CN108165531A - 一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法 - Google Patents

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吴闪
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Abstract

本发明公开了一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法，包括如下步骤：取适量分离法获得的脐带血，经过筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史，得到的原代培养物消化下来，在室温为35‑39℃，3‑7％CO2，无菌条件下用培养液进行传代培养，培养4‑5代得到造血干细胞，本发明步骤简单，操作方便，提高造血干细胞的培养效率，安全稳定，适用范围广，可将脐带血单核细胞定向分化培养以及传代培养得到纯度较高的造血干细胞。一方面取材方便，所述脐带血单核细胞可取自采集健康足月产妇志愿者脐带血液，且无数量限制，可避免道德争议。

Description

一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法
技术领域
本发明涉及造血干细胞技术领域，具体为一种造血干细胞用的脐带血单 核细胞培养方法。
背景技术
随着科学技术发展突飞猛进，各种新技术、新发明层出不穷，并被迅速 应用并服务于社会，大大促进了经济的发展，干细胞(StemCells，SC)是一类 具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。 在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体 的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂 成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来 源有很多，包括胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。
在人脐血中有一类具有干细胞特征的细胞群体，被称为人间充质干细胞 (MSCs)。人间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在不同诱导条件 下可分化为三胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经细 胞等。此外，还表达IL6、G-CSF和SCF等多种造血细胞生长所需要的因子， 能够维持长期培养的造血祖细胞增殖，显示MSC具有支持造血和促进造血恢 复的作用。同时研究表明MSC具有免疫调节作用，在体外能够抑制T淋巴细 胞增殖，体内动物实验发现MSCs移植可以抑制异体免疫反应，减轻移植相关 的排斥反应，并延长异体移植物的存活时间。最近的临床试验发现MSCs联合 造血干细胞移植可以减轻GVHD并降低移植失败率。MSC的多向分化能力和免 疫调节能力决定了其在细胞治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。
目前常规脐血单核细胞(富含造血干细胞)多用动物血清加白蛋白冻存， 如鸡、猪、牛等，其中胎牛血清因获取量大、污染轻而被广泛应用。但近年 随着人畜共患病发病率的增加，以异种血清培养的组织向临床应用的安全性 受到质疑，因此自体血清培养越来越受到重视。
发明内容
本发明的目的在于提供一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法， 以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种造血干细胞用的脐带 血单核细胞培养方法，包括如下步骤：
S1、取适量分离法获得的脐带血，经过筛选的检测项目包括携带病毒或 遗传家族史；
S2、通过培养液对脐带血单核细胞进行定向分化培养得到原代培养物；
S3、然后在室温为35-39℃，3-7％CO2，无菌条件下，用培养液对脐带血 单核细胞进行定向分化培养4-6天，移除未贴壁的细胞，定向分化培养期间 每1-2天更换一次培养液；
S4、再用培养液继续培养2-6天得到原代培养物，继续培养期间培养液 1-2天更换一次；
S5、得到的原代培养物消化下来，在室温为35-39℃，3-7％CO2，无菌条 件下用培养液进行传代培养，培养4-5代得到造血干细胞；
S6、统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按需要将细胞和复方电解质 溶液混匀，并留样进行内毒素和细菌检测，即可低温储存。
优选的，所述培养液为体积比为1：0.8-1.2的MEL/F12培养基和腺苷酸 环化酶激活剂，血清都代物，L抗坏血酸，L谷氨院腰衍生物，ALK抑制剂， GSK-3抑制剂。
优选的，所述分离法采用医用级别淋巴分离液或采用Picoll-paque密度 梯度分离法。
优选的，所述分离法获得的脐带血通过筛选、采集健康足月产妇志愿者 脐带获得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的一种造血干细胞 用的脐带血单核细胞培养方法，与传统的培养方法相比，本发明步骤简单， 操作方便，提高造血干细胞的培养效率，安全稳定，适用范围广，可将脐带 血单核细胞定向分化培养以及传代培养得到纯度较高的造血干细胞。一方面 取材方便，所述脐带血单核细胞可取自采集健康足月产妇志愿者脐带血液， 且无数量限制，可避免道德争议；另一方面，与现有的动物模型相比，本发 明培养得到的造血干细胞提供了最接近人体的体外细胞模型，降低了或无免 疫排斥反应。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得 的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法，包括如下步骤：
S1、取适量分离法获得的脐带血，经过筛选的检测项目包括携带病毒或 遗传家族史；
S2、通过培养液对脐带血单核细胞进行定向分化培养得到原代培养物；
S3、然后在室温为35℃，3％CO2，无菌条件下，用培养液对脐带血单核细 胞进行定向分化培养4天，移除未贴壁的细胞，定向分化培养期间每1天更 换一次培养液；
S4、再用培养液继续培养2天得到原代培养物，继续培养期间培养液1 天更换一次；
S5、得到的原代培养物消化下来，在室温为35℃，3％CO2，无菌条件下用 培养液进行传代培养，培养4代得到造血干细胞；
S6、统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按需要将细胞和复方电解质 溶液混匀，并留样进行内毒素和细菌检测，即可低温储存。
具体的，所述培养液为体积比为1：0.8的MEL/F12培养基和腺苷酸环化 酶激活剂，血清都代物，L抗坏血酸，L谷氨院腰衍生物，ALK抑制剂，GSK-3 抑制剂。
具体的，所述分离法采用医用级别淋巴分离液或采用Picoll-paque密度 梯度分离法。
具体的，所述分离法获得的脐带血通过筛选、采集健康足月产妇志愿者 脐带获得。
实施例2
一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法，包括如下步骤：
S1、取适量分离法获得的脐带血，经过筛选的检测项目包括携带病毒或 遗传家族史；
S2、通过培养液对脐带血单核细胞进行定向分化培养得到原代培养物；
S3、然后在室温为37℃，5％CO2，无菌条件下，用培养液对脐带血单核细 胞进行定向分化培养4.5天，移除未贴壁的细胞，定向分化培养期间每1.5 天更换一次培养液；
S4、再用培养液继续培养4天得到原代培养物，继续培养期间培养液1.5 天更换一次；
S5、得到的原代培养物消化下来，在室温为37℃，5％CO2，无菌条件下用 培养液进行传代培养，培养4.5代得到造血干细胞；
S6、统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按需要将细胞和复方电解质 溶液混匀，并留样进行内毒素和细菌检测，即可低温储存。
具体的，所述培养液为体积比为1：1的MEL/F12培养基和腺苷酸环化酶 激活剂，血清都代物，L抗坏血酸，L谷氨院腰衍生物，ALK抑制剂，GSK-3 抑制剂。
具体的，所述分离法采用医用级别淋巴分离液或采用Picoll-paque密度 梯度分离法。
具体的，所述分离法获得的脐带血通过筛选、采集健康足月产妇志愿者 脐带获得。
实施例3
一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法，包括如下步骤：
S1、取适量分离法获得的脐带血，经过筛选的检测项目包括携带病毒或 遗传家族史；
S2、通过培养液对脐带血单核细胞进行定向分化培养得到原代培养物；
S3、然后在室温为39℃，7％CO2，无菌条件下，用培养液对脐带血单核细 胞进行定向分化培养6天，移除未贴壁的细胞，定向分化培养期间每2天更 换一次培养液；
S4、再用培养液继续培养6天得到原代培养物，继续培养期间培养液2 天更换一次；
S5、得到的原代培养物消化下来，在室温为39℃，7％CO2，无菌条件下用 培养液进行传代培养，培养5代得到造血干细胞；
S6、统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按需要将细胞和复方电解质 溶液混匀，并留样进行内毒素和细菌检测，即可低温储存。
具体的，所述培养液为体积比为1：1.2的MEL/F12培养基和腺苷酸环化 酶激活剂，血清都代物，L抗坏血酸，L谷氨院腰衍生物，ALK抑制剂，GSK-3 抑制剂。
具体的，所述分离法采用医用级别淋巴分离液或采用Picoll-paque密度 梯度分离法。
具体的，所述分离法获得的脐带血通过筛选、采集健康足月产妇志愿者 脐带获得。
对于本发明而言，工作原理为：本发明提供的一种造血干细胞用的脐带 血单核细胞培养方法，与传统的培养方法相比，本发明步骤简单，操作方便， 提高造血干细胞的培养效率，安全稳定，适用范围广，可将脐带血单核细胞 定向分化培养以及传代培养得到纯度较高的造血干细胞。一方面取材方便， 所述脐带血单核细胞可取自采集健康足月产妇志愿者脐带血液，且无数量限 制，可避免道德争议；另一方面，与现有的动物模型相比，本发明培养得到 的造血干细胞提供了最接近人体的体外细胞模型，降低了或无免疫排斥反应。
类似地，应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个发明方面中的一个 或多个，在上面对本发明的示例性实施例的描述中，本发明的各个特征有时 被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该公开 的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本发明要求比在每个权利要求 中所明确记载的特征更多特征。更确切地说，如下面的权利要求书所反映的 那样，发明方面在于少于前面公开的单个实施例的所有特征。因此，遵循具 体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本发明的单独实施例。
如在此所使用的那样，除非另行规定，使用序数词“第一”、“第二”、 “第三”等等来描述普通对象仅仅表示涉及类似对象的不同实例，并且并不 意图暗示这样被描述的对象必须具有时间上、空间上、排序方面或者以任意 其它方式的给定顺序。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。

Claims (4)

1.一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取适量分离法获得的脐带血，经过筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史；
S2、通过培养液对脐带血单核细胞进行定向分化培养得到原代培养物；
S3、然后在室温为35-39℃，3-7％CO2，无菌条件下，用培养液对脐带血单核细胞进行定向分化培养4-6天，移除未贴壁的细胞，定向分化培养期间每1-2天更换一次培养液；
S4、再用培养液继续培养2-6天得到原代培养物，继续培养期间培养液1-2天更换一次；
S5、得到的原代培养物消化下来，在室温为35-39℃，3-7％CO2，无菌条件下用培养液进行传代培养，培养4-5代得到造血干细胞；
S6、统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按需要将细胞和复方电解质溶液混匀，并留样进行内毒素和细菌检测，即可低温储存。
2.根据权利要求1所述的一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法，其特征在于：所述培养液为体积比为1：0.8-1.2的MEL/F12培养基和腺苷酸环化酶激活剂，血清都代物，L抗坏血酸，L谷氨院腰衍生物，ALK抑制剂，GSK-3抑制剂。
3.根据权利要求1所述的一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法，其特征在于：所述分离法采用医用级别淋巴分离液或采用Picoll-paque密度梯度分离法。
4.根据权利要求1所述的一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法，其特征在于：所述分离法获得的脐带血通过筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带获得。
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