CN104026118A - 一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用，该免疫细胞冻存液包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。具体地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10%二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基。本发明的免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性；能够有效的保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性的稳定性，可直接应用于临床治疗，本发明适用于人单个核细胞及其它各类免疫细胞的长期冷冻储存。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保存技术领域，尤其涉及一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用。
背景技术
对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义，尤其是免疫细胞用于回顾性研究时更为重要。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时间较长，需要多次诱导和患者多次采血的问题，还可以把人健康状态最好战斗力最强时期的免疫细胞保存下来，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。
影响免疫细胞冻存和复苏活性的主要因素包括冷冻及复苏的方式和冷冻剂的选择。造成细胞损伤的两种因素一种是细胞内冰晶形成和重结晶，一般是由不适当的降温和复温导致；另一种是溶质损伤，一般是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所致。免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。冷冻保护剂可以避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。细胞冻存常用渗透性保护剂，有甘油和二甲基亚砜（DMSO）两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，DMSO可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。目前国内冻存方法多采用的是DMSO、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的冻存液，优点是细胞保存时间长，缺点是冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用，该免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响；本发明的免疫细胞冻存液能够有效的保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供一种免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。
本发明的免疫细胞冻存液用人供体血浆代替动物血清，不但避免了引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性；而且用人供体血浆保存供体自身的免疫细胞，比用动物血清保存人免疫细胞能够更好地保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
本发明的免疫细胞冻存液并不排除其它成分的存在，比如生理盐水等。
优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10%二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基。
本发明的免疫细胞冻存液按体积百分比二甲基亚砜的含量比如可以是5%、6%、7%、8%、9%或10%等，优选10%。
本发明的免疫细胞冻存液按体积百分比人供体血浆的含量比如可以是10%、12%、15%、20%、24%、28%、32%、40%、50%、60%、70%、80%、85%或89%等，优选10%。
本发明的免疫细胞冻存液按体积百分比免疫细胞基础培养基的含量比如可以是0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%等，优选80%。
更优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比由5-10%二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基组成，即仅含有上述体积百分比的三种成分。
进一步优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10%二甲基亚砜、10-40%人供体血浆和50-80%免疫细胞基础培养基。
更进一步优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含10%二甲基亚砜、10%人供体血浆和80%免疫细胞基础培养基。
本发明的免疫细胞冻存液中，所述免疫细胞基础培养基选自opTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion SFM培养基或RPMI-1640培养基，可购自美国GIBCO公司。
在第二方面，本发明提供如第一方面所述的免疫细胞冻存液的制备方法，所述方法包括将所述二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基混合的步骤。
本发明对制备人供体血浆的方法不限，比如可以通过如下方法制备：将抗凝外周血于2000-2500rpm离心15-20min，吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃保持30min，然后2000-2500rpm离心5-10min，取上清，即自体血浆，4℃保存备用。
因此本发明免疫细胞冻存液的一个优选的制备方法包括：
（1）制备人供体血浆；例如，可以通过将抗凝外周血离心，吸取上层血浆，52-60℃、优选56℃水浴上层血浆25-35min、优选30min，然后离心弃沉淀的过程制备人供体血浆；和
（2）将所述二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基按配比混合，得到所述免疫细胞冻存液。
在第三方面，本发明提供一种免疫细胞的冻存方法，包括：
（a）将免疫细胞悬浮于如第一方面所述的免疫细胞冻存液；和
（b）进行程控降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
本发明程控降温的程序不限，比如可以是：第一步：4℃，等待；第二步：以1.0℃/分钟降至-3.0℃；第三步：以10.0℃/分钟降至-20.0℃；第四步：以1.0℃/分钟降至-40.0℃；第五步：以10.0℃/分钟降至-80.0℃。
在第三方面，本发明提供如第一方面所述的免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。
优选地，所述免疫细胞为外周血单个核细胞，更优选自然杀伤细胞。
本发明的有益效果为：
本发明的免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响；本发明的免疫细胞冻存液能够有效的保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，免疫细胞复苏后的活性达到90%，细胞生物学特性不发生变化，可应用于临床治疗，本发明适用于人单个核细胞及其它各类免疫细胞的长期冷冻储存。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实验材料及其来源：
1、实验环境：GMP实验室里的生物安全柜中操作。
2、试剂：opTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion SFM培养基（GIBCO，美国）、RPMI-1640培养基（GIBCO，美国）、SCGM培养基（Sigma公司）、GT-T551培养基（宝生物工程（大连）有限公司）、人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）、胎牛血清（GIBCO，美国）、二甲基亚砜DMSO（WAK，德国）、肝素钠盐溶液（上海第一生化药业有限公司）、生理盐水（杭州民生药业）、L-谷氨酰胺（GIBCO，美国）、注射用甘露聚糖肽、抗人CD16单抗、白细胞介素2。
3、器材：离心机（THERMO，美国）、T175培养瓶（NUNC，丹麦）、GT-A610培养袋（TAKARA，日本）、CO2培养箱（三洋，中国）、程控降温仪（THERMO，美国）、生物安全柜（力康生物医疗科技控股有限公司，香港）、50ml离心管（BD，美国）。
实施例1：制备人供体血浆
（1）抽血：选两名志愿者（A和B），分别用50ml注射器抽取50ml外周血，肝素抗凝（也可以采用柠檬酸钠或EDTA等其它抗凝方式）。
（2）取少量外周血进行梅毒螺旋体、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒和EB病毒等特异性病毒检测，均为阴性（表1），证明两志愿者均为不携带上述病菌或病毒的健康个体。
表1志愿者血液检测结果
| 项目 | 志愿者A | 志愿者B | 检测标准 |
| 梅毒螺旋体 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 巨细胞病毒 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 乙型肝炎病毒 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 丙型肝炎病毒 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 艾滋病毒 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| EB病毒等特异性病毒 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
（3）制备供体血浆：将50ml抗凝外周血平均转移至两个50ml离心管中，2500rpm，离心15min；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min，然后2500rpm，离心5min，取上清并4℃保存备用。
实施例2：制备免疫细胞冻存液1（胎牛血清+DMSO+RPMI-1640培养基）
按体积百分比，将10%的胎牛血清与10%的DMSO和80%的RPMI-1640培养基混匀，制得免疫细胞冻存液1，于4℃保存备用。
实施例3：制备免疫细胞冻存液2（供体血浆+DMSO+RPMI-1640培养基）
按体积百分比，将10%的供体血浆与10%的DMSO和80%的RPMI-1640培养基混匀，制得免疫细胞冻存液2，于4℃保存备用。
实施例4：制备免疫细胞冻存液3（供体血浆+DMSO+opTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion SFM培养基）
按体积百分比，将10%的供体血浆与10%的DMSO和80%的opTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion SFM培养基混匀，制得免疫细胞冻存液3，于4℃保存备用。
实施例5：扩增自然杀伤细胞
（1）取制备供体血浆时离心后的下部细胞成分，加生理盐水至原体积，混匀后成45°缓慢铺到2个预先加入了20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，保持界面清晰无相互渗透，离心机升降速均调至最低，室温700g，离心15min。
（2）离心完毕取中间白膜层细胞，转移至50ml离心管中，加入生理盐水定容至50ml混匀，2000rpm离心8min，弃上清。加入5ml生理盐水，重悬细胞沉淀，然后定容至50ml，1500rpm离心8min。
（3）用不含自体血浆的opTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion SFM培养基（含10μg/mL甘露聚糖肽、700IU/mL白细胞介素2、10ng/mL抗人CD16单抗和0.5%的L-谷氨酰胺）重悬细胞，接种到预先加入45ml opTmizerTMCTSTMT-CellExpansion SFM培养基（含10μg/mL甘露聚糖肽、700IU/mL白细胞介素2、10ng/mL抗人CD16单抗和0.5%的L-谷氨酰胺）的T175培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5.0%CO2培养箱中培养1.5-2小时。
（4）轻轻吹打培养瓶中的贴壁细胞，连同未贴壁细胞一并转移至新的T175培养瓶中，并添加10%自体血浆，预先置于饱和湿度、38℃、5.0%CO2培养箱中培养20小时，然后转移至37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养。
（5）培养第3天进行第一次扩增，加入50mlopTmizerTMCTSTMT-CellExpansion SFM扩增培养基（含10μg/mL甘露聚糖肽、700IU/mL白细胞介素2和0.5%的L-谷氨酰胺）继续培养，并补加8%的自体血浆。
（6）根据细胞生长情况每3天进行一次传代并补加1%自体血浆。
（7）分别在培养的第7天、第15天以及第20天检测细菌、真菌、内毒素和支原体等微生物，结果如表2所示，证明培养的细胞未被污染。
表2NK细胞培养过程中检测结果及检测标准
（8）培养至第20天，安全检测合格的NK细胞收获。
（9）计算扩增倍数，并通过流式细胞技术检测，如表3所示，证明细胞扩增量大，NK细胞扩增效率高。
表3细胞扩增结果及流式细胞技术检测结果
| 接种细胞量 | 收获细胞量 | 扩增倍数 | NK细胞流式检测结果* | |
| 志愿者A | 3×107 | 6×109 | 700-1000 | 54% |
| 志愿者B | 3×107 | 6×109 | 700-1000 | 57% |
*NK细胞流式检测结果表示CD3-CD16+CD56+表型的NK细胞在体系中所占的百分比。接种细胞量是指中间白膜层细胞（单个核细胞）的接种量，收获细胞量是指培养出来的细胞的总量，扩增倍数是指NK细胞的扩增倍数。
（10）将上述扩增的NK细胞分别以1×107/ml的浓度重悬于冻存液1、2和3中。进行程控降温至-80℃，程控降温的程序是：第一步：4℃，等待；第二步：以1.0℃/分钟降至-3.0℃；第三步：以10.0℃/分钟降至-20.0℃；第四步：以1.0℃/分钟降至-40.0℃；第五步：以10.0℃/分钟降至-80.0℃。然后转移至液氮中冷冻保存。分别于一个月、三个月和一年后复苏检测，结果分别如表4-9所示。
表4冷冻一个月的细胞复苏检测结果
| 检测项目 | 检测结果 | 检测标准 |
| 可见异物 | 检测未发现 | 不得检出可见异物 |
| 细菌、真菌 | 检测未发现 | 不得检出真菌、细菌 |
| 细菌内毒素 | 检测未发现 | 内毒素含量不高于0.5EU/ml |
| 支原体 | 检测未发现 | 不得检出人型支原体、解脲支原体 |
| 细胞活性检测 | 90%以上 | 细胞活性高于85% |
表5冷冻一个月的细胞复苏台盼蓝染色检测细胞活性结果
表6冷冻三个月的细胞复苏检测结果
| 检测项目 | 检测结果 | 检测标准 |
| 可见异物 | 检测未发现 | 不得检出可见异物 |
| 细菌、真菌 | 检测未发现 | 不得检出真菌、细菌 |
| 细菌内毒素 | 检测未发现 | 内毒素含量不高于0.5EU/ml |
| 支原体 | 检测未发现 | 不得检出人型支原体、解脲支原体 |
| 细胞活性检测 | 90%以上 | 细胞活性高于85% |
表7冷冻三个月的细胞复苏台盼蓝染色检测细胞活性结果
表8冷冻一年的细胞复苏检测结果
| 检测项目 | 检测结果 | 检测标准 |
| 可见异物 | 检测未发现 | 不得检出可见异物 |
| 细菌、真菌 | 检测未发现 | 不得检出真菌、细菌 |
| 细菌内毒素 | 检测未发现 | 内毒素含量不高于0.5EU/ml |
| 支原体 | 检测未发现 | 不得检出人型支原体、解脲支原体 |
| 细胞活性检测 | 90%以上 | 细胞活性高于85% |
表9冷冻一年的细胞复苏台盼蓝染色检测细胞活性结果
由上述结果可以看出：使用冻存液1、2、3冻存一个月、三个月和一年后复苏的NK细胞均没有可见异物、细菌、真菌、细菌内毒素、支原体的污染，并且复苏后的活性均在90%以上，其中冻存液3（供体血浆+DMSO+opTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion SFM培养基）保存的NK细胞复苏后的活性高于冻存液1（胎牛血清+DMSO+RPMI-1640培养基）和冻存液2（供体血浆+DMSO+RPMI-1640培养基）。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10%二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基。
3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液按体积百分比由5-10%二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基组成。
4.根据权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10%二甲基亚砜、10-40%人供体血浆和50-80%免疫细胞基础培养基。
5.根据权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含10%二甲基亚砜、10%人供体血浆和80%免疫细胞基础培养基。
6.根据权利要求1-5任一项所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞基础培养基选自opTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion SFM培养基或RPMI-1640培养基。
7.如权利要求1-6任一项所述的免疫细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述方法包括将所述二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基混合的步骤。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）制备人供体血浆；
优选地，通过将抗凝外周血离心，吸取上层血浆，52-60℃、优选56℃水浴上层血浆25-35min、优选30min，然后离心弃沉淀的过程制备人供体血浆；和
（2）将所述二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基按配比混合，得到所述免疫细胞冻存液。
9.一种免疫细胞的冻存方法，其特征在于，包括：
（a）将免疫细胞悬浮于权利要求1-6任一项所述的免疫细胞冻存液；和
（b）进行程控降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
10.如权利要求1-6任一项所述的免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用；
优选地，所述免疫细胞为外周血单个核细胞，更优选自然杀伤细胞。
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