少对卵母细胞或胚胎的损害，有利于提高卵母细胞或胚胎经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

作为本发明的进一步改进，所述步骤A包括以下分步骤：

步骤A)：将36～39℃预热的冷冻基础液滴在培养装置上，得到第一液滴；将36～39℃预热的1号冷冻液滴在第一液滴的旁边，得到第二液滴；将卵母细胞或胚胎转移至第一液滴的液体底部，等待5～30s；然后将第一液滴和第二液滴联通形成第一液体桥，等待2～5min；将36～39℃预热的1号冷冻液滴在所述第一液体桥的旁边，得到第三液滴；将卵母细胞或胚胎转移至所述第一液体桥上；将第三液滴与所述第一液体桥联通形成第二液体桥，等待2～5min；

步骤B)：将36～39℃预热的1号冷冻液滴在培养装置的空处，得到第四液滴，将卵母细胞或胚胎转移至第四液滴的顶部，保持静置，均衡6～12min；

步骤C)：将36～39℃预热的2号冷冻液滴两份在培养装置的空处，分别得到第五液滴和第六液滴，所述第五液滴和第六液滴之间留有空隙；将卵母细胞或胚胎转移至第五液滴上，混合15～30s；再将含有卵母细胞或胚胎的混合液转移至第六液滴上，混合15～30s；

其中，所述1号冷冻液和2号冷冻液均为包含相同冷冻基础液的冷冻液，所述1号冷冻液中冷冻基础液的体积含量大于所述2号冷冻液中冷冻基础液的体积含量，即所述1号冷冻液中其他物质的浓度小于所述2号冷冻液中其他物质的浓度，这样，干细胞在1号冷冻液中平衡后，转移到浓度较高的2号冷冻液中平衡，逐步适应和平衡，这个过程更利于使干细胞中的水分子游离出来进入到冷冻液中，在后续干细胞的玻璃化冷冻时，减少对干细胞的损害，更好的提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

所述冷冻基础液可以采用现有技术中已知的预冻液，所述1号冷冻液和2号冷冻液可以采用现有技术中已知的冷冻液，满足1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于2号冷冻液中冷冻基础液的浓度即可；可以为1号冷冻液和2号冷冻液中的组成物质相同，只是配比不同，1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于2号冷冻液中冷冻基础液的浓度，1号冷冻液中其他物质浓度小于2号冷冻液中其他物质的浓度。

较优的，上述步骤A)、步骤B)和步骤C)中在进行卵母细胞或胚胎时，提取含卵母细胞或胚胎有细胞的试剂时单次提取量不超过1μL。

采用此技术方案，对卵母细胞或胚胎采用通过分步搭桥手段，梯度降低细胞中的水分浓度，让卵母细胞或胚胎适应冷冻液的环境，减少对卵母细胞或胚胎的损伤，使卵母细胞或胚胎中的水分逐步进入到冷冻液中，能更好的保护卵母细胞或胚胎细胞，有利于提高卵母细胞或胚胎经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

作为本发明的进一步改进，所述步骤B)均衡6～12min后，还包括在显微镜下检查卵母细胞或胚胎，如果卵母细胞或胚胎复原情况不佳，再等待3～6min。采用此技术方案，能更好的保护卵母细胞或胚胎，有利于提高卵母细胞或胚胎经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

作为本发明的进一步改进，所述冷冻基础液包含的组分及其体积含量为：血清替代补充液15-25％，TCM199缓冲液75-85％；所述1号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇2.5-12.5％、二甲基亚砜2.5-12.5％和所述冷冻基础液80-90％；所述2号冷冻液包含的组分及其体积含量为乙二醇11-21％、二甲基亚砜11-21％和含有1mol/L蔗糖的所述冷冻基础液63-73％。

采用此技术方案的冷冻基础液和冷冻液，可以为卵母细胞或胚胎提供全面的营养，而又不给卵母细胞或胚胎造成污染，更好的保护卵母细胞或胚胎，使经玻璃化冷冻的卵母细胞或胚胎复苏存活率得到提高，使复苏后卵母细胞或胚胎全能性不受影响。

作为本发明的进一步改进，所述步骤C中，将载体管以载体管一端为圆心向液氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹角为30～45度，停留0.5～1.5s，然后继续旋转至与水平面夹角60～70度，停留0.5～1.5s，最后旋转成垂直于液氮液面。采用更阶梯式旋转，逐渐适应液氮和低温环境，减少了对卵母细胞或胚胎的损害，更好的提高卵母细胞或胚胎经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

作为本发明的进一步改进，所述步骤C还包括，载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中后，将载体管在液氮中划动2～5s，然后将载体管沉入到液氮中保存。采用此技术方案，可以更进一步的适应液氮环境，提高降温速度，减少接触液氮后与液氮温度平衡的时间，达到快速玻璃化的目的，更好的保护卵母细胞或胚胎，提高卵母细胞或胚胎经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，使复苏后卵母细胞或胚胎全能性不受影响。

作为本发明的进一步改进，其特征在于：所述步骤3)、步骤4)和步骤5)中每次使用1号复苏液的用量为每个卵母细胞或胚胎3～10μL。

本发明还提供了一种如上所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法中使用的复苏液，包括复苏基础液、1号复苏液和2号复苏液，所述复苏基础液包含的组分及其体积含量为：血清替代补充液5-25％、Hepes-TCM199缓冲液75-85％；所述1号复苏液为含有1mol/L蔗糖的复苏基础液；所述2号复苏液为含有0.5mol/L蔗糖的复苏基础液。所述Hepes-TCM199缓冲液优选含有0.22g/L丙酮酸钠和0.0461g/L左旋谷氨酰胺的Hepes-TCM199缓冲液。此技术方案根据卵母细胞或胚胎的特点设计的复苏液体系，可以为卵母细胞或胚胎提供全面的营养，而又不会给卵母细胞或胚胎造成污染，更好的保护卵母细胞或胚胎，使经玻璃化冷冻的卵母细胞或胚胎复苏存活率得到提高，使复苏后卵母细胞或胚胎全能性不受影响。

在本发明中，如果没有特殊说明，术语“胚胎”为哺乳动物的胚胎特别是哺乳动物的胚囊，包括但不限于：猪胚囊、牛胚囊或鼠胚囊。

在本发明中，如果没有特殊说明，术语“卵母细胞”为哺乳动物的MII期卵母细胞，所述哺乳动物包括但不限于：猪、牛、羊或鼠。

在本发明中，如果没有特殊说明，术语“含量”均为体积含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的技术方案能够在进行快速玻璃化冷冻和复苏时更好地保护卵母细胞或胚胎，有效地提高卵母细胞或胚胎经过快速玻璃化冷冻后的复苏存活率，并且保持冷冻复苏后卵母细胞或胚胎的生长分化和表达能力等全能性不受影响；对于一些数量极少而且很敏感的卵母细胞或胚胎，复苏存活率可以提高到95％以上。

附图说明

图1是本发明一种实施例卵母细胞快速冷冻过程的平衡过程示意图；

图2是本发明一种实施例装载了卵母细胞或胚胎的载体管旋转浸入液氮的示意图；

图3是本发明一种实施例卵母细胞细胞恢复的均衡过程示意图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

实施例1

用于卵母细胞或囊胚快速冷冻的冷冻液制备：

所述冷冻液包括冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液；

所述冷冻基础液所包含的组分及体积含量为：血清替代补充液20％，TCM199缓冲液80％；

所述1号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇5％，二甲基亚砜10％、冷冻基础液85％；

所述2号冷冻液包含的组分及其体积含量为乙二醇15％、二甲基亚砜15％、含有1mol/L蔗糖的冷冻基础液70％。

在室温下，分别将上述冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液包含的组分混合，并搅拌均匀，待预热到36～39℃，待用。

用于卵母细胞或囊胚快速冷冻的复苏液制备：

所述复苏液包括复苏基础液、1号复苏液和2号复苏液；

所述复苏基础液包含的组分及其体积含量为：血清替代补充液20％、含有0.22g/L丙酮酸钠和0.0461g/L左旋谷氨酰胺的Hepes-TCM199缓冲液80％；

所述1号复苏液为含有1mol/L蔗糖的复苏基础液；

所述2号复苏液为含有0.5mol/L蔗糖的复苏基础液。

在室温下，分别将上述1号复苏液和2号复苏液包含的组分混合，并搅拌均匀，待用。

实施例2卵母细胞的快速冷冻和复苏实验

一、卵母细胞的玻璃化快速冷冻：

载体管采用OPS麦管，所述OPS麦管包括冷冻管和保护管，所述冷冻管一端为大口径端，另外一端为小口径端；冷冻液采用上述实施例1制备好的冷冻液；卵母细胞为牛卵母细胞。

步骤A：将卵母细胞在冷冻液中平衡，卵母细胞快速冷冻过程的平衡过程示意图如图1所示；

(1)准备一个经36～39℃预热的30mm的培养皿。用移液枪在培养皿上部分别滴出50μL的冷冻基础液和50μL的1号冷冻液，使之相邻，分别得到第一液滴和第二液滴。

(2)将准备平衡的卵母细胞用移液枪放入冷冻基础液即第一液滴的底部，使卵母细胞与试剂充分接触，静待5～10秒，随后用液体桥接联通第一液滴和第二液滴形成第一液体桥，计时等待3分钟。

(3)将50μL的1号冷冻液滴落在第一液体桥旁边，得到第三液滴，把卵母细胞用移液枪移至到步骤(2)所述第一液体桥上。

(4)在第三液滴与第一液体桥之间再搭一个液体桥形成第二液体桥，随后继续计时等待3分钟。

(5)在培养皿的3点钟位置尽量靠近培养皿边缘处滴100μL的1号冷冻液液，得到第四液滴，将卵母细胞放在第四液滴顶部，让其自然下沉，等待大约9分钟。这个过程需要完全静置，不要搅动、碰触。

9分钟均衡之后，在显微镜下检查细胞，如果卵母细胞全部复原(例如卵周隙跟开始均衡时具有一样的宽窄度)，请继续进行下一步操作。如果复原情况不佳，请继续等待3～6分钟。

(6)在培养皿的6点钟位置分别滴两滴100μL的2号冷冻液，得到第五液滴和第六液滴，第五液滴和第六液滴之间需要有空隙，也远离其小液滴。

将卵母细胞放在第五液滴上，用移液枪抽吸混合大概20秒，然后把含有卵母细胞的混合液放到第六液滴上，用移液枪抽吸混合大概20秒。

上述步骤(1)～(6)中提取或转移卵母细胞时，提取的含有卵母细胞的混合液量不要超过1μL。

步骤B：上述均衡混合操作完成后，将卵母细胞载入到载体管中；

用移液枪将卵母细胞从培养皿中的小滴里提取出来，用移液枪吸取的含有卵母细胞溶液的总量为1μL左右；然后将溶液以液滴形式滴落在培养皿的9点钟位置。在滴落过程中，不能使液滴平摊在试剂盘上，而是尽量利用液体的分子张力，形成一个有侧立面，有一定高度的，立体的小液滴；重复此操作。

当小液滴滴落之后，立刻用冷冻管的小口径端，从小液滴的左边以载体管与桌面形成的夹角45°～60°的角度去触碰吸取这个小液滴，由于虹吸原理，小液滴就会被吸入载体管内。

步骤C：卵母细胞的玻璃化冷冻；

将装载了卵母细胞的冷冻管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，至距离液氮液面5～10mm，将冷冻管以冷冻管的大口径端为圆心向液氮液面进行旋转，如图2所示，先旋转至冷冻管与水平面夹角为30～45度处，停留0.5～1.5s；然后继续旋转至与水平面夹角60～70度，停留0.5～1.5s，最后旋转成垂直于液氮液面，并使装载了细胞的冷冻管小口径端浸入到液氮中，保持此状态在液氮中划动2s；

步骤D：将冷冻管装入到保护管中，将保护管的管口用密封钳进行加热密封，然后沉入到液氮中保存。

二、玻璃化快速冷冻保存的卵母细胞的复苏：

以下均在25℃的环境下进行。

1.复苏前准备：

复温前1小时，准备好以下内容：

Ⅰ、30mm培养皿一只，四孔盘一只；

Ⅱ、温度预热到37℃的3000μL的1号复苏液；预热试剂时以原始封存形式整瓶预热(不可启封)。

在复温操作前，将30mm培养皿和预热过的1号复苏液放在37℃的保温箱内，直至需要时再取出。

Ⅲ、准备实体显微镜一台并提前调节好适当的焦距，使之在下一步操作中可以看清楚30mm培养皿中的细胞。

复温前，把1000μL的经预热达到25-27℃的2号复苏液注入四孔盘的孔2中。同时，孔3和孔4分别注入经预热1000μL的复苏基础液，孔1保持空余状态，四孔盘放在操作台上待用。

把经过一小时预热的30mm培养皿和3000μL的1号复苏液从37℃保温箱内移出，将3000μL的1号复苏液全部注入30mm培养皿，之后将装好复苏液的培养皿放在显微镜下。

2、取出载体管

将载体管的上端慢慢抬起，直至超过液氮液面，剪掉保护管原先密封的一端，将冷冻管从保护管中拉出一部分，用左手捏住以保持载体管不会掉落回保存管中，用右手的拇指和中指捏住冷冻管上部彻底抽出冷冻管，同时要注意让食指靠近冷冻管的上端，以便在下一步中可以实现轻敲操作。

3、复温操作

(1)浸没操作

将冷冻管装载有卵母细胞的一端置于30mm培养皿中的1号复苏液的上方大约3秒，随后把冷冻管浸入复苏液中，冷冻管的浸入角度为相对于水平面20°至30°，使冷冻管中包含卵母细胞的那一端完全浸没在复苏液中，整个浸没操作在实体显微镜下进行；显微操作可以帮助操作者减少错误，在这一步操作中，如果太早浸入复苏液中，则会造成气泡带状损害；如果浸入复苏液太晚，冷冻管上则会结冰。

(2)排出操作

当玻璃化的物质融化后，一般情况下融化过程不会超过一秒，培养皿中的试剂会倒流进载体管里。此时，请操作者用食指严密的堵住载体管的另一端，所有的溶液将会从载体管中流出到培养皿中。

形成这种现象的原理是因为载体管中的空气因为温度的升高而膨胀，随着空气体积的不断膨胀而使载体管前端的液体排出。为了让细胞排出工作更成功，之前的操作过程中尽可能的在低温环境下进行。如果载体管中的液体有不能完全排出的，这时采用移液枪从载体管的另一端打入一些空气帮助排空载体冷冻管中含有卵母细胞的液体。

当排出操作结束后，静置一分钟，之后用移液枪把卵母细胞从培养皿转移到四孔盘的孔2中。

4、细胞恢复

(1)用移液枪从装载有卵母细胞的30mm培养皿中提取大约10-20μL的1号复苏液，之后把移液枪伸入至四孔盘的孔2底部，随即排出1号复苏液，在孔2的2号复苏液内部形成一个液面层，如图3所示；由于1号复苏液与2号复苏液的浓度不同，所以他们短时间内不会融合；之后把卵母细胞放在1号复苏液形成的液面层上，然后再用移液枪提取大约10-20μL的1号复苏液伸入至四孔盘的孔2中，在卵母细胞的上面注入1号复苏液，静置3分钟。采用此技术方案是为了防止因为渗透压变化过于剧烈而导致卵母细胞损伤。

(2)3分钟后，采用上述同样的操作过程，先在孔3底部注入1号复苏液，在孔3的复苏基础液内部形成一个液面层，之后把卵母细胞放在1号复苏液形成的液面层上，再在卵母细胞上面注入1号复苏液，静置5分钟。

(3)5分钟后，采用上述同样的操作过程，先在孔4底部注入1号复苏液，在孔4的复苏基础液内部形成一个液面层，之后把卵母细胞放在1号复苏液形成的液面层上，再在卵母细胞上面注入1号复苏液，静置3分钟，随即洗脱数次即可。

(4)当完成上述步骤后，将卵母细胞转移到适宜的培养基中。培养2-4个小时后即可进行ICSI(卵泡浆内单精子显微注射)。

按照上述方法将16批次状态良好的卵母细胞分别进行冷冻，每个批次设置4个平行试验；并按照上述复苏过程的方法对各批次的冷冻卵母细胞进行复苏，然后检查卵母细胞的存活情况，对数据进行统计，详见表1。

同时，设置了对照组，对照组采用现有技术常规的冷冻方法进行冷冻，常规的复苏方法进行复苏，对复苏后的卵母细胞的存活情况进行统计，详见表1。

同时设置了对比试验，分别为对照组1和对照组2。

对照组1中采用的冷冻液和复苏液为日本加藤公司出品的冷冻复苏液(CryotopVitrification Kit)，操作步骤同本实施例2中的快速冷冻过程和复苏过程的操作步骤。

对照组2中采用的冷冻液的组分及其体积含量为DMSO 10％，胎牛血清90％；冷冻方法是先把卵母细胞放到冷冻液中冻存于-80℃的冰柜中，24小时后取出，放到液氮里；复苏方法是先把卵母细胞放到37℃的水浴箱内解冻，然后在500rpm的速度离心5分钟，加培养液洗涤3次，然后放在含有10％(体积含量)胎牛血清的细胞培养液培养。

表1实施例2、对照组1和对照组2的卵母细胞经冷冻后复苏后的存活情况

备注：统计后结果Mean±SE：97％±0.18％

从上述表1的数据可见，采用本发明技术方案的冷冻和复苏的方法，复苏后的卵母细胞的存活率最高可达到100％，平均存活率达到97％，远远高于对照组1和对照组2的复苏存活率，实施例2与对照组2的快速冷冻过程和复苏过程的步骤和工艺相同，所用的冷冻液和复苏液不同，可见采用本技术方案的实施例2的效果更好，卵母细胞的复苏存活率更高；即采用本发明技术方案的冻存复苏的方法及其复苏液，囊胚的复苏存活率更高。

实施例3囊胚的快速冷冻和复苏实验

一、囊胚的玻璃化快速冷冻：

载体管采用OPS麦管，所述OPS麦管包括冷冻管和保护管，所述冷冻管一端为大口径端，另外一端为小口径端；冷冻液采用上述实施例3制备好的冷冻液；培养装置采用60mm的培养皿；囊胚为鼠囊胚。

步骤A：将囊胚在冷冻液中平衡；

(1)将一滴50μL经预热达到36～39℃的冷冻基础液滴在培养皿的12点钟位置，随后将囊胚转移到液滴上让其充分接触。

(2)将一滴100μL经预热达到36～39℃的1号冷冻液滴在培养皿的3点钟位置，将细胞放在1号冷冻液的液滴顶部，让其自然下沉，计时等待15分钟；随后在显微镜下观察囊胚是否重新膨胀，是否达到早期囊胚常规的、几乎饱满的状态；如果没有达到，继续等待3～6min；

(3)在培养皿的6点钟位置分别滴两滴经预热达到36～39℃的100μL 2号冷冻液，两滴液滴之间留有空隙，也远离其小液滴。

将囊胚放在其中一滴2号冷冻液液滴上，用移液枪抽吸混合大概20秒，然后把含有囊胚的混合液放到另外一滴2号冷冻液液滴上，用移液枪抽吸混合大概20秒。

上述步骤(1)～(3)中提取或转移囊胚时，每次提取含有囊胚的混合液量不要超过1μL。

步骤B：将囊胚载入到载体管中；

用移液枪将囊胚从培养皿中的小滴里提取出来，用移液枪吸取的含细胞溶液总量为1μL；然后将溶液以液滴形式滴落在培养皿的9点钟位置，在滴落过程中，不能使液滴平摊在试剂盘上，而是尽量利用液体的分子张力，形成一个有侧立面，有一定高度的，立体的小液滴；重复此操作，将囊胚全部载入到载体管中。

当小液滴滴落之后，立刻用冷冻管的小口径端，从小液滴的左边以载体管与桌面形成的夹角45°～60°的角度去触碰吸取这个小液滴，由于虹吸原理，小液滴就会被吸入载体管内。

步骤C：囊胚的玻璃化冷冻

将装载了囊胚的冷冻管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，至距离液氮液面5～10mm，将冷冻管以冷冻管的大口径端为圆心向液氮液面进行旋转，如图2所示，先旋转至冷冻管与水平面夹角为30～45度处，停留0.5～1s；然后继续旋转至与水平面夹角60～70度，停留0.5～1s，最后旋转成垂直于液氮液面，并使装载了囊胚的冷冻管小口径端浸入到液氮中；

步骤D：将冷冻管装入到保护管中，将保护管的管口用密封钳进行加热密封，然后沉入到液氮中保存。

二、玻璃化快速冷冻保存的囊胚的复苏：

以下均在25℃的环境下进行。

1.复苏前准备：

复温前1小时，准备好以下内容：

Ⅰ、30mm培养皿一只，四孔盘一只；

Ⅱ、温度预热到37℃的3000μL的1号复苏液，预热试剂时以原始封存形式整瓶预热。

在复温操作前，将30mm培养皿和预热过的1号复苏液放在37℃的保温箱内，直至需要时再取出。

Ⅲ、准备实体显微镜一台并提前调节好适当的焦距，使之在下一步操作中可以看清楚30mm培养皿中的细胞。

复温前，把1000μL的经预热达到25-27℃的2号复苏液注入四孔盘的孔2中。同时，孔3和孔4分别注入经预热达到25-27℃的1000μL的复苏基础液，孔1保持空余状态，四孔盘放在操作台上待用。

把经过一小时预热的30mm培养皿和3000μL的1号复苏液从37度保温箱内移出，将3000μL的1号复苏液全部注入30mm培养皿，之后将装好复苏液的培养皿放在显微镜下。

2、取出载体管

将载体管的上端慢慢抬起，直至超过液氮液面，剪掉保护管原先密封的一端，将冷冻管从保护管中拉出一部分，用左手捏住以保持载体管不会掉落回保存管中，用右手的拇指和中指捏住冷冻管上部彻底抽出冷冻管，同时要注意让食指靠近冷冻管的上端，以便在下一步中可以实现轻敲操作。

3、复温操作

(1)浸没操作

将冷冻管装载有囊胚的一端置于30mm培养皿中的1号复苏液的上方大约3秒，随后把冷冻管浸入到复苏液中，冷冻管的浸入角度为相对于水平面20°至30°，使冷冻管中包含囊胚的那一端完全浸没在试剂中，整个浸没操作在实体显微镜下进行；显微操作可以帮助操作者减少错误，在这一步操作中，如果太早浸入试剂中，则会造成气泡带状损害；如果浸入试剂太晚，冷冻管上则会结冰。

(2)排出操作

当玻璃化的物质融化后，培养皿中的试剂会倒流进载体管里。此时，用食指严密的堵住载体管的另一端，所有的溶液将会从载体管中流出到培养皿中。

形成这种现象的原理是因为载体管中的空气因为温度的升高而膨胀，随着空气体积的不断膨胀而使载体管前端的液体排出。为了让细胞排出工作更成功，之前的操作过程中尽可能的在低温环境下进行。如果载体管中的液体有不能完全排出的，这时采用移液枪从载体管的另一端打入一些空气帮助排空载体冷冻管中含有囊胚的液体。

当排出操作结束后，静置一分钟，之后用移液枪把囊胚从培养皿转移到四孔盘的孔2中。

4、细胞恢复

(1)参考图3所示，除图3中的卵母细胞改为囊胚之外其他都相同，用移液枪从装载有囊胚的30mm培养皿中提取大约10-20μL的1号复苏液，之后把移液枪伸入至四孔盘的孔2底部，随即排出1号复苏液，在孔2的2号复苏液内部形成一个液面层，由于1号复苏液与2号复苏液的浓度不同，所以他们短时间内不会融合；之后把囊胚放在1号复苏液形成的液面层上，然后再用移液枪提取大约10-20μL的1号复苏液伸入至四孔盘的孔2中，在囊胚的上面注入1号复苏液，静置3分钟。采用此技术方案是为了防止因为渗透压变化过于剧烈而导致囊胚损伤。

(2)3分钟后，采用上述同样的操作过程，先在孔3底部注入1号复苏液，在孔3的复苏基础液内部形成一个液面层,之后把囊胚放在1号复苏液形成的液面层上，再在囊胚上面注入1号复苏液，静置5分钟。

(3)5分钟后，采用上述同样的操作过程，先在孔4底部注入1号复苏液，在孔4的复苏基础液内部形成一个液面层,之后把囊胚放在1号复苏液形成的液面层上，再在囊胚上面注入1号复苏液，静置3分钟，随即洗脱数次即可。

(4)当完成上述步骤后，将囊胚转移到适宜的培养基中。培养2-4个小时后即可进行ICSI(卵泡浆内单精子显微注射)。

按照上述方法将16批次状态良好的囊胚分别进行冷冻，每个批次设置4个平行试验；并按照上述的复苏过程的方法对各批次的冷冻囊胚进行复苏，然后检查囊胚的存活情况，对数据进行统计，详见表1。

同时，设置了对照组，对照组采用现有技术常规的冷冻方法进行冷冻，常规的复苏方法进行复苏，对复苏后的卵母细胞的存活情况进行统计，详见表2。

同时设置了对比试验，分别为对照组3和对照组4。

对照组3中采用的冷冻液和复苏液为日本加藤公司出品的冷冻复苏液(CryotopVitrification Kit)，操作步骤同本实施例3中的快速冷冻过程和复苏过程的操作步骤。

表2实施例3、对照组3和对照组4的囊胚经冷冻后复苏后的存活情况

备注：统计后结果：Mean±SE：95.3％±0.54％

对照组4中采用的冷冻液的组分及其体积含量为DMSO 10％，胎牛血清90％；冷冻方法是先把卵母细胞放到冷冻液中冻存于-80℃的冰柜中，24小时后取出，放到液氮里；复苏方法是先把卵母细胞放到37℃的水浴箱内解冻，然后在500rpm的速度离心5分钟，加培养液洗涤3次，然后放在含有10％(体积含量)胎牛血清的细胞培养液培养。

从上述表2的数据可见，采用本发明技术方案的冻存复苏的方法，复苏后的囊胚的存活率最高可达到100％，平均存活率达到95.3％，远远高于对照组3和对照组4的存活率；实施例3与对照组4快速冷冻过程和复苏过程的操作步骤和工艺相同，所用的冷冻液和复苏液不同，可见采用本技术方案的实施例3的效果更好，囊胚的复苏存活率更高；即采用本发明技术方案的冻存复苏的方法及其复苏液，囊胚的复苏存活率更高。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：包括卵母细胞或胚胎的快速冷冻过程和复苏过程，所述复苏过程包括以下步骤：

步骤1）：在玻璃化冷冻保存的卵母细胞或胚胎复苏前，先将2号复苏液预热达到25-27℃，注入到培养装置A中，得到2号复苏液A；然后将预热达到25-27℃的复苏基础液注入到培养装置B和培养装置C中，分别得到复苏基础液B和复苏基础液C；将1号复苏液保持密封进行预热，并将培养装置预热，预热温度均为36~39度，预热时间大于30min，将预热好的1号复苏液注入到预热好的培养装置中，并将培养装置放在显微镜下；

步骤2）：取出载体管，并将含有卵母细胞或胚胎的部分浸入到1号复苏液中，将含有卵母细胞或胚胎的混合液排出到1号复苏液中；

步骤3）：将1号复苏液注入到2号复苏液A的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置2~5min；

步骤4）：将1号复苏液注入到复苏基础液B的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置3~10min；

步骤5）：将1号复苏液注入到复苏基础液C的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置3~10min；

步骤6）：将卵母细胞或胚胎进行洗脱，然后转移到新鲜的培养基中；

其中，所述1号复苏液和2号复苏液均为包含了蔗糖的复苏基础液，所述1号复苏液的蔗糖摩尔浓度大于所述2号复苏液的蔗糖摩尔浓度。

2.根据权利要求1所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：所述步骤2）取出载体管后，打开载体管的密封部分，将载体管含有卵母细胞或胚胎的一端置于1号复苏液上方2~5s，浸入到1号复苏液中，并使载体管含有卵母细胞或胚胎的一端完全浸入到复苏液中，载体管的浸入角度为相对于水平面20°至30°，整个浸入操作在显微镜下操作；然后，将载体管的另一端堵住，载体管里的溶液就从载体管中流出到1号复苏液中，或者采用移液装置从载体管的另一端加入空气排除含有卵母细胞或胚胎的溶液。

3.根据权利要求1所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：所述卵母细胞或胚胎的快速冷冻过程包括以下步骤：

步骤A：将卵母细胞或胚胎在36~39℃预热的冷冻液中平衡；

步骤B：将卵母细胞或胚胎载入到载体管中；

步骤C：将装载了卵母细胞或胚胎的载体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层至距离液氮液面5~10mm，将载体管以载体管一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮液面，并使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中，旋转时间不大于5s；将载体管密封放入到液氮中保存。

4.根据权利要求3所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：所述步骤A包括以下分步骤：

步骤A）：将36~39℃预热的冷冻基础液滴在培养装置上，得到第一液滴；将36~39℃预热的1号冷冻液滴在第一液滴的旁边，得到第二液滴；将卵母细胞或胚胎转移至第一液滴的液体底部，等待5~30s；然后将第一液滴和第二液滴联通形成第一液体桥，等待2~5min；将36~39℃预热的1号冷冻液滴在所述第一液体桥的旁边，得到第三液滴；将卵母细胞或胚胎转移至所述第一液体桥上；将第三液滴与所述第一液体桥联通形成第二液体桥，等待2~5min；

步骤B）：将36~39℃预热的1号冷冻液滴在培养装置的空处，得到第四液滴，将卵母细胞或胚胎转移至第四液滴的顶部，保持静置，均衡6~12min；

步骤C）：将36~39℃预热的2号冷冻液滴两份在培养装置的空处，分别得到第五液滴和第六液滴，所述第五液滴和第六液滴之间留有空隙；将卵母细胞或胚胎转移至第五液滴上，混合15~30s；再将含有卵母细胞或胚胎的混合液转移至第六液滴上，混合15~30s；

其中，所述1号冷冻液中冷冻基础液的体积含量大于所述2号冷冻液中冷冻基础液的体积含量；所述冷冻基础液包含的组分及其体积含量为：血清替代补充液15-25%和TCM199缓冲液75-85%；所述1号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇2.5-12.5%、二甲基亚砜2.5-12.5%和所述冷冻基础液80-90%；所述2号冷冻液包含的组分及其体积含量为乙二醇11-21%、二甲基亚砜11-21%和含有1mol/L蔗糖的所述冷冻基础液63-73%。

5.根据权利要求4所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：所述步骤B）均衡6~12min后，还包括在显微镜下检查卵母细胞或胚胎，如果卵母细胞或胚胎复原情况不佳，再等待3~6min。

6.根据权利要求3所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：所述步骤C中，将载体管以载体管一端为圆心向液氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹角为30~45度，停留0.5~1.5s，然后继续旋转至与水平面夹角60~70度，停留0.5~1.5s，最后旋转成垂直于液氮液面。

7.根据权利要求3所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：所述步骤C还包括，载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中后，将载体管在液氮中划动2~5s，然后将载体管沉入到液氮中保存。

8.根据权利要求1~7任意一项所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：所述步骤3）、步骤4）和步骤5）中每次使用1号复苏液的用量为每个卵母细胞或胚胎3~10μL。

9.根据权利要求1~7任意一项所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：所述复苏基础液包含的组分及其体积含量为：血清替代补充液5-25%、Hepes-TCM199缓冲液75-85%；所述1号复苏液为含有1mol/L蔗糖的复苏基础液；所述2号复苏液为含有0.5mol/L蔗糖的复苏基础液。