CN108456658A

CN108456658A - 促进造血干细胞扩增并抑制其分化的化合物及细胞因子组合物

Info

Publication number: CN108456658A
Application number: CN201710096938.1A
Authority: CN
Inventors: 蒋永平; 王兰; 关欣
Original assignee: Suzhou Fangzhou Gene Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Suzhou Ark Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2018-08-28

Abstract

本发明涉及促进造血干细胞扩增并抑制其分化的组合物及细胞因子组合物。本发明揭示有利于维持体外培养的造血干细胞的干性的小分子化合物组合物，所述的组合物及适当的细胞因子在添加到造血干细胞基础培养基后，能够在体外高效扩增造血干细胞并抑制其分化，维持造血干细胞的干性。

Description

促进造血干细胞扩增并抑制其分化的化合物及细胞因子组合物

技术领域

本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及造血干细胞体外扩增并抑制分化、维持造血干细胞特性稳定的新方法，以及促进造血干细胞扩增并抑制其分化的小分子化合物及细胞因子组合物。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞群体。按干细胞的分化潜能的大小可以分为全能干细胞，多能干细胞和单能干细胞。造血干细胞是一类存在于骨髓中数量极其有限的细胞类群，具有自我更新和多向分化为各系血细胞的能力。造血干细胞移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的有效方法。其中，脐带血来源的造血干细胞移植具有无来源性限制、对HLA匹配要求不高、不易受病毒或肿瘤污染等优势，但由于其本身数量的限制以及供体资源的短缺，严重制约了脐带血造血干细胞的临床应用。

本发明人在先开发的技术中，尽管已经能够获得有效扩增的造血干细胞，但造血干细胞分化是其体外扩增中无法避免的一个问题，也是导致扩增后细胞丧失自我更新能力并制约其临床疗效的一大瓶颈。目前已知的造血干细胞体外扩增方法主要包括单纯细胞因子或其他生长因子刺激法、基质细胞共培养法、基因修饰法等。这些研究方案中，单纯细胞因子或其他生长因子法虽然能够达到可观的细胞数量，但是该法不利于维持干细胞的自我更新，因具有极高的分化率而影响后续的临床应用；基质细胞共培养法因引入了外源性细胞，易提高GVDH发生风险，不利于临床移植；基因修饰法涉及自身基因的改变或外源基因的插入，可能会干预细胞自身基因组稳定性，同时病毒载体的介入有可能提高致瘤风险。

综上，尽管截至目前有多种方法可以促进造血干细胞的体外扩增，但是如何有效抑制分化并维持干性稳定依然是需要进一步研究的。更特别地是，在考虑产业化的情形下，需要找到成本低廉，且可实现高效体外扩增、体外维持干性稳定的培养方法，从而有利于大规模实施、推广。

发明内容

本发明的目的在于提供促进造血干细胞扩增并抑制其分化的化合物及细胞因子组合物。

在本发明的第一方面，提供一种维持造血干细胞的干性的组合物，所述的组合物包括：

Stem Regenin 1： 0.2-10μM；

2-丙基戊酸： 0.05-2mM；

CAY10433： 0.02-1μM。

在另一优选例中，所述的用于维持造血干细胞的干性的组合物包括：

Stem Regenin 1： 0.5-5μM；

2-丙基戊酸： 0.08-1mM；

CAY10433： 0.04-0.5μM。

在本发明的另一方面，提供一种用于扩增造血干细胞并维持其干性的组合物，所述的组合物包括：

在一个优选例中，所述的用于扩增造血干细胞并维持其干性的组合物包括：

在另一优选例中，所述的用于扩增造血干细胞并维持其干性的组合物，所述的组合物还包括：白介素6：10-200ng/ml；较佳地为20-120ng/ml。

在本发明的另一方面，提供所述的维持造血干细胞的干性的组合物的用途，用于维持造血干细胞的干性稳定；或用于制备维持造血干细胞的干性的培养基。

在本发明的另一方面，提供所述的用于扩增造血干细胞并维持其干性的组合物的用途，用于促进造血干细胞扩增并维持其干性；或用于制备促进造血干细胞扩增并维持其干性的培养基。

在本发明的另一方面，提供一种用于培养造血干细胞的培养基，所述的培养基包括：所述的维持造血干细胞的干性的组合物和造血干细胞基础培养基。

在本发明的另一方面，提供一种用于培养造血干细胞的培养基，所述的培养基包括：所述的用于扩增造血干细胞并维持其干性的组合物和造血干细胞基础培养基。

在一个优选例中，所述的造血干细胞基础培养基包括(但不限于)：Stemspan。

在本发明的另一方面，提供一种用于培养造血干细胞的试剂盒，所述的试剂盒中包括：所述的维持造血干细胞的干性的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种用于培养造血干细胞的试剂盒，所述的试剂盒中包括：所述的用于培养造血干细胞的培养基。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：造血干细胞基础培养基；更佳的，所述的造血干细胞基础培养基包括(但不限于)：Stemspan。

在本发明的另一方面，提供一种扩增造血干细胞并维持其干性的方法，所述方法包括：利用所述的用于培养造血干细胞的培养基培养人造血干/祖细胞。

在一个优选例中，所述的人造血干/祖细胞是CD34+人造血干/祖细胞。

在另一个优选例中，在培养期间，还包括更换1-2次新鲜的所述的用于培养造血干细胞的培养基的步骤。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明对人脐带血CD34+细胞和CD34+CD38-细胞的影响。

A、第7天总细胞、CD34+及CD34+CD38-细胞的扩增情况；

B、第7天CD34+及CD34+CD38-的获得情况。

图2、本发明培养的CD34+细胞能够维持体外干性稳定并抑制分化。

A、本发明维持相对静止的干细胞状态；

B、本发明增强造血干细胞特异性基因表达；

C、本发明促进造血干细胞多向分化能力。

图3、本发明培养的CD34+细胞具有体内移植的安全性与有效性。

A、一次移植8周后骨髓中人源细胞比例；

B、一次移植8周后外周血中人源细胞比例；

C、二次移植10周后骨髓中人源细胞比例。

图4、SR1单独加入以及同时加入SR1、VPA和C433时在培养及维持造血干细胞干性方面的比较。

图5、VPA单独加入以及同时加入SR1、VPA和C433时在培养及维持造血干细胞干性方面的比较。

具体实施方式

本发明人经过大量的研究和筛选，选择到一些有利于维持体外培养的造血干细胞的干性的小分子化合物。本发明所述的小分子化合物的组合物及适当的细胞因子在添加到造血干细胞基础培养基后，能够在体外高效扩增造血干细胞并抑制其分化，维持造血干细胞的干性。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。

组合物及培养基

本发明人通过对多种小分子化合物和/或细胞因子的各种组合和其浓度梯度的筛选、优化，得到了本发明的组合物。在本发明的具体实施例中，本发明人将最优选的组合物命名为“SC Cocktail”。

本发明的维持造血干细胞的干性的组合物中，包括多种小分子化合物，即StemRegenin 1、2-丙基戊酸以及CAY10433。

其中，Stem Regenin 1是一种嘌呤霉素衍生物，其结构式如下：

本领域中，已知Stem Regenin 1是能促进人CD34+细胞大量扩增的小分子。但是，仅应用Stem Regenin 1，扩增的倍数仍然是有限的。

2-丙基戊酸(Valproic acid)是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，其结构式如下：

已知2-丙基戊酸具有多种功能，其被作为抗惊厥药物和情绪稳定药广泛用于人体内，主要用于治疗癫痫，躁郁症和严重忧郁症；也用于治疗偏头痛和精神分裂症。但是，单独使用VPA的作用有限，并不能很好地维持HSC的干性(见图5)。

CAY10433是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，其结构式如下：

CAY10433被应用于培养一些细胞，对于人白血病细胞，其引起G1滞留和组蛋白H4乙酰化作用，影响Sp1，NF-κB，p21，FasL表达。CAY10433以剂量依赖方式抑制细胞生长和诱导细胞凋亡。对于Hela细胞，CAY10433提高G0/G1期细胞数量，导致sub-G1聚集，诱导凋亡。本发明人发现，CAY10433的浓度对于细胞的培养较为重要，过高的CAY10433不利于细胞生长，会使细胞产生严重的凋亡，过低的CAY10433则作用有限，因此，本发明人优化了合适的浓度范围。

上述各组合物以适合的比例添加到培养基中，可在造血干/祖细胞培养过程中提供适合的环境，维持造血干细胞的干性稳定。作为本发明的优选方式，本发明的小分子化合物的用量如表1所示。

表1

组分	含量	优选量	更优选量
				Stem Regenin 1	0.2-10μM	0.5-5μM	0.8-1.5μM
2-丙基戊酸	0.05-2mM	0.08-1mM	0.12-0.5mM
				CAY10433	0.02-1μM	0.04-0.5μM	0.06-0.3μM

表1配方的组分被添加于造血干细胞的培养基(基础培养基)中，从而为造血干细胞维持干性稳定提供适宜的环境。所述的基础培养基可以选择Stemspan培养基或类似的造血干细胞培养基。

为了提高造血干细胞的扩增效率，本发明人还在造血干细胞基础培养基中，加入以下的细胞因子：干细胞因子、Flt3-配体、促血小板生成素、白介素6。

这些细胞因子以适合的比例添加到细胞生长培养液中，可为造血干细胞的扩增提供合适的环境，与不添加干细胞因子、Flt3-配体、促血小板生成素、白介素6相比，可以使得扩增细胞数显著增加。作为本发明的优选方式，各细胞因子组分的用量如表2所示。

表2

组分	含量	优选量	更优选量
				干细胞因子	20-500ng/ml	50-300ng/ml	80-150ng/ml
Flt3-配体	20-500ng/ml	50-300ng/ml	80-150ng/ml
				促血小板生成素	10-200ng/ml	15-150ng/ml	30-50ng/ml
白介素6	10-200ng/ml	20-120ng/ml	40-80ng/ml

表2配方的组分为造血干细胞的扩增提供合适的环境，使得造血干细胞能够大量扩增。

本发明的由小分子化合物组合与特定细胞因子组成的新型培养基，一方面通过小分子化合物的组合有效抑制造血干细胞体外分化并维持其干性稳定，另一方面通过细胞因子的组合促进细胞的高效扩增。经证实，本发明培养后的人CD34+细胞在体外和体内均可以发挥正常功能并且具有长期安全性。

本发明中，用于配制培养基的各种组分，均是本领域技术人员易于获得的，例如可通过商业途径购买，或可通过人工合成或重组表达获得。由于小分子药物可以通过对浓度和组合的调整来达到不同的目的，所以具有调控的灵活性。临床应用中小分子化合物具有多方面的优势，主要包括：①较小的分子量使其具有良好的细胞通透性；②成本低、性价比高；③不具有免疫原性；④来源广泛、容易合成或购买、易于标准化和保存。

培养方法

本发明提供了一种扩增培养造血干细胞的方法，所述方法包括利用本发明所述的用于培养造血干细胞的培养基培养人造血干/祖细胞。较佳地，所述的人造血干/祖干细胞是CD34+人造血干/祖干细胞。在培养期间，还可以根据培养情况，更换新鲜的培养基。

本发明中，所述的造血干/祖细胞可以是来自人体的造血干/祖细胞，来自医院中遗弃的脐带(例如新生儿脐带)中的造血干/祖细胞，也可以来自本领域在先技术已经扩增培养或商业化的造血干/祖细胞。例如，本发明人的在先研究中已经扩繁了人造血干/祖细胞，可以应用这些体外扩增获得的人造血干/祖细胞。

本发明中，所述的造血干/祖细胞对于血型没有特别的限制，可以是来自A型血、B型血或O型血的脐带血。较佳地，可以是来自O型血的造血干/祖细胞，来自O型血的造血干细胞可以普遍适用于临床需要输血人群，可以覆盖大多数人群输血，尤其急救、战备时，可以减少检测血型的过程。

与传统方法相比，本发明的方法既避免了单纯细胞因子法所导致的干细胞分化，保持干细胞特性稳定，又可以获得数量可观的干细胞数目，同时具有不引入外源性基因表达和不涉及饲养层细胞等外源性细胞的优势，避免了外源基因对原干细胞基因组稳定性的干扰和外源细胞相关的移植安全隐患。

在本发明的具体实施例中，已证明，原始分离的脐带血造血干细胞经本配方培养7天后，CD34阳性率可以达到86.6％，CD34+CD38-比例可以达到76.2％，接近初始分离造血干细胞的阳性比例；同时又可以有效促进细胞的体外扩增，7天后CD34+细胞扩增28.0倍，CD34+CD38-细胞扩增27.9倍。此外，体内外功能实验证实，经本配方扩增后的细胞能够保持干细胞特性不受损害，并且具有安全性和有效性。

本发明的方法，不仅有助于造血干细胞自身的临床应用，也可用于后续功能性血液细胞的制备，具有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、小分子化合物的组合物的制备

一、“SC Cocktail”组合物

配制“SC Cocktail”小分子化合物组合物，其配方如表3～表5所示。

表3

表4

表5

二、细胞因子组合物

配制细胞因子组合物，其配方如表6～表8所示。

表6

表7

表8

实施例2、人脐带血CD34+细胞及CD34+CD38-细胞的体外扩增

一、应用“SC Cocktail”组合物配方1及细胞因子组合物配方1的扩增

第0天：

(1)SC Cocktail培养基配制

在Stemspan基础培养基中添加前述实施例1中含有四种细胞因子的组合物，使细胞因子终浓度为SCF 100ng/mL、Flt-3L 100ng/mL、TPO 40ng/mL、IL-6 50ng/mL(即表6配方)。同时，添加前述实施例1中含有三种小分子化合物的组合物，使小分子化合物的终浓度分别为SR1 1μM、VPA 0.2mM、C4330.1μM(即表3配方)。

作为对照的VC培养基含有等量细胞因子(即表6配方)、与SR1和C433等体积的DMSO以及基础培养基Stemspan。

(2)分离纯化脐带血CD34+细胞及培养

取新鲜足月健康新生儿脐带血，使用Ficoll密度梯度离心法和美天旎公司的MACS系统进行CD34+细胞分离，获得2×10⁶个细胞，纯度>90％以上。

将细胞培养于上述配制好的SC Cocktail培养基或作为对照的VC培养基中，调整细胞密度为2×10⁵个细胞/mL，置于24孔板(n＝3)，显微镜下观察后，置于培养箱中(37℃，5％CO₂)培养7天。

(3)流式检测

取4×10⁴个CD34+细胞置于1.5mL离心管中，加入1mL含有1％BSA的PBS洗涤液，室温下1200rpm离心5分钟，弃上清后用200μL含有1％BSA的PBS重悬细胞，将细胞悬液平均置于两个1.5mL离心管中，管1中加入2μL CD34抗体(PE-anti-human CD34)和2μL CD38抗体(APC-anti-human CD38)，管2中分别加入2μL相对应的同型对照抗体(PE Mouse IgG2aIsotype Control，APC Mouse IgG1κIsotype Control)，室温避光孵育20分钟后，每管加入1mL PBS洗涤，室温下1200rpm离心5分钟，弃上清后用200μL PBS重悬细胞，流式细胞仪分析细胞表面CD34及CD38的表达情况，以确定CD34+和CD34+CD38-的细胞的量。

第3天：

显微镜下观察细胞生长状态，根据细胞数目进行分孔，密度应低于1×10⁶个/mL。同时，添加新鲜培养基(即前述“(1)SC Cocktail培养基”；对照添加“VC培养基”)。

第7天：

(1)细胞计数

采用台盼蓝染色法，利用细胞计数板对细胞数目进行计算。计算结果见图1，A。

该计算结果显示，应用SC Cocktail培养基，总细胞扩增32.0倍(n＝3)，CD34+细胞扩增28.0倍(n＝3)，CD34+CD38-细胞扩增27.9倍(n＝3)。

对照组中，尽管总细胞扩增倍数很高，但是CD34+细胞扩增倍数较低，且CD34+CD38-细胞扩增也很低。

(2)流式检测

采用上述流式细胞检测法对细胞表面CD34及CD38的表达情况进行检测，结果见图1，B。

该结果可见，应用“SC Cocktail培养基”的CD34+细胞扩增倍数极为显著地高于应用“VC培养基”的情形。并且，应用“SC Cocktail培养基”的CD34+CD38-细胞的扩增倍数也极为显著地高于应用“VC培养基”的情形。

二、应用“SC Cocktail”组合物配方2(表4)及细胞因子组合物配方3(表8)的扩增

配方方法同前述“一”中，不同处在于应用“SC Cocktail”组合物配方2(表4)及细胞因子组合物配方3(表8)替换“一”中的配方。VC组的配方同前。

在培养第7天，采用台盼蓝染色法，利用细胞计数板对细胞数目进行计算。计算结果显示，应用SC Cocktail培养基，CD34+细胞及CD34+CD38-细胞扩增的倍数如前应用“SCCocktail”组合物配方1及细胞因子组合物配方1的扩增一样，有很大提高。

VC对照组中，尽管总细胞扩增倍数很高，但是CD34+细胞扩增倍数较低，且CD34+CD38-细胞扩增也很低。

三、应用“SC Cocktail”组合物配方3(表5)及细胞因子组合物配方2(表7)的扩增

在培养第7天，采用台盼蓝染色法，利用细胞计数板对细胞数目进行计算。计算结果显示，应用“SC Cocktail”培养基，CD34+细胞及CD34+CD38-细胞扩增的倍数如前应用“SCCocktail”组合物配方1及细胞因子组合物配方1的扩增一样，有很大提高。

实施例3、CD34+细胞能够维持体外干性稳定并抑制分化

一、细胞周期

①实验过程

分别收集未经处理的原始CD34+细胞(PC)、实施例2的“一”中本发明SC Cocktail扩增培养的细胞(CD34+细胞)及溶剂对照组(VC)细胞，PBS洗涤后离心去上清，细胞悬于4％多聚甲醛中于4℃固定过夜，细胞离心后使用Cycle TEST^TM plus DNA Reagent Kit对细胞进行处理，流式细胞仪检测。

②实验结果

经SC Cocktail扩增的CD34+细胞绝大多数处于相对静止的状态(G₀/G₁:75.2％；S:9.2％)，与未经处理的CD34+细胞(PC)基本一致(G₀/G₁:92.03％)，符合造血干细胞的特性。而溶剂对照组细胞DNA的合成相对比较活跃，细胞增殖能力强(G₀/G₁:56.0％；S:31.8％)，见图2，A。

该实验结果证明，本发明的SC Cocktail配方具有良好的维持造血干细胞干性稳定的能力。

二、造血干细胞特异性基因表达

①实验过程

分别收集未经处理的原始CD34+细胞(PC)、实施例2的“一”中本发明SC Cocktail扩增培养的细胞(CD34+细胞)及溶剂对照组(VC)细胞。检测三组细胞中HSC特异性基因的表达情况，包括CD90、CD133、CD117、ALDH1、Bmi1、HoxB4、GATA-2、Runx1和CXCR4。

收集三组细胞后，Trizol法提取总RNA，取等量的三组总RNA分别反转录为cDNA，并以此为模板对特异性基因的表达进行RT-PCR检测，琼脂糖凝胶电泳进行条带分析；特异性基因表达的相对定量检测通过qPCR进行，cDNA的合成无需取等量的总RNA。

②实验结果

经SC Cocktail扩增的CD34+细胞中，上述HSC特异性基因的相对表达量与未经处理的CD34+细胞(PC)相比基本相同或略有增加，而VC对照组细胞中这些基因的表达明显降低或基本检测不到，见图2，B。

上述实验结果证明，本发明的SC Cocktail配方能够维持造血干细胞特性稳定并抑制体外分化。

三、集落形成单位

①实验过程

分别收集未经处理的原始CD34+细胞(PC)、实施例2的“一”中本发明SC Cocktail扩增培养的细胞(CD34+细胞)及溶剂对照组(VC)细胞。各组细胞取3500个分别与商品化的甲基纤维素培养基混匀，按照每孔1000个细胞的量接种于6孔板中，每组三个复孔，培养14天后于倒置显微镜下对形成的细胞克隆单位进行拍照计数。

②实验结果

经SC Cocktail扩增的CD34+细胞，14天后形成爆式红细胞集落形成单位(BFU-E)的克隆数为54.0±4.6、粒系-巨噬系集落形成单位(CFU-GM)克隆数为71.0±2.7、粒系-红系-巨噬系-巨核系集落形成单位(CFU-GEMM)克隆数为40.7±3.8、巨核系集落形成单位(CFU-Mk)克隆数为6.7±1.5，与未经处理的原始CD34+细胞相比，所形成的克隆数目基本相同且明显高于VC对照组细胞，结果见图2，C。

该实验结果证明，利用本发明的SC Cocktail配方培养的造血干细胞在体外具有多向分化的能力。

实施例4、本发明培养的CD34+细胞具有体内移植的安全性与有效性

一、一次移植

①实验分组

实验对象：6-8周龄NOD/SCID小鼠。

健康对照组：不经任何处理，n＝2；

生理盐水组：注射100μl生理盐水，n＝3；

阳性对照组(PC)：注射5×10⁵原始的脐带血CD34+细胞，n＝5；

SC Cocktail组：注射5×10⁵经SC Cocktail扩增的CD34+细胞，n＝5；

VC溶剂对照组：注射5×10⁵VC溶剂对照组细胞，n＝5。

②实验过程

6-8周龄NOD/SCID小鼠经2.5GY紫外线辐照，辐照4h后按照上述分组通过尾静脉注射各组细胞，小鼠饲养8周后，内眦静脉采集外周血、安乐死后收集股骨和胫骨的骨髓细胞，细胞计数板技术后流式细胞术检测人源性CD45、CD34、CD38、CD14、CD19、CD71、CD66、CD41a的表达情况。

③实验结果

实验结果显示，小鼠骨髓中SC Cocktail组可以检测到21.1％人源化hCD45的表达，hCD34比例为7.7％，hCD34+CD38-比例为6.8％，显著高于VC溶剂对照组并且优于阳性对照组，同时可以检测到不同比例的其他各系血细胞的存在，见图3，A。

小鼠外周血中，SC Cocktail扩增的CD34+细胞组的hCD45的比例为5.4％， hCD34比例为6.0％，同样可检测到不同比例的各系血细胞，见图3，B。该结果说明，SC Cocktail扩增的CD34+细胞组明显优于VC溶剂对照组和阳性对照组。

上述结果进一步证明，经SC Cocktail扩增的造血干细胞能够在体内环境至少存活8周，并且可以分化为不同系别的血液细胞。

二、二次移植

①实验分组

实验对象：6-8周龄NOD/SCID小鼠。

健康对照组：不经任何处理，n＝2；

生理盐水组：注射100μl生理盐水，n＝3；

阳性对照组(PC)：注射2×10⁶原始的脐带血CD34+细胞，n＝5；

SC Cocktail组：注射2×10⁶经SC Cocktail扩增的CD34+细胞，n＝5；

VC溶剂对照组：注射2×10⁶VC溶剂对照组细胞，n＝5。

②实验过程

6-8周龄NOD/SCID小鼠经2.5GY紫外线辐照，辐照4h后，分别尾静脉注射来自于一次移植中相应组别的小鼠骨髓细胞，上述各组小鼠饲养10周后安乐死处死并收集股骨和胫骨的骨髓细胞，细胞计数板技术后流式细胞术检测人源性CD45、CD34、CD38、CD14、CD19、CD71、CD66、CD41a的表达情况。

③实验结果

二次移植小鼠骨髓中，SC Cocktail组人源化hCD45比例为2.26％、hCD34比例为1.41％，略低于阳性对照组但显著高于溶剂对照组，而其他各系人源化标记物的表达则显著高于阳性对照组和VC溶剂对照组，见图3，C。该结果表明，本发明的SC Cocktail配方具有在体内促进造血干细胞自我更新和多系分化的能力。

此外，在一次移植和二次移植小鼠中，所有小鼠均健康存活，没有出现任何异常及不良反应，没有观察到畸胎瘤的形成，证实本发明培养的细胞具有长期的体内安全性。

实施例5、维持造血干细胞的干性的组合物的各组分的作用研究

本发明人在前期小分子组合筛选过程中，比较了SR1单独加入以及同时加入SR1、VPA和C433时在培养及维持造血干细胞干性方面的区别；以Stemspan作为基础培养基，并且，添加TPO、SCF、Flt3-L三种细胞因子。分组情况如表9。

表9

上述两组分别如前述的培养方法培养7天后，统计CD34的阳性率及CD34+细胞的扩增倍数。结果如图4。由图可知，含有小分子化合物SR1、VPA和C433组合的这一组，CD34的阳性率及CD34+细胞体外扩增倍数均显著高于单独使用SR1组。

因此，仅以SR1而不加入VPA和C433化合物时，效果显著不如三个化合物同时应用。

实施例6、维持造血干细胞的干性的组合物的各组分的作用研究

本发明人在前期小分子组合筛选过程中，比较了VPA单独加入以及同时加入SR1、VPA和C433时在培养及维持造血干细胞干性方面的区别；以Stemspan作为基础培养基，并且，添加TPO、SCF、Flt3-L三种细胞因子。分组情况如表10。

表10

上述两组分别如前述的培养方法培养7天后，统计CD34的阳性率及CD34+细胞的扩增倍数。结果如图5。由图可知，含有小分子化合物SR1、VPA和C433组合的这一组，CD34的阳性率及CD34+细胞体外扩增倍数均显著高于单独使用VPA组。

因此，仅以VPA而不加入SR1和C433化合物时，效果显著不如三个化合物同时应用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种维持造血干细胞的干性的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：

Stem Regenin 1： 0.2-10μM；

2-丙基戊酸： 0.05-2mM；

CAY10433： 0.02-1μM。

2.一种用于扩增造血干细胞并维持其干性的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：

3.如权利要求2所述的用于扩增造血干细胞并维持其干性的组合物，其特征在于，所述的组合物还包括：

白介素6： 10-200ng/ml。

4.权利要求1所述的组合物的用途，其特征在于，用于维持造血干细胞的干性稳定；或用于制备维持造血干细胞的干性稳定的培养基。

5.权利要求2或3所述的组合物的用途，其特征在于，用于促进造血干细胞扩增并维持其干性稳定；或用于制备促进造血干细胞扩增并维持其干性稳定的培养基。

6.一种用于培养造血干细胞的培养基，其特征在于，所述的培养基包括：

权利要求1所述的组合物和造血干细胞基础培养基；或

权利要求2-3任一所述的组合物和造血干细胞基础培养基。

7.一种用于培养造血干细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：权利要求1或2或3所述的组合物；或

所述的试剂盒中包括：权利要求6所述的培养基。

8.一种扩增造血干细胞并维持其干性的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求6所述的用于培养造血干细胞的培养基培养人造血干/祖细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的人造血干/祖细胞是CD34+人造血干/祖细胞。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在培养期间，还包括更换1-2次新鲜的权利要求6或7所述的用于培养造血干细胞的培养基的步骤。