CN111263585A - 低温保存方法和设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于低温保存生物样品的包含密度辅助式玻璃化的方法和设备，其中，低温保存制剂中的生物材料样品从其顶表面冷却，致使冰层形成在其上。随着冷却的继续，冰层穿过样品向下生长以在冰层下方提供低温防护剂和生物材料富含层，该层随着冷却继续至低于玻璃化转变温度而经历玻璃化。

Description

低温保存方法和设备

技术领域

本发明涉及用于低温保存在低温保存介质中的生物材料的包含密度辅助式玻璃化的方法、用于执行这些方法的设备以及通过这些方法所保存的样品。

背景技术

低温保存是一种用于保存生物材料（例如，生物样品）的技术，其包括将样品冷却至非常低的温度（例如，-80°C、-136°C或-196°C），并且将它们长时间周期地维持在该温度。通过将生物样品冷却至低温，否则会使该样品劣化的化学或酶促反应的动力学被减慢至此种程度，也即该样品不再劣化或仅以非常慢的速率劣化。因此，生物样品可长时间周期地储存并且然后可根据使用和/或分析的需要而回复至环境温度。

然而，冷却过程可对生物样品具有不利影响并且为减轻这些影响，已开发出许多用于低温保存的技术，尽管所有这些技术都具有固有的局限性。传统的低温保存技术涉及受控冷却并且导致冰晶的形成。一种备选的无冰技术，也即玻璃化，避免了在冷却期间冰晶的形成并且代替的是涉及使水固化成无定形玻璃。

在低温保存过程期间对生物样品的损害主要地发生在冷却/冷冻阶段和加温阶段期间。溶液效应、细胞外冰的形成、细胞内冰的形成、膜效应、溶质毒性以及脱水都可导致样品损害。通过在低温保存循环期间引入具有已知保护性效果的化合物，可降低这些效应中的一些。在低温保存期间具有保护性效果的化合物称为低温防护剂或低温保护性添加剂（CPA）。

存在生物样品在低温保存期间可遇到的各种应力，这些应力及其对细胞水平影响的实例包括i）温度的降低–可潜在地引起膜脂相和/或细胞骨架解聚方面的变化；ii）溶质浓度的增加（例如，溶液中溶质的浓度随着溶剂的一部分冷冻而增加）–可导致渗透性收缩；iii）离子浓度的增加–可对膜具有直接影响，包括膜蛋白质的溶化；iv）脱水–可引起脂双层不稳定；v）盐的沉淀和共晶体的形成–可引起细胞损伤，尽管机理尚未很好地理解；vi）气泡的形成–可引起机械损伤；vii）粘度的增加–可影响包括渗透的扩散过程；viii）pH值变化–可引起蛋白质的变性等；以及ix）细胞变得紧密密集-可引起膜损伤。因此，需要有最大限度地减小生物样品经受这些各种应力的低温保存技术。

在标准的低温保存技术（有时称为常规低温保存或平衡低温保存）中，细胞或生物质在受控速率的冷冻机中以特定速率或通过使用更简单的被动冷却装置冷却。当样品温度下降低于其平衡融点（melting point）时，冰开始形成（成核）并且冰晶然后从成核点扩散遍及样品，从而常常导致无法弥补的损害。随着冰形成过程的进行，生物样品例如细胞聚集在冰之间的溶质稠密通道中，直至这些通道本身固化（通过玻璃化），并且然后样品储存在其指定的储存温度下。

由于可发生直接冰损害，故这些存在冰的低温保存技术通常认为不适用于保存组织和器官。简而言之，冰晶可在细胞之间扩张或生长成细胞，造成组织宏观结构的破坏，并且因此造成组织功能的破坏。实际上，尽管一些细胞外冰可支承在器官和组织中，但细胞内冰几乎总是对细胞是致命的。迄今为止，在存在冰的系统中已成功地低温保存的仅有哺乳动物器官是绵羊卵巢，并且这些明显比大多数器官或实际上是组织工程构建体小得多（参见Campbell等人，Human Reproduction 2014 Aug；29（8）：1749–1763）。

尽管常规低温保存是一种用于大量应用的经证明的技术，但其应用通常受限于细胞或小聚合体的悬浮液。对于按体积计大于1mm³的活组织检查组织（biopsy）样品例如组织、器官或多细胞机体而言，由于冰的损害，故在冷冻和解冻期间发生了对材料不可接受的损害。

与平衡低温保存相比，玻璃化是一种无冰低温保存技术。各种机理在玻璃化中采用以避免在冷却时冰的生长。玻璃化依赖于使驻留在玻璃化/低温保存介质中的样品低于该玻璃化/低温保存介质的玻璃化转变温度（Tg）而不允许冰晶形成。在温度低于玻璃化转变温度下，系统的粘度增加并且溶剂/介质最终固化以提供稳定的样品，在其中生物材料存在于无定形固体玻璃化/低温保存介质的低温基质中。

经由玻璃化的低温保存通常需要在冷却之前向生物样品添加包含低温保存介质的低温防护剂（CPA），其降低介质和样品含水组分的冷冻温度并且还增加样品含水组分的粘度，使得在低于平衡凝固（或冷冻）点的冷却期间得以避免冰晶形成并且从液态到固态的转变不涉及结晶。然而，生物样品的玻璃化典型地需要快速冷却，例如冷却速率为10,000°C/min或更高，而这固有地将该方法限制于非常小的样品大小。典型地，玻璃化样品提供在内径为1mm或更小的吸管中。利用形成当前技术水平的技术通过玻璃化成功地低温保存较大的样品是非常困难或不可能的。

玻璃化也可通过快速冷却和同时施加高压相结合来实现，但这涉及高成本和需要熟练的操作人员。冷却前在玻璃化过程中添加高浓度的溶质例如二甲亚砜（DMSO）可能是有用的，然而常常观察到所得溶液对生物样品的毒性，同时将这些高粘度液体灌注/扩散到复杂组织中也会很困难。

用以玻璃化的另一方法（称为逐步降低温度（PLT）或液相线跟踪）涉及在冷却期间增加低温防护剂例如DMSO到低温保存介质中的浓度以防止冰形成和用以降低或消除与在液相线跟踪方法中所获得的CPA最终浓度相关联的任何毒性，该毒性将在冷却开始之前（例如，在环境温度下）显示出来，用以随着冷却的继续而最终地提供玻璃化样品。尽管该技术在1960年代首次在理论上提出，但由于各种技术难题，对该技术用于临床样品的成功实践应用仍未实现。对于这种方法未能发展成为成功技术的主要原因在于该过程进行所需的时间，以及在低温下与高溶质浓度所遇到的极高粘度。例如，在低温下所遇到的粘稠液体（例如具有高浓度DMSO的水溶液）变得非常难以泵送并且没有商业装备来实施这种方法。迄今为止，液相线跟踪主要地以逐步的方式进行。样品被添加至CPA溶液，该溶液然后下降至恰高于其凝固点。样品然后移动至具有更高CPA浓度（且因此具有较低凝固点）的溶液，该溶液然后冷却至新的凝固点，并且这继续进行直至样品处于足以玻璃化的浓度。在这种逐步的方法中，遇到了与溶质遗留（carryover）相关联的问题。此外，低温防护剂在低温下扩散到生物样品中（其对于实现整个样品的玻璃化是必不可少的）变得是速率限制的。液相线追踪在无菌条件下也难以实施，即使这是用于保存生物样本的必要条件。

已经证明，哺乳动物胚胎和卵母细胞在少量液体中的玻璃化（无冰低温保存）在保持细胞成活力和功能方面是有效的。然而，尽管进行了广泛的研究，但尚未证明较大生物样品的玻璃化用以在加温时保持结构、成活力和功能，这看起来主要是由于在实现足够快的冷却/加温速率、避免冰成核和最大限度地降低低温防护剂毒性方面的实践困难。

从患者或培养物中移除后，许多组织和组织工程器官不具有任何贮藏寿命。这导致浪费并且损害使用这些材料的技术的经济性并且因此对于组织工程构建体而言，即时制造通常是不可行的。因此，需要用于更好保存的方法，例如文中所述的那些。

活组织检查组织具有许多直接的医学应用，一般地临床活组织检查组织是在获取后“快速地”冷冻并且然后在低温恒温器中切片，然而严重的冰损害使得对结构的判读变得非常困难并且存活细胞的复原是不可能的。备选地，活组织检查组织可为化学地固定的，导致更好地保持样品超微结构，但不利的是，目前使用的固定剂常常干扰着色方法，尤其是那些识别蛋白质抗原性的着色方法，并且没有细胞成活力是从化学地固定的低温保存样品可复原的。这些当前的方法限制在低温保存后可对活组织检查组织进行的诊断检查的范围和类型，并且因此一般地必须在保存之前确定诊断测试。

本发明的一个目的是提供一种改进的低温保存方法，其适用于保存生物样品，特别是组织样品，例如常常无法利用现有技术进行低温保存的活组织检查组织和组织构建体。本发明的还一目的是提供一种设备，在其中可执行根据本发明的低温保存方法。设想的是，本发明的方法经由提供更好保存的生物质，将实现在其中可检查样品用于宽广范围应用的生物库，以及实现甚至在取得样品后的延长时期内的分层医学方法。

发明内容

在第一方面，本发明提供一种用于将包括生物材料的样品低温保存在初始为液体的低温保存介质中的方法，该方法包括冷却样品的顶表面以在样品的顶表面处选择性地形成冰层的步骤。所施加的对样品顶表面的冷却继续，直至样品在冰层下方的层固化为玻璃，由此在低温保存介质中提供生物材料的玻璃化组成物。优选地，冷却经由导热部件进行，该导热部件优选地定位在样品液体的中心，使大部分的样品剩余液体组分中的温度均匀化。该方法包括从样品的顶表面朝向样品的基部逐渐地定向形成冰。根据本发明的方法可用于宽广范围的生物材料的低温保存，例如活组织检查组织或其它组织、人造组织构建体、蛋白质、抗体，或细胞。

在一些实施例中，该方法还包括以下步骤：将冰层下面的样品层冷却至温度接近但高于冰层的温度，例如与冰层的温度相差小于5℃的温度，例如与冰层的温度相差0.1℃至5℃。由于最大限度地减小依赖于温度的密度梯度，故样品在冰层下方的这种次级冷却可有利地增强在低温保存介质中低温防护剂和生物材料的重力驱动式离析。低温保存介质可为包含至少一种低温防护剂的水溶液，该低温防护剂选自以下各项：二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、C₁-C₃醇、1,2-异丙二醇、1,2-丙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、葡萄糖、单糖、二糖（例如蔗糖、海藻糖、乳糖）、多糖（例如棉子糖、葡聚糖）、聚蔗糖、聚乙二醇以及聚乙烯吡咯烷酮。在一些优选的情况下，低温保存介质包括DMSO，或者糖（例如葡萄糖），或者DMSO和糖的组合。在一些优选的实施例中，低温防护剂选自DMSO、甘油、葡萄糖、棉子糖、蔗糖、乳糖、果糖、甲醇，以及乙二醇。在一些实施例中，低温保存介质是指在水中包含自5％w/v至20％w/v的CPA或者CPA的组合的水溶液。

在一些优选的实施例中，导热部件部分地绝缘（或隔热）并且延伸穿过低温保存介质，该部件可从正冷却样品的表面延伸至高于样品的基部，例如高于基部25-65mm或更优选地大约45mm。这确保基部处的样品保持接近但高于冰-液样品界面的温度。在一些实施例中，该部件用作用于冰成核的表面。在一些实施例中，中心杆部件用作冰可自其生长的表面，从而增大冰与液体样品的界面的面积。

在一些实施例中，将重质溶质引入到低温保存介质中以辅助重力诱发式冷冻离析，例如具有密度>2g/cm³的分子。在一些实施例中，重质溶质选自溴化铯、碘化铯、氯化铕、氯化铟、氯化钐以及卤素盐中的任何一种或多种。在优选的实施例中，这些重质溶质具有在水中的高溶解度，使得>0.5g的溶质在4°C下可溶于1ml的水中。在优选的实施例中，如果在治疗中使用，这些重质溶质对细胞不具有破坏性的影响或者对人体健康没有不利。

在一些优选的实施例中，使用囊泡在冷冻期间保持样品，并且优选地，囊泡具有尺寸柔性以使其能够耐受冰形成时存在的更高的力和/或压力。在一些实施例中，囊泡由光滑的或经处理的内壁组成，以允许冰层（多个）响应于由冰晶的扩张所引起的力/压力增大而相对于壁移动。

在一些实施例中，根据本发明的方法还包括以下步骤：在样品的顶面上的冰锋（front）已形成之后向样品在冰层下方的层添加附加的低温防护剂。因此，本发明提供一种实用的液相线跟踪方法，其用于保存临床相关的样品，例如活组织检查组织和组织构建体，在该种情况下，附加的低温防护剂根据冰层或在冰层下方的层的温度的降低以渐进的方式添加。

根据本发明的方法涉及典型地小于每分钟5℃的冷却速率，例如在每分钟0.05至5℃的范围内，优选地在每分钟0.1至2℃之间。在一些实施例中，冷却过程中的“保持”可发生在接近但低于样品的凝固点时，例如在-7℃下1小时至4小时之间。

根据本发明的方法还可包括在冷却期间对样品施加机械搅动，例如通过搅拌、摇动或声波处理。

在另一方面，本发明提供一种用于执行根据任一前述权利要求的低温保存方法的低温保存设备。根据本发明的设备包括壳体，该壳体包括腔体和初级冷却元件，该初级冷却元件呈导热部件形式插入或可插入到腔体中或者形成该壳体的高于腔体的顶板（roof）的部分，在任何情况下，该初级冷却元件布置成延伸到腔体的上部部分中，并且优选地不存在于腔体的下部部分。该设备的壳体通常是热绝缘的。

在低温保存设备中，由初级冷却元件提供的冷却的程度可通过控制单元人工地或自动地控制。一种连接器可提供成用以与位于腔体中（例如在位于腔体内的样品容器中）的传感器连接，该连接器用于附接至适于提供位于腔体中的样品的物理状况的信号特性的传感器。

位于腔体中的任何传感器或多个传感器有利地提供位于腔体中的样品的物理状况的信号特性并且通常电连接至控制单元，该控制单元可从传感器接收信号并且响应于该信号可控制提供给样品的冷却。该信号可例如指示在位于腔体中的样品中存在冰层，或该样品的温度，或该样品的电阻率/电导率。

设备中的腔体可包括入口端口和出口端口。附加的低温防护剂可经由入口端口添加至位于腔体内的生物材料，或者可经由出口端口移除。供应附加的低温防护剂至生物材料（任选地在其中低温防护剂提供在水溶液中）可由构造成用以供应流体至入口端口的泵控制，例如通过推动流体至入口端口或者通过朝向入口端口汲取流体。附加的CPA可根据预置算法来引入，该预置算法使额外CPA的添加速率与传感器读数相关，从而有利地允许执行全自动的玻璃化过程。

在一些实施例中，响应于从位于腔体中的传感器所接收的信号，通向入口端口的流体流由控制单元控制，此类设备对于低温保存的液相线跟踪技术是有用的。根据本发明的设备还可包括用于机械地搅动位于腔体内的样品的器件，例如通过搅拌、摇动或声波处理。在一些优选的实施例中，低温保存设备包括次级冷却元件，该次级冷却元件适于冷却腔体的壁（多个）或底板的区段。次级冷却元件可通过促进生物材料和低温防护剂与冰锋的重力驱动式离析而加快低温保存过程。在使用中，次级冷却元件将样品低于冰锋的部分冷却至温度恰好高于样品中冰层的温度，并且通常仅在一旦冰锋已形成在样品的顶部处才启动并且在任何情况下，仅在一旦冰锋已形成在样品的顶面处才将样品冷却至低于0℃的温度。由次级冷却元件所提供的冷却的程度和速率可由控制单元控制，例如用以匹配预编程的冷却算法。

在另一方面，本发明还提供一种通过根据本发明的方法所获得的低温保存样品或者在根据本发明的设备中所产生的低温保存样品。根据本发明的生物材料的低温保存样品可为活组织检查组织或其它组织、人造组织构建体、蛋白质、抗体或细胞。

附图说明

在附图中以实例的方式图解地例示本技术，其中：

图1示出设备的截面视图；

图2示出设备的截面视图，该设备具有位于壳体中的经历低温保存的样品；

图3示出呈中心杆形式的导热部件的实例，该导热部件用于遍及低温保存介质传导和均匀化热；以及

图4示出使用中心杆的优选设备。

具体实施方式

在根据本发明的低温保存方法中，如在低温保存领域中常规的那样，生物材料保存在含有用作低温保存制剂（低温防护剂/CPA）的溶质的水溶液中。低温防护剂的水溶液在文中称为低温保存介质（CPM）。用语“样品”在文中用来指代低温保存介质中的生物材料。生物材料可为例如活组织检查组织或其它组织、人造组织构建体、蛋白质、抗体或细胞。

在根据本发明的低温保存方法开始时，生物材料和低温保存介质在处于0℃至体温之间、例如在处于0℃至室温之间的温度下混合。生物材料可根据生物材料的性质浸入（或悬浮）在低温保存介质中。所得的用于低温保存的样品（也即在文中简称为样品的在低温保存介质中的生物材料）然后冷却以在第一阶段中形成大量纯净的结晶冰，该结晶冰从上表面和在适当时的玻璃化层的表面向下生长，例如受在下文更详细描述的导热部件的帮助，在一个实施例中，该导热部件呈中心杆的形式，以及该玻璃化层包括在富含低温防护剂的低温保存介质的基质中的生物材料，也即该基质相比于在低温保存过程开始时的低温保存介质包含更高浓度的低温防护剂。

通过建立横越样品的重力驱动式浓度和（任选地）温度梯度，根据本发明的低温保存技术实现了生物样品和低温防护剂的离析。通过将样品放置在腔室（也即在低温保存过程期间冷却的冷冻腔室或腔体）中以及在该技术的第一冷却阶段中选择性地施加冷却至样品的顶表面从而促使冰形成在其上，实现了建立横越样品（用于低温保存）的重力驱动式浓度和温度梯度。

在中心杆和样品的上表面上形成的冰层是“纯”冰，也即基本上或完全不含溶质（也即低温防护剂和生物材料）的冰。由于从低温保存介质中移除作为冰的水并且从新生的冰层中去除溶质，故样品的未冷冻部分中的溶质（低温防护剂和生物样品）的体积浓度存在增加以及在直接地位于新近形成的冰下方的低温保存介质中的溶质低温防护剂（和任何生物样品）的浓度存在局部增加。这种情况导致直接位于冰锋下方的低温保存介质层的密度增加并且在重力的影响下，低温保存介质的这种较稠密部分将朝向样品的底部下沉。因此，随着冷却、冷冻、离析、下沉循环的重复，建立了溶质的重力驱动式浓度梯度。

随着对样品上表面的冷却的维持，冰层继续向下生长到样品中，并且从中心杆向外生长。同时，在冰锋下方的未冷冻样品层中的低温防护剂浓度增加。由于未冷冻的低温保存介质的凝固点随着低温保存介质中低温防护剂浓度的增加而降低，故未冷冻的低温保存介质中所得增加的溶质浓度不利于冰形成在除开冰锋处以外的样品中。最终，定向的从高到低的冰生长提供在样品中位于冰层下方的层，该层富含低温防护剂和生物材料，其具有低于玻璃化转变温度（Tg）的凝固点。样品的这一部分将在持续冷却下玻璃化以提供低温保存样品。

与在其中形成在冰区之间的低温防护剂富含通道的常规低温保存技术相比，在本发明的方法中，富含具有凝固点低于玻璃化转变温度（Tg）的低温防护剂和生物材料的层适用于保存相对较大的样品而不具有显著的冰损害，该层位于冰锋下方。此外，以及与形成当前技术水平的一部分的玻璃化方法相比，本发明的方法不需要极快的冷却速率或施加压力。因此，本发明的方法提供用于成功地低温保存生物样品的机会，该生物样品对于利用常规低温保存和玻璃化方法进行保存而言是太大的。例如，具有大小为大于1mm³的样品可利用本发明的方法进行低温保存。

在优选的实施例中，根据本发明的低温保存方法包括第二冷却阶段，其在样品的顶部处已建立冰层之后开始。

在第二冷却阶段的任选实施例中，除了使样品在其最上表面上冷却之外，还对冷冻腔室中的样品施加附加冷却。通常，仅在样品的顶部处的冰锋已建立之后，才对样品表面下方的冷冻腔室的体积施加这种附加冷却，也即通过在冷冻腔室的壁或底板或者该壁或底板的一部分处进行冷却。在任何情况下，附加冷却本身不足以引起冰的冷冻，并且冰形成总是通过在低温保存期间提供给样品顶表面的初级冷却来启动和保持。这种附加冷却经施加用以使样品的未冷冻部分的温度下降至温度恰好高于冰锋的温度，例如在比冰锋的温度高5°C或更小以内，或者在比冰锋的温度高2°C或更小以内。不受理论的约束，据信施加这种附加冷却可抵消任何热浮力效应，其否则可能会干扰横越样品的溶质的重力驱动式浓度梯度。此外，这种第二冷却还可通过加速在样品中从顶至底的冰生长来加速低温保存过程。

在第二阶段冷却的优选实施例中，部分绝缘的高导热材料（例如铝）的中心杆遍及低温防护剂介质传导热，从而最大限度地减小热梯度。

如上文所提到那样，在等温系统中，从冰锋去除溶质将导致在冰锋下方（也即在冰/未冷冻样品界面处）的水溶液中的更高浓缩的溶质区。由于高溶质浓度相比于较低溶质浓度系统更稠密，故这种高溶质区域将下沉至样品的基部，也即在重力下下沉至样品容器的基部。

据信，这种重力下沉效应就在其中存在大温度梯度的一定程度而言可受到阻碍。在纯水系统中，最大密度出现在+4°C时，并且任何进一步的温度下降都会导致密度的下降。在其中冰从绝缘样品保持器的顶部形成的纯水系统中，液体系统的最冷部分将出现在水-冰界面处。从冰锋向下（也即沿重力增加的方向）前进，水的温度和密度将增加直至在样品的基部处在+4°C时达到最大密度。在水/溶质系统中也将如此，尽管最大密度的温度将根据溶质及其初始浓度而变化少许度数。

当存在溶质时，浮力效应可在一定程度上潜在地抵消浓度驱动效应。更详细地讲，由于溶质浓度高，故当溶质从冰锋去除时恰好形成在冰表面下方的溶质稠密区将有较小的浮力，但相反的是，由于其温度较低（也即因为其温度低于低温保存介质的水溶液具有最高密度所处的温度）故将具有较大的浮力。温度梯度的大小、冰锋的速度以及溶质组成和浓度将决定这些效应中的哪个占主导。

因此，为了确保最大限度的冷冻离析，将针对样品在该样品顶表面下方的部分和自其向下生长的冰层（顶表面从低温保存过程开始起持续地冷却）冷却至温度恰好高于溶液凝固点是有利的，因为这减小了横越样品的温度梯度。针对样品在冰层下方的未冷冻部分的冷却可通过任何适当的器件提供，例如，利用热力发动机的冷却元件、结合在壳体的壁和/或底板中并且与腔体成热接触的冷却浴，冷却夹套或冷却回路。

这种第二冷却阶段有利地最大限度地减小样品中的任何温度梯度。因此，任何温度诱发式浮力效应将降低或消除，并且这将增强溶质和生物材料与冰锋的冷冻诱发式离析。随着液体组分中溶质浓度的增加，剩余液体的凝固点将下降并且因此样品的未冷冻部分的温度可进一步降低至恰好高于新的凝固点。在低温保存过程期间，样品的最冷区将为样品的顶表面和从这个表面向下生长的冰层。

在一些实施例中，根据本发明的方法可在离心机中进行。在这种情况下，自顶表面的冷冻是指样品在离心期间在样品最靠近旋转轴线的表面处（也即在最低重力点处）的冷冻。在所有其它情况下，在样品顶表面处的冷冻是指在气-液界面处横越液体样品的冷冻，或者在液体水平与它包含在其中的容器或冷冻腔室的顶板元件齐平的情况下是指在顶板元件与样品之间的界面处的冷冻。由于顶板位于静态系统中样品的竖直最高部分处，故冰形成在最低重力点处。

在一些优选的实施例中，如上文所限定的重质溶质添加至低温保护性介质中以便加速重质溶质和低温防护剂的区域的重力诱发式下沉。

在冰形成之后溶液的凝固点可通过感测样品顶表面处和来自该顶表面的冰锋的形成和进展来自动地确定。感测可通过任何合适的方式进行。例如，传感器可用来检测温度、光学或量热读数，或者可依赖于测量，例如对样品液体组分的光学（例如浊度）或电性能（例如电导率、电阻率等）自动的自动测量。因此，本发明的优选技术可包括以下步骤：检测在样品顶部处冰层的存在及其在样品中向下的生长。在这些技术中，指示在样品的顶部处存在冰层的读数可引发在样品的顶表面下方将样品冷却至略高的温度，优选地比冰层温度高少于5°C，例如比从样品的顶部生长的冰层的温度高少于2°C，或者比该冰层的温度高少于1°C。

本发明的技术可包括以下步骤：将样品（也即用于低温保存在低温保存介质中的生物材料）放置在冷冻腔室内。样品可直接地引入至冷冻腔室或者可提供在容器中。在其中样品提供在容器中的情况下，容器可为气密地密封的。在其中样品提供在容器中的情况下，容器可提供有液体输入和/或输出端口和/或减压阀，该输入/输出端口适于可密封地接合设备中的对应端口，例如以推动配合的方式。存在的任何输入/输出端口或减压阀通常提供成朝向容器的基部，以便它们可直至对在其中包含生物材料的样品层玻璃化的阶段起作用。任何输入/输出端口可配备有阀以控制液体进出容器，此类阀可由阀控制单元控制，由此允许响应于从位于腔体或样品容器中的传感器或多个传感器所获得的读数引入计划量的附加CPA或CPM。这种有利的配置允许执行自动的液相线跟踪玻璃化，其中，CPA浓度响应于来自腔体或容器中的传感器或多个传感器的读数来调节。备选地或另外，在样品的未冷冻部分中的CPA浓度的调节可响应于根据预定算法从样品所获得的读数来修改。相同的优点可通过在设备的入口/出口端口中配备有受阀控制单元控制的阀来得到，在该种情况下，在入口/出口端口上可存在的任何阀不需要远程地控制。

本发明的技术可使用任何合适的低温防护剂（CPA），例如本领域的低温保存方法中通常使用的那些。

CPA用于减轻在低温保存过程中生物样品所经受应力中的一些。适用于在本发明的方法中使用的CPA是水溶性的，并且通常与水形成稳定的氢键。用以与水分子形成稳定氢键的CPA的能力降低了低温保存介质的凝固点。

CPA的作用是多种的并且取决于其使用的场境和浓度。例如，低分子量CPA可在冷却过程期间进入细胞（也即通过细胞膜）以及降低在冷却期间在细胞内发生冰成核的趋势。高分子量CPA通常将不会穿过细胞膜并且因此不会在细胞或组织样品的细胞外环境中施用它们的效应。在降低细胞外液体的凝固点时，CPA可防止水从细胞中过量流出，从而防止细胞的收缩超过其最小临界体积。通过减少细胞回缩，CPA可减弱细胞内液体的超浓缩并且从而抑制蛋白质的沉淀。理想地，CPA将能够以足够的速率灌注到生物样品中以施用其保护性效应，与在其中冷却速率为每分钟10,000℃是常见的现有技术的玻璃化方法相比，本发明方法的有利地减慢的冷却速率允许在低温保存过程的冷却阶段期间渐进地灌注。CPA还可防止在冷冻过程期间产生过量的盐浓度，其可对细胞有毒性。在低温保存介质中，溶质（也即CPA）的相对浓度将随着该溶质溶解在其中的溶剂（水）的固化（冷冻）而增加。

在本发明的方法中可使用任何合适的CPA或者CPA的组合。可单独地或组合地在本发明的方法中使用的熟知CPA的实例为二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、C₁-C₃醇、1,2-异丙二醇、1,2-丙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、葡萄糖、单糖、二糖（例如蔗糖、海藻糖、乳糖）、多糖（例如棉子糖、葡聚糖）、聚蔗糖、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮。CPA的选择在一定程度上将取决于待低温保存的样品的性质。因此，CPA横越细胞膜的传输在保存蛋白质样品时将不是重要的考虑，而对于细胞、组织和工程组织构建体的保存而言，这将是更大的因素。同样，对于本领域技术人员将清楚的是，CPA用以灌注/扩散到样品中的能力相对于分离的细胞而言对于组织样品更为重要。

典型地，在冷却开始之前在本发明的方法中低温保存介质中的CPA浓度或者CPA浓度之和小于或等于50％（w/v）并且通常小于或等于40％（w/v），例如10％至40％（w/v）。在CPA的浓度低于10％时，冰成核成为更重要的因素，而在CPA的浓度高于50％时，则不能保证玻璃化。一些重质溶质可添加至低温保存介质以便加速重力辅助式离析。

可在本发明的方法中使用的低温保护性制剂的实例包括但不限于可穿过细胞膜的低分子量（Mr<400）CPA，其为醇，例如甲醇、乙醇、1,2-异丙二醇、1,2-丙二醇、甘油、乙二醇、甲酰胺、乙酰胺和二甲基亚砜，以及更高分子量和/或非渗透性CPA，例如单糖（例如葡萄糖）、二糖（例如蔗糖、海藻糖、乳糖）、多糖（棉子糖、葡聚糖）、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蛋白质，以及胎牛血清。特别优选的CPA为DMSO、甘油、葡萄糖、丙二醇，以及聚乙二醇。在一些优选的实施例中，可使用CPA的混合物。例如，低分子量CPA例如DMSO可与非渗透性CPA例如碳水化合物结合地使用以提供用于生物样品的最佳低温保存。

DMSO是用于在根据本发明的方法中使用的优选CPA的实例。如果在根据本发明的方法中使用DMSO，则初始低温保存介质将典型地为均质介质。因此，按体积计包含10％DMSO的水溶液可在根据本发明的方法中使用作为低温保存介质。在这种情况下，如将认识到的那样，在该过程期间的冰生长从低温保存介质中移除水，并且在样品的液体部分中DMSO的浓度从初始值10％逐渐地增加。随着该方法的进行，越来越浓缩（和稠密）的含水DMSO溶液将压低液体层的凝固点，并且将促进溶质DMSO与冰锋的离析。同时，DMSO横越任何细胞膜的传输将得以促进，并且DMSO在抑制细胞间和细胞内冰形成方面的低温防护剂效应可完全地增快，从而防止或基本上减小对生物材料中敏感结构的损害，例如与冰晶生长的剪切应力相关联的细胞膜。DMSO还可提高玻璃温度并且因此允许在比其它情形更高的温度下进行玻璃化。

使用碳水化合物作为CPA（例如糖CPA）可为有利的，因为在这些CPA的溶液中的密度效应特别有利于在冰锋处驱动样品和溶质的重力离析。优选的重质溶质包括卤素的可溶性盐。

在一些实施例中，本发明的方法还可包括在冷却期间搅动低温保存介质，用以辅助溶质扩散进入或离开生物样品材料或者用以使低温保存介质均匀化。样品的搅动可包括对样品的搅拌、摇动或声波处理。

在一些实施例中，本发明的方法可包括以下步骤：在冷却期间将额外的溶质添加到样品中以在冷却期间进一步地提升低温保存介质中CPA的浓度。例如，50％的DMSO水溶液可添加至低温保存介质中，代替对应量的具有较低DMSO浓度的液体低温保存介质（或备选的CPA，或者CPA的混合物）。这种溶质添加可通过单次或多次注入进行，例如，通过注入端口，其中，对应体积的低温保存介质通过引出端口排出或以其它方式取出。备选地，溶质添加可以恒定或可变的速率进行以进一步地改变CPA浓度。附加溶质的多次或连续注入可在液相线追踪型方法中采用，使得CPA的浓度根据降低的样品温度而增加。这种液相线跟踪方法有利地允许高浓度的溶质将降低或消除，该溶质在环境温度下将是有毒的，以在较低温度下作为CPA可能表现出的任何固有毒性效应使用。附加CPA的引入可响应于样品中冰层或样品未冷冻层的温度的降低来编程。因此，冷却可通过预置的冷却算法进行以提供最佳保存的样品。

在一些实施例中，根据本发明的方法可包括在冷冻腔室中施加或减轻压力的步骤。这可避免对于冷冻腔室任何损坏或破裂的风险，其否则可能因在冷冻和冷却时样品的体积变化而发生。压力减轻可经由任何合适的方式实现，例如，通过经由阀（例如，减压阀或注入/排出端口（也即输入/输出端口））或者经由使用活塞布置从冷冻腔室泄放液体，该活塞布置附接至构造成用以在其中维持恒定压力的冷冻腔室。

在一些实施例中，根据本发明的方法包括以下步骤：在瓶（vial）或多个瓶或位于或可拆卸地附接到样品容器的基部上的多孔板中使生物样品玻璃化。在其中将样品瓶或多孔板附接至样品容器基部的方法中，在低温保存过程结束时含有玻璃化样品的瓶或多孔板可被拆卸用于在低温保存过程完成之后储存。

在本发明的方法中样品的温度降低速率选择成用以有利于低温防护剂扩散到生物样品中。允许足够的时间用于在低温下使CPA扩散到生物材料中的非线性冷却曲线（profile）通常是优选的。适当的时间/温度曲线可根据物理参数（例如低温防护剂浓度、样品的扩散系数、样品的尺寸以及CPM在给定温度下的粘度）计算得出。在低温下将会遇到非常高的粘度并且很可能的是，扩散将变得受到生物样品和冷冻浓缩溶液的边界条件的限制并且可进行混合以增加扩散。通常，在根据本发明的方法中，样品的冷却速率相对较慢，并且相比于常规玻璃化方法慢得多，例如在每分钟0.1至2℃之间，并且优选地低于每分钟0.5℃。

本发明还涉及通过本发明的方法低温保存的生物样品，例如活组织检查组织或其它组织、人造组织构建体、蛋白质、抗体，或者细胞。所得样品可经受进一步处理，例如在最终储存之前进行冷冻干燥，并且这可有利地提供冷冻干燥的材料，其优于通过常规方法可获得的那些和/或相比于通过常规方法所获得的那些以更低的成本。

本发明还提供用于实施根据本发明的低温保存方法的设备。

根据本发明的设备包括壳体，该壳体包括腔体和结合在该壳体的顶板中的初级冷却元件。初级冷却元件与腔体的顶表面成热接触，并且优选地基本上或完全地延伸横越腔体的整个上表面。例如，热接触可为金属板跨置壳体中腔体的上表面。在一些实施例中，壳体可具有杯的大体外形（也即，具有底板和自其向上突出的壁），其提供有封盖（顶板），其中，封盖包括冷却元件。杯的形状将确定是否存在单个壁（例如，弯曲的壁）或者多个壁。

设备的初级冷却元件经由样品的最上表面从样品移除热能，从而冷却放置在腔体内的生物样品的最上表面并且因此促使冰层形成在该表面上。在一些实施例中，初级冷却元件可为主动冷却元件，例如热泵，例如斯特林（Stirling））发动机。在一些实施例中，从位于腔体中的生物样品的顶表面提取的热可传导至诸如液氮的材料中的相变并且被其吸收，由此冷却生物样品的最上表面并且促使冰形成在其上。在一些实施例中，中心杆或永久地或磁性地连接至初级冷却元件以诱发成核，允许用于冰的表面向下生长远离样品容器的边缘，以及用以遍及样品使温度均匀化。

冷却还可经由可商购获得的冷却循环浴系统提供，在其中使用冷液体从压缩冷却器提供冷却。此外，可采用珀耳帖（Peltier）发动机系统。

低温保存介质中的生物材料样品可通过打开提供在壳体中（也即在壳体的顶板、底板或壁（多个）中）的加载门而直接地引入到腔体中。备选地，低温保存介质中的生物材料样品可容纳在容器中（也即在样品容器中），并且样品容器可经由提供在壳体中的加载门引入到腔体中。在一些实施例中，加载门可跨置顶板或底板的整个区域。

在其中将样品直接地引入到腔体中的实施例中，腔体形成为用以防止在低温保存期间液体从样品中任何不希望的溢出或进入。在其中将样品引入样品容器中的实施例中，样品容器或任选地其一部分可在低温保存结束时方便地从腔体中移除以便长期储存。

壳体优选地是绝缘的，用以允许在低温保存期间有效地冷却样品以及用以允许低温产生在样品中。使用未绝缘的壳体将需要相对较高功率的冷却元件并且将损害低温保存过程的效率。

在一些实施例中，壳体包括一个或多个传感器，该传感器构造成用以提供关于在低温保存过程期间位于腔体中的样品物理状况的读数。例如，可存在一个或多个热电偶传感器以允许监测沿着样品的垂直轴线的一个或多个点处的温度。从一个或多个传感器所获得的温度读数可用来监测冰锋沿样品向下的进展，或者用以确定在冰锋下方的样品部分是否已发生玻璃化。作为另一实例，光源和光传感器的组合可用来监测冰锋的建立及其在样品中的位置。作为另一实例，用以检测样品的电导率或电阻率变化的传感器可用来提供信息，例如关于随着低温保存过程的进行而在样品的液体部分中的溶质的浓度。作为又一实例，传感器可为压力传感器并且可用来感测样品或壳体内的压力变化。

在其中样品将提供在（也即引入和容纳在）位于腔体内的容器中的实施例中，壳体可附加地或备选地展现一个或多个导电触点以与位于容器内的传感器接触。位于容器内的传感器可为否则在没有容器的情况下将在壳体中使用的类型（例如，热电偶、光传感器、电极或压力传感器）。例如，样品容器可提供有能够获得电导率或电阻率读数的电极，或者可提供有允许确定容器中样品的温度的热电偶。

在一些实施例中，设备包括连接至壳体的活塞，该活塞构造成用以确保在低温保存过程期间样品内的稳定压力和/或用以补偿由于样品内温度和相的变化而引起的任何体积变化。在其中设备包括活塞的实施例中，活塞可方便地位于壳体的顶板或底板上。例如，活塞可构造成用以响应于样品内的压力变化而促使顶板或其一部分远离或朝向壳体的底板移动，由此将壳体中的压力恢复至其初始值。活塞也可用来将样品置于在低温保存过程开始时的增大压力下，或者通过施加偏置力来确保壳体顶板中的冷却元件与在壳体中位于腔体内的样品之间的良好热接触。其它合适的偏置器件可施加用以平衡压力或用以确保在样品（例如，样品容器中的样品）与初级冷却元件之间的良好热接触。

在一些优选的实施方式中，壳体可提供有输入和/或输出端口，以允许添加或移除来例如自腔体或位于其中的样品容器的液体。这些输入和/或输出端口可提供成用以允许在低温保存期间将附加的生物材料或CPA输入到样品中，或在低温保存期间移除过量的液体，或者用以允许在低温保存过程期间灌注脉管系统或器官。因此，在一些优选的实施例中，设备将提供有灌注器件，例如泵，用以引入、移除或建立经过提供在样品中的器官或其脉管系统的无菌灌注液流。输入和输出端口优选地配备有阀或旋塞（tap），用以控制物质进入腔体或位于其中的样品容器中的输入或输出的速率。

在其中样品存在于样品容器中的情况下，样品容器上的输入和/或输出端口可与根据本发明的设备中的互补液体输入/输出端口可密封地接合。用语“可密封地接合”是指样品容器和设备的输入/输出端口以这样的方式接合，也即流体可流动到样品容器中而没有不希望的泄漏。例如，容器上的输入/输出端口可通过推动配合连接而与容器上的对应输入/输出端口接合。

根据本发明的设备可提供有控制单元和泵单元，使得在低温保存过程期间引入附加CPA到样品中可响应于来自传感器例如热电偶的读数而自动地引发，该传感器位于腔体中，例如在位于其中的样品容器中。液相线跟踪的过程因此可通过来自腔体（也即冷冻腔室）和/或样品容器中的一个或多个传感器的反馈来进行。如将认识到的那样，中央控制单元可执行多种控制功能，例如，可控制由初级和（如果存在的话）次级冷却元件所提供的冷却，以及将任何附加低温防护剂引入至样品未冷冻部分的速率和定时。控制单元可包括处理器用以处理从传感器接收的信号、存储元件用以储存用于玻璃化协议的程序和算法，例如取决于初始CPA浓度/多个浓度或样品的性质。

腔体或用于定位在其中的样品容器可包括平台，例如液体可渗透平台，例如膜或网，用以根据样品提供在其中的方式将生物样品保持在腔体或样品容器的底板上方。例如，在其中生物材料悬浮在低温保存介质中的情况下，这可允许移除低温保存介质而不移除生物材料，并且这在例如液相线追踪低温保存方法中可是有利的。此外，该平台确保生物材料远离（或不接近）腔体或样品容器的基部并且因此确保生物材料被封装在低温保存介质的玻璃化基质内。

在一些实施例中，设备提供有搅动器件用以使位于其中的样品中的液体浓度均匀化，和/或用以辅助溶质扩散进入或离开位于其中的样品中的生物材料。搅动器件可为搅拌器，或者为机械或磁性搅拌器，或者为振动板，或者为声波搅动器件，例如超声波源。在其中存在磁性搅拌器的情况下，在腔体或样品容器中将存在磁性从动件，并且在此类实施例中，磁性从动件优选地在腔体或样品容器中位于如上文所述的平台下。

在上文实施例的任一个中，腔体可在其底板或壁上在附接处提供有附接点，用以经由样品容器上的互补附接点实现将样品容器固定在腔体中。类似的附接点也可提供在腔体的顶板中。

在上文实施例的任一个中，设备还可包括次级冷却元件。次级冷却元件布置在壳体中用以将冷却供应至在顶板下方的腔体部分。在使用中，一旦冰层形成在样品的顶表面上，则次级冷却元件冷却样品的未冷冻部分。次级冷却元件可构造成用以一旦获得指示冰层已形成在样品表面上的传感器读数则进行操作。控制单元可提供成用以控制由次级冷却元件所施加的冷却，使得在使用中次级冷却元件将样品的未冷冻部分冷却至温度恰好高于样品顶部处冰层的温度。

根据本发明的设备还可包括加热器件，例如电阻加热元件，其适于解冻由根据本发明的技术所低温保存的样品。

加热器件可一体地形成在低温保存设备的腔体的顶板、底板或壁中。在使用中，加热器件用于将热递送至样品的玻璃化层。在设备中的传感器可提供至控制单元，该控制单元可响应于来自至少一个传感器的读数控制低温保存样品加温所处的速率以最大限度地减小冰形成在样品中的风险。例如，电阻加热元件可一体地形成到腔体的顶板中以便在受控加热样品容器中的低温保存样品中使用。在这种情况下，样品容器可附接至腔体的顶板，使得样品的玻璃化层（也即在玻璃化过程中位于冰锋下方的层）被放置成与腔体的顶板成热接触。对样品的加热然后可以受控的方式进行以提供准备使用或分析的解冻样品。加温元件还可在低温保存期间与冷却系统结合使用以更敏感地控制冷却速率。

为了更好地理解本发明，在下文描述在未负载（图1）和负载操作状态（图2）下用于执行本发明的低温保存方法的设备的实例。如本领域技术人员将认识到的那样，仅以实例的方式提供简单的示意性截面视图而绝非限制本发明的范围。

实例

图1示出在其中可执行根据本发明的低温保存方法的设备1的截面视图。该设备包括壳体10，在该壳体中定位有由壳体的本体14及其顶板16所限定的腔体12。初级冷却元件18，例如冷板，结合在顶板16中并且与腔室成热接触。由冷却元件提供至腔体（例如提供至位于其中的样品）的冷却程度可由控制单元（未示出）控制。在图1中，该装置提供有用于将流体引入或从腔室移除的输入端口20a和输出端口20b，尽管未示出，但这些端口配备有阀以控制流体流通向和离开腔体12或位于其中的容器（未示出）。端口20还可与位于腔体（未示出）内的样品容器可密封地接合，在该腔体中可提供生物样品在低温保存介质中并且在该腔体内可将低温保存样品从腔体移除以便储存。在图1的设备中，存在构造成用以在低温保存期间调控腔体内压力的活塞22。

尽管未示出，但本体14通常是绝缘的，用以避免在玻璃化期间来自腔体的过量热损失，由此允许有效的装置性能。本体14还可提供有次级冷却元件，用以对在顶板区段下方的腔体区段提供冷却。次级冷却元件可为冷却式液体回路、冷却浴或任何其它合适的冷却元件。由次级冷却元件所提供的次级冷却是可控制的，由此允许冰形成并且然后独有地从邻近顶板中初级冷却元件的样品区域向下生长。传感器24和26可提供在腔体中以检测腔体内样品的状态。示例性传感器包括热电偶以提供来自样品的直接温度读数或者耦合至光源的光电二极管以提供关于样品中冰锋向下进展的反馈。

图2为类似设备1的截面图，在其中位于腔体中的未冷冻低温保存介质30中的生物材料的样品正经历低温保存，冰锋32已建立在样品的顶部邻近位于壳体10的顶板16中的初级冷却元件18。在低温保存期间冰生长的方向由箭头34表示。生物样品可作为固体存在，例如保持在可渗透搁板38上的组织样品36。备选地，样品可在溶液中并且可引入瓶40中，该瓶与腔体的基部或与位于腔体内的样品容器（未示出）可密封地接合。入口/出口端口20c提供成用以补充入口端口20a和出口端口20b。

在操作中，将低温保存介质中的生物材料的样品加载到由壳体本体14和顶板16所限定的腔体中，任选地在样品容器内，该样品容器定形成用以提供与位于顶板16中的初级冷却元件18和位于壳体10的壁或基部中的任何次级冷却元件的良好热接触。对样品的冷却首先由初级冷却元件18提供，致使冰锋32在样品的顶部处发展。溶质（也即CPA）和样品从冰锋32去除并且由于在冰下方富含冰的溶质的密度的增加而在重力下朝向壳体的基部掉落。

一旦在样品的顶部处建立冰锋32，则可激活经由位于壳体10的壁或底板中的次级冷却元件的次级冷却，并且次级冷却受到控制以将位于冰锋32下方的样品30的部分冷却至温度略高于冰锋32的温度。由冷却元件所提供的冷却由控制单元控制，并且可响应来自位于腔体壁上或在位于腔体中的样品容器（如果有的话）中的传感器的反馈进行调控。冷却进行直至冰锋32下方的未冷冻层30的温度下降低于残余的未冷冻低温保存介质的玻璃化转变温度，当继续冷却时该层玻璃化（也即固化为玻璃）而不是冻结。输入/输出端口20a、20b、20c允许以分步和渐进的方式引入附加的低温防护剂，由此允许施行实用液相线追踪低温保存技术。玻璃化的生物样品可位于可渗透搁板38（如果存在的话）上或在样品基部处的瓶40中。

图3示出导热部件的优选实施例，在该情况下，呈用于遍及培养介质（或培养基）传导热和均质化温度的中心杆31的形式。中心杆31通过使用套环31a热连接至斯特林发动机或其它冷却源。这种套环可由诸如烧结金属的半导体材料构成，该材料潜在地包括光滑的覆盖物（covering）以帮助清洁和用于冰成核。中心杆的芯部31c由导热材料例如铝或铝合金构成。在优选的实施例中，沿芯部31c间歇地具有绝缘体（insulation）31b以确保在杆的离散梯级处相等的传导。在其它实施例中，具有变化厚度的连续绝缘材料可用来实现在样品上的类似影响。

图4示出另一实施例，其示出设备1'，该设备为上文所述设备1的改进形式，其中，中心杆31部署在样品腔体34内，该样品腔体继而保持在壳体37中，该壳体包括热绝缘体33，例如真空或部分真空。中心杆连接至斯特林发动机22或其它冷却源，并且放置在样品腔体34中。腔体填充或部分地填充有低温保存介质35。生物材料36放置或保持在该介质的基部处，并且当冷却主要地经由杆31开始时，在基部处围绕生物材料的液体将初始地保持在液态，并且可参照图1和图2如上文所述那样是可操作的。

将应理解，上文描述和例示的仅是本发明的实例并且在不脱离文中所限定的本发明的范围的情况下对那些实例的各种改进、修正、变型和省略都是可能的，本发明的技术特征被主张。

Claims (28)

1.一种用于在低温保存介质中低温保存包括生物材料的初始液体样品的方法，所述方法包括以下步骤：冷却所述样品的顶表面以在所述样品的顶表面处选择性地形成冰层。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括另一步骤，也即冷却所述样品以在所述顶表面处从所述冰层逐渐地向下朝向生物材料的基部提供冰的形成，所述生物材料基本上定位或浓缩在所述基部处。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，持续施加对所述样品的顶表面的冷却，直至所述样品在所述冰层下方的层凝固为玻璃，例如用以形成玻璃化层或无定形固体层作为冷却低于玻璃化转变温度的结果。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：将所述样品在所述冰层下方的层冷却至温度恰好高于所述冰层的温度，例如高于所述冰层的温度少于5℃的温度。

5.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述低温保存介质为包含至少一种低温防护剂的水溶液，所述至少一种低温防护剂选自以下各项：二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、C₁-C₃醇、1,2-异丙二醇、1,2-丙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、葡萄糖、单糖、二糖(例如蔗糖、海藻糖和乳糖)、多糖(例如棉子糖和葡聚糖)、聚蔗糖、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮。

6.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述低温保存介质包括DMSO、或者糖、或者DMSO与糖的组合。

7.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：在所述样品的顶表面上的冰锋已形成之后，将附加的低温防护剂添加至所述样品在所述冰层下方的层。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，根据所述冰层或在所述冰层下方的样品液体的温度降低以渐进的方式添加所述附加的低温防护剂。

9.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，在冷却期间对所述样品施加机械搅动。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过经由以导热部件的形式位于所述样品中的冷却元件的热传导来提供冷却。

11.一种用于执行根据任一前述权利要求所述的低温保存方法的低温保存设备(1)。

12.根据权利要求11所述的设备，其特征在于，所述设备包括壳体(10，37)，所述壳体包括腔体(12，34)和初级冷却元件(18)，所述初级冷却元件结合在所述壳体位于所述腔体上方的顶板(16)中。

13.根据权利要求11所述的设备，其特征在于，所述壳体例如通过真空或部分真空(33)被绝缘。

14.根据权利要求11至13中任一项的所述的设备，进一步地其特征在于，由所述初级冷却元件所提供的冷却的程度能由控制单元人工地或自动地控制。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的设备，其特征在于，所述设备还包括至少一个传感器(24，26)，所述至少一个传感器适于提供位于所述腔体中的样品的物理状况的信号特性。

16.根据权利要求15所述的设备，其特征在于，适于提供位于所述腔体中的样品的物理状况的信号特性的所述至少一个传感器电连接至控制单元，任选地其中，所述信号指示在位于所述腔体中的样品中存在冰层，或者位于所述腔体中的样品的温度。

17.根据权利要求12或从属于权利要求12的权利要求所述的设备，其特征在于，所述腔体包括一个或多个液体入口端口和/或出口端口(20a，20b)。

18.根据权利要求17所述的设备，其特征在于，所述设备包括构造成用以将流体供应至入口端口或从出口端口汲取流体的泵。

19.根据权利要求18所述的设备，其特征在于，通向入口端口或离开出口端口的流体流响应于从位于所述腔体中的传感器所接收的信号由控制单元控制。

20.根据权利要求11至19中任一项所述的设备，其特征在于，所述设备包括用于机械地搅动位于所述腔体内的任何样品的器件。

21.根据权利要求11至20中任一项所述的设备，其特征在于，所述设备包括次级冷却元件，所述次级冷却元件适于冷却所述腔体的壁或底部的区段。

22.一种低温保存样品，其通过根据权利要求1至10中任一项所述的方法获得，或者利用根据权利要求11至20中任一项所述的设备产生。

23.根据权利要求21所述的低温保存样品，其特征在于，在所述样品中的是组织样品，例如活组织检查组织、器官或组织构建体。

24.一种样品容器，其用于在根据权利要求11至20中任一项所述的设备中的低温保存中使用。

25.根据前述权利要求11至20中任一项所述的设备，其特征在于，所述设备还包括定位成用以与所述腔体中的样品液体接触的至少一个冷却部件(31)，所述部件布置成用以使所述样品内的热梯度均匀化。

26.根据权利要求24所述的设备，其特征在于，所述部件包括由一个或多个离散的材料带围绕的导热材料的至少一个杆，所述材料带相比于所述杆具有较小的导热性。

27.根据权利要求25所述的设备，其特征在于，使用多个杆。

28.根据前述方法权利要求1至10中任一项的方法，其特征在于，具有密度>2g/cm³、在4℃下溶解度>0.5g/cml水的溶质或溶质的组合在浓度>5％w/v的情况下使用。

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