CN105420191A - 一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法 - Google Patents
一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种临床用脐血单核细胞的制备方法，包括如下步骤：取适量分离获得的脐带血，置于脐血保存袋中冷藏保存；进行脐血单核分离处理，获得脐血单核细胞，进行冷冻处理；冷冻细胞复苏后用生理盐水洗涤，后再次计数和活率，并留样进行内毒素和细菌检测，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用。冷冻过程中采用脐血本身血浆作为冻存防护剂，可以避免其他动物源蛋白的影响，更符合临床标准。该方法从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级监控，以实现脐血单核细胞的临床标准产品。
Description
技术领域
本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法。
背景技术
干细胞(StemCells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。
婴儿出生后遗留在胎盘和脐带中的血是干细胞的重要来源。脐带血中的造血干细胞可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤(如：急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合症和淋巴瘤等)、血红蛋白病(如：海洋性贫血)、骨髓造血功能衰竭(如：再生障碍性贫血)、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患、某些实体肿瘤(如：小细胞肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌和进行性肌营养不良等)。自1988年脐血干细胞就用来治疗根达综合症、亨达综合症、和拉综合症和急性淋巴细胞性白血病等许多儿童疾病。截至2011年，脐带血不仅已能有效地治疗几十种难治性疾病和多种不治之症，而且它所能治疗的疾病种类还在不断地增加。自体储存的脐带血一旦需要使用时，不需配型，细胞活性强，无免疫排斥的危险，移植成活率高，治愈率高，医疗费用低。
在人脐血中有一类具有干细胞特征的细胞群体，被称为人间充质干细胞(MSCs)。人间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在不同诱导条件下可分化为三胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经细胞等。此外，还表达IL6、G-CSF和SCF等多种造血细胞生长所需要的因子，能够维持长期培养的造血祖细胞增殖，显示MSC具有支持造血和促进造血恢复的作用。同时研究表明MSC具有免疫调节作用，在体外能够抑制T淋巴细胞增殖，体内动物实验发现MSCs移植可以抑制异体免疫反应，减轻移植相关的排斥反应，并延长异体移植物的存活时间。最近的临床试验发现MSCs联合造血干细胞移植可以减轻GVHD并降低移植失败率。MSC的多向分化能力和免疫调节能力决定了其在细胞治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。
目前常规脐血单核细胞(富含造血干细胞)多用动物血清加白蛋白冻存，如鸡、猪、牛等，其中胎牛血清因获取量大、污染轻而被广泛应用。但近年随着人畜共患病发病率的增加，以异种血清培养的组织向临床应用的安全性受到质疑，因此自体血清培养越来越受到重视。
中国发明专利申请号：201510159307.0公开了一种脐血单个核细胞冻存液、应用、制备方法。本发明提供的一种脐血单个核细胞冻存液，包括二甲基亚砜(DMSO)联合勃脉力A(复方电解质注射液)、羟乙基淀粉(HES)，该方案相比传统配方，可避免动物源性病原体的污染，同时避免采用细胞培养基作为冻存液组成成分，并保证了良好的细胞冻存效果，冻存2个月后，用本发明冻存液冻存的CBMC复苏后细胞活率平均值为94.73％，显著(P＜0.05)高于用传统冻存液(10％DMSO+90％FBS)的冻存效果。细胞复苏后可直接进行临床移植，在细胞治疗临床应用方面颇具实用价值。
中国发明专利申请号：02103676.4公开了脐血造血干细胞的制作方法,按如下步序进行:(1)采集脐血,将出生的胎儿的脐血采到脐血采集袋内；(2)加入红细胞沉淀剂；(3)离心分离1,将脐血采集袋中脐血中的红细胞分离；(4)移出红细胞,将红细胞输送到红细胞收集袋内；(5)离心分离2,将白细胞包括造血干细胞与血浆再一次分离；(6)移出血浆,将被分离的血浆输入到血浆收集袋内,脐血收集袋内剩余的脐血为含富集白细胞的脐血；(7)加入冷冻剂,将脐血收集袋中的富集白细胞脐血中加入冷冻剂；(8)包装；(9)降温；(10)入库保存。用本发明方法制作的造血干细胞可长期存放,以便于随时取用,大大地方便了治疗,及时解除病人痛苦,适用于制作在脐血库中长期存放的造血干细胞。
但目前公开的各类间充质干细胞制备方法虽均能获得脐血单核细胞(富含造血干细胞)，但都不符合临床应用的标准，本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现脐血单核细胞(富含造血干细胞)的临床标准产品。
发明内容
针对现有技术缺陷，本发明提供一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，本发明制备方法在脐带采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者作为采集目标，之后进行分离直接进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用，活率无明显降低。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤A，取适量分娩获得的脐带血，置于脐血保存袋中冷藏保存；
步骤B,脐血分离：将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出我们要的单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血浆；采用高温消毒灭菌的超纯水去除红细胞，可以避免回输时红细胞引起的负面作用。
步骤C,脐血有核冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管进行冷冻保存；并将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5×106细胞做细胞表面标志检测；
步骤D,脐血单核细胞成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养；
步骤E,临床用脐血单核细胞使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。该冻存细胞复苏后红细胞会全部破碎，可以避免回输时红细胞引起的负面作用。
优选地，步骤A中，所述分离获得的脐带通过筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带获得，所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等。
优选地，步骤A中，所述脐血保存袋只有标准量的血液抗凝剂，不含有血清培养基，不含抗生素。可维持脐血活性长达24小时，避免了临床应用时的抗生素过敏问题。
优选地，步骤A中，所述脐带置于脐血保存袋中4℃冷藏保存，并在24小时内进行分离处理。
优选地，步骤B中，所述两步离心法采用医用级别淋巴分离液。所述分离液成分明确，符合临床级别。
优选地，步骤C中，所述冷冻处理采用的细胞冷冻保护液由90％血浆和10％的二甲基亚砜(体积百分比)配制而成，保护细胞活性。所述血浆为自体血浆。我们采用脐血本身血浆作为冻存防护剂，可以避免其他动物源蛋白的影响，更符合临床标准。
优选地，步骤C中，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
本发明完全没有使用外援蛋白质进行细胞处理。以及冷冻保护也用自体血浆，避免不明动物源蛋白进入人体引起的潜在风险。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、全过程全面质量监控，从脐带采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控。
2、无其他动物血清蛋白质等，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏风险。
3、剔除所有红细胞避免了回输时红细胞引起的负面作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种临床用脐血单核细胞(富含造血干细胞)的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、脐血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带(样本1)，置于脐血保存袋中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；
步骤二、脐血分离：将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出我们要的单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血浆。
步骤三、脐血有核冻存：收集细胞并计数和活率(细胞仪计数)，细胞计数结果如表1所示，按3×107/ml/管进行冷冻保存，采用90％的血浆和10％的中二甲基亚砜作为冷冻保护剂；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5×106细胞做细胞表面标志检测，检测结果如表2所示。
步骤四、脐血单核细胞(富含造血干细胞)成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养。细胞CD34表达和CFU集落形成结果如表3所示。
步骤五、临床用脐血单核细胞(富含造血干细胞)使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。复苏后的细菌、内毒素检测以及细胞数和活率结果如表4所示。
表1冷冻前细胞计数仪计数结果
表2冻存前细胞无菌检测、支原体检测及细胞表面标志检测结果
| 检测指标 | 无菌检测 | 支原体检测 | CD34/CD45的百分率 | CFU-集落数 |
| 样本1 | 合格 | 合格 | 0.90％ | 61个/105 |
表3细胞CD34表达和CFU集落形成结果
| 检测指标 | CD34/CD45的百分率 | CFU-集落数 |
| 样本1 | 0.95％ | 56个/105 |
表4复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞数和活率
从表1和4的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的细胞总数(10.8×107)和活率(95％)无明显下降。
实施例2
本实施例提供一种临床用脐血单核细胞(富含造血干细胞)的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、脐血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带(样本2)，置于脐血保存袋中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；
步骤二、脐血分离：将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出我们要的单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血浆。
步骤三、脐血有核冻存：收集细胞并计数和活率(细胞仪计数)，细胞计数结果如表5所示，按3×107/ml/管进行冷冻保存，采用90％的血浆和10％的中二甲基亚砜作为冷冻保护剂；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5×106细胞做细胞表面标志检测，检测结果如表6所示。
步骤四、脐血单核细胞(富含造血干细胞)成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养。细胞CD34表达和CFU集落形成结果如表7所示。
步骤五、临床用脐血单核细胞(富含造血干细胞)使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。复苏后的细菌、内毒素检测以及细胞数和活率结果如表8所示。
表5冷冻前细胞计数仪计数结果
表6冻存前细胞无菌检测、支原体检测及细胞表面标志检测结果
| 样本编号 | 无菌检测 | 支原体检测 | CD34/CD45的百分率 | CFU-集落数 |
| 样本2 | 合格 | 合格 | 0.87％ | 65个/105 |
表7细胞CD34表达和CFU集落形成结果
| 检测指标 | CD34阳性率 | CFU-集落数 |
| 检测结果 | 0.9％ | 62个/105 |
表8复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞总数和活率
从表5和8的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的细胞总数(14.13×107)和活率(95％)无明显下降。
实施例3
本实施例提供一种临床用脐血单核细胞(富含造血干细胞)的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、脐血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带(样本3)，置于脐血保存袋中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；
步骤二、脐血分离：将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出我们要的单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血浆。
步骤三、脐血有核冻存：收集细胞并计数和活率(细胞仪计数)，细胞计数结果如表9所示，按3×107/ml/管进行冷冻保存，采用90％的血浆和10％的中二甲基亚砜作为冷冻保护剂；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5×106细胞做细胞表面标志检测，其结果如表10所示。
步骤四、脐血单核细胞(富含造血干细胞)成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养。细胞CD34表达和CFU集落形成结果如表11所示。
步骤五、临床用脐血单核细胞(富含造血干细胞)使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。复苏后的细菌、内毒素检测以及细胞数和活率结果如表12所示。
表9冷冻前细胞计数仪计数结果
表10冻存前细胞无菌检测、支原体检测及细胞表面标志检测结果
| 样本编号 | 无菌检测 | 支原体检测 | CD34/CD45的百分率 | CFU-集落数 |
| 样本3 | 合格 | 合格 | 1.06％ | 74个/105 |
表11细胞CD34表达和CFU集落形成结果
| 检测指标 | CD34阳性率 | CFU-集落数 |
| 检测结果 | 1.1％ | 70个/105 |
表12复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞总数和活率
从表9和12的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的细胞总数(17.05×107)和活率(96％)无明显下降。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (8)
1.一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤A，取适量分离获得的脐带血，置于脐血保存袋中冷藏保存；
步骤B,脐血分离：将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出所需单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血浆；
步骤C,脐血有核冻存：收集细胞并计数和活率，进行冷冻保存；并将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，做细胞表面标志检测；
步骤D,脐血单核细胞成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养；
步骤E,临床用脐血单核细胞使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
2.如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述分离获得的脐带通过筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带获得，所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。
3.如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述脐血保存袋只含有标准量的血液抗凝剂，不含有血清培养基，不含抗生素。
4.如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述脐带置于脐血保存袋中4℃冷藏保存，并在24小时内进行分离处理。
5.如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述两步离心法采用医用级别淋巴分离液。
6.如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述冷冻处理采用的细胞冷冻保护液由体积百分比为90％的血浆和10％的二甲基亚砜配制而成。
7.如权利要求6所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述血浆为自体血浆。
8.根据权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
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