MX2010011891A - Procedimiento para la expansion indiferenciada u orientada a linaje mieloide de celulas madre hematopoyeticas procedentes de sangre de cordon umbilical, sangre periferica movilizada o medula osea. - Google Patents

Procedimiento para la expansion indiferenciada u orientada a linaje mieloide de celulas madre hematopoyeticas procedentes de sangre de cordon umbilical, sangre periferica movilizada o medula osea.

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Abstract

Procedimiento para la expansión indiferenciada u orientada a linaje mieloide de células madre hematopoyéticas (CMH). Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento de expansión de CMH a partir de la sangre del cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica movilizada. Dicho procedimiento comprende las etapas de cultivo de expansión a volumen constante de las células CD34+ purificadas, cultivo de expansión a volumen variable de dichas células y el acondicionamiento de las células CD34+ para el trasplante. Con este procedimiento se genera de forma reproducible, robusta y segura la dosis de CMH indiferenciadas u orientadas a linaje mieloide necesarias para su uso clínico.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA EXPANSIÓN INDIFERENCIADA U ORIENTADA A LINAJE MIELOIDE DE CÉLULAS MADRE HEMATOPOYETICAS PROCEDENTES DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL, SANGRE PERIFÉRICA MOVILIZADA O MÉDULA ÓSEA DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento aplicable para la expansión in vitro indiferenciada u orientada a linaje mieloide de células madre hematopoyéticas (CMH) . Dicho procedimiento comprende las etapas de expansión a volumen constante de las células madre purificadas, expansión a volumen variable de dichas células y el acondicionamiento.de las células para el trasplante. Con este procedimiento es posible expandir de forma reproducible y robusta las CMH hasta alcanzar dosis · clínicamente significativas o bien de células inmaduras u orientadas a linaje mieloide de una manera rápida y segura.
Las CMH son células multipotenciales capaces, mediante un complejo proceso de autorenovación y diferenciación, de mantener la homeostasis del órgano hematopoyético dando lugar, de forma exquisitamente regulada, a todos los linajes celulares de la sangre. Estos linajes se organizan en dos grandes grupos con funcionalidades distintas: mieloides y lmfoides. Los mieloides agrupan a: monocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, que combaten las infecciones' en el organismo; los megacariocitos (plaquetas) , que participan del proceso de coagulación de la sangre, asi como los eritrocitos, transportan el oxígeno a los tejidos. El otro gran grupo de células sanguíneas son las linfoides compuesto por: células B, células T y NK, que se ocupan de la vigilancia inmunológica .
El trasplante autólogo o alogénico de CMH representa una importante alternativa terapéutica para enfermedades hematológicas como las neoplasias, inmunodeficiencias primarias y desordenes metabólicos. Las principales fuentes para el trasplante terapéutico de CMH son: la médula ósea (MO) , la sangre periférica movilizada (SPM) y la sangre de cordón umbilical (SCU) . Históricamente, la médula ósea ha representado la fuente principal de células madre para el trasplante de pacientes pediátricos y adultos.. No obstante, la dificultad de encontrar donantes compatibles y el riesgo de sufrir la enfermedad del injerto contra el huésped asociado al trasplante alogénico, ha limitado su aplicabilidad . Problemática que la MO comparte con la sangre periférica movilizada. En respuesta a esta problemática, y como fuentes alternativas a la MO y SPM, se pueden utilizar para transplante hematopoyético las CMH procedentes de sangre de cordón umbilical. Esta fuente de CMH presenta una serie de importantes ventajas con respecto a la MO y SPM, tales como el menor grado de correspondencia del complejo mayor histocompatibilidad de HLA donante - receptor necesario, la menor incidencia de la enfermedad del donante contra el huésped y la gran disponibilidad de unidades almacenadas en los bancos de cordón de todo el mundo, lo que facilita la rápida localización de potenciales donantes (Barker y otros Searching for unrelated donor hematopoietic stem cells : availability and speed of umbilical cord blood versus bone marrow. Biol Blood Marrow Trasplant. 2002; 8 :257-260) .
La mayor desventaja en el trasplante de SCU es la baja dosis celular disponible de CMH por unidad respecto a las disponibles en SMP y MO. Esta particularidad se traduce en un mayor riesgo de fallo del trasplante y elevados tiempos de aplasia mieloide, que dejan al paciente expuesto a contraer infecciones potencialmente mortales. Esta problemática limita la utilización de las CMH de SCU básicamente al trasplante pediátrico. La cantidad de CMH disponibles para el trasplante es, por tanto, un parámetro critico. El mejor . parámetro de predicción para la supervivencia y recuperación de los parámetros hematológicos normales en pacientes pediátricos y adultos es la dosis celular {Barker y otros Serious infections after unrelated donor trasplantation in 136 children : impact of stem cell source. Biol Blood Marrow Trasplant. 2005;11:362-370).
Diversos estudios realizados con CMH de SPM y MO han permitido establecer una dosis mínima requerida en función de la fuente celular que se ha fijado en 2xl06 células por kilo de paciente en MO y de 3-5xl06 células por kilo de paciente para SMP {Heimfeld y otros HLA-identical stem cell transplantation: is there an optimal CD34 cell dose? .Bone Marrow Transplantation 2003;31 : 839-845) .
Estos resultados sugieren que las metodologías para expandir las células madre/progenitoras hematopoyéticas de SCU supondrían una mejora notable en las alternativas terapéuticas disponibles. Existen varias estrategias prometedoras disponibles para la expansión in yitro de las CMH con diferentes sistemas {Cabrita, y otros, Hematopoietic stem cells from the bone to the reactor. Trends in Biotechnology 2003; 21:223-240) pero de momento en ensayos clínicos realizados estas metodologías no han demostrado mejoras destacables en las recuperaciones hematológicas respecto a las unidades de SCU no expandidas.
La principal limitación que presentan muchas de las expansiones in vitro es la escasa dosis obtenida de células madre/progenitoras con funcionalidad adecuada.
Uno de los principales problemas del cultivo in vitro de las CMH es el bloqueo de la capacidad de crecimiento de dichas células. Éste bloqueo se produce como consecuencia de la acumulación en el medio de cultivo de biomoléculas liberadas por las propias CMH y las células maduras presentes en el cultivo. Estas biomoléculas producen la detención del ciclo de las CMH bloqueando la expansión o la diferenciación al hacerlas entrar en quiescencia.
La presente invención da a conocer un procedimiento de cultivo in vitro de CMH cuya estrategia se fundamenta en mantener la concentración de "las biomoléculas solubles responsables de la detención del crecimiento de las CMH en la fase G0/G1 por debajo de su nivel de acción, a base de realizar adiciones puntuales de medio fresco. De esta forma, se puede inducir y mantener el crecimiento de CMH de sangre de cordón umbilical a un ritmo aproximadamente constante durante toda la duración del cultivo.
Esta particularidad permite controlar y manipular el factor de expansión (células finales/células iniciales) para la población de interés, lo que facilita adaptar dicho factor de expansión en función de la dosis celular requerida para la terapia.
Otro aspecto adicional del procedimiento de la presente invención es que dicha expansión no se produce a costa de agotar la subpoblación de CMH más primitivas, que son de gran interés terapéutico, ya que su número se mantiene constante a lo largo del procedimiento. Por otro lado, el procedimiento de la presente invención, variando los factores de crecimiento empleados, permite realizar una expansión madurativa de las CMH que facilita la obtención de productos destinados a terapia celular en base a células en distintos estadios de diferenciación de linajes mieloide. Dichas células son aplicables en deficiencias del sistema inmunológico .
Otras ventajas adicionales son que el procedimiento es robusto, reproducible y que es extremadamente sencillo, tanto en equipamiento como en manipulación. El procedimiento de la presente, invención es aplicable a la expansión indiferenciada o madurativa de células CMH a partir de sangre del cordón umbilical, médula ósea y de sangre periférica movilizada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En consecuencia, un objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para la expansión in vitro indiferenciada u orientada a linaje mieloide de CMH a partir de sangre de cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica movilizada. Este procedimiento está caracterizado porque comprende las etapas de: a) Expansión a volumen constante, en la que se siembran células CD34+, anteriormente purificadas por técnicas estándares conocidas en el estado de la técnica, tales como la selección positiva mediante perlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos contra CD34+, en un medio de cultivo sintético adecuado disponible comercialmente en el mercado, suplementado con factores de crecimiento: TPO, FLT3," SCF, IL-6 en caso de expansión indiferenciada de CMH o bien SCF, IL3, G-CSF en caso de expansión madurativa a linaje mieloide durante 4 dias. El volumen inicial de la etapa a volumen constante es función de la disponibilidad de células procedentes de la purificación inicial de las células CD34+. El volumen final en la etapa de expansión a volumen constante también estará en dependencia de la densidad de siembra inicial. b) Expansión a volumen variable: en el día 4 del cultivo se añade medio fresco suplementado con factores de crecimiento: TPO, FLT3, SCF y IL-6, en caso de expansión indiferenciada de CMH o bien SCF, IL-3 y G-CSF en caso de expansión madurativa a linaje mieloide a una concentración de entre 5 y 100 ng/ml a la bolsa de cultivo hasta duplicar el volumen anterior contenido en la bolsa. Se repite . dicha operación los días 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18. El cultivo se detiene a los 20 días.
Preferentemente la concentración de células CD34+ en la siembra de la etapa (a) es de 100.000 a 1.000.000 de células CD34+ por mi de medio de cultivo.
También preferentemente la concentración de factores de crecimiento TPO, FLT3, SCF, IL-6 en el medio de cultivo es de entre 5 y 100 ng/ml.
Caso 1: Expansión de CMH indiferenciadas En el caso de aplicar el procedimiento descrito empleado como factores de crecimiento FLT3, SCF e IL-6 con el objetivo de tener una expansión indiferenciada de CMH, a los 20 días de cultivo se obtiene una tasa de expansión de la población CMH de, como mínimo 200 veces, generando por tanto una dosis de células indiferenciadas adecuada para su uso clínico. Si el tratamiento requiere un mayor número de células, se puede seguir repitiendo el procedimiento de duplicación del volumen cada 2 días hasta obtener la cantidad de células necesarias.
Además, las CMH obtenidas por el procedimiento de la presente invención mantienen el fenotipo y la funcionalidad característica de estas células: se expande el número de unidades formadoras de colonias mixtas CFU-mix, las unidades formadoras de colonias eritroides BFU-E y las unidades formadoras de colonias de granulocíticos-macrófagos CFU-GM. Se mantiene el número de células con capacidad formadora de colonias a largo plazo. Por otro lado, las células expandidas mostraron una capacidad de injerto en modelos de ratón inmunodeficiente (NOD-SCID) . Además, el producto obtenido es adecuado para su uso en terapia celular en el aspecto de la bioseguridad . Las células obtenidas no presentan alteraciones cromosómicas y no presentan señales de inducción de apoptosis temprana.
El procedimiento es robusto, ya que independientemente de la pureza, inicial de las células CD34+ se consigue la tasa de expansión esperada. Además, el procedimiento de la presente invención presenta una alta reproducibilidad lote a lote.
La presente invención es descrita a continuación en más detalle en referencia a un ejemplo y a un dibujo (figura 1) . Este ejemplo, sin embargo, no está destinado a limitar el alcance técnico de la presente invención.
EJEMPLO 1 La figura 1 muestra un sistema adecuado para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. Se sembraron 500.000 células CD34+ por mi, que fueron previamente descongeladas y purificadas, en una bolsa de teflón permeable a gas -3- (biorreactor ) que contenia 50 mi de medio de cultivo GMP comercial sintético suplementado con factores de crecimiento TPO, FLT3, SCF e IL6 a una concentración de 50 ng/ml. El cultivo se mantuvo durante 4 días, en los que la concentración de células aumentó hasta 800.000 células CD34+/ml. El día 4 se duplicó el volumen de la bolsa de cultivo -3-, ampliando la capacidad de la bolsa con la presilla de bloqueo -4-. El medio de cultivo fresco fue almacenado en la bolsa de almacenamiento -1- y se transfirió a la bolsa de cultivo abriendo la presilla reguladora de caudal -2- a través del tubo de unión -5- con la bolsa de cultivo -3-hasta duplicar el volumen inicial. Esta operación se repitió cada dos días hasta el dia 18. El día 20 se detuvo el cultivo.
Se obtuvo una ampliación del número de células con capacidad formadora de colonias . mixtas de 106 veces, eritroides 74 veces y granulociticos/macrófagos 570 veces. Se mantuvo prácticamente constante el número de células con capacidad formadora de colonias a largo plazo, que tuvieron una tasa de expansión cercana a l. La expansión de las células CD34+ fue de 200 veces, mientras que la expansión de las células mononucleares fue de 2.000 veces.
Caso 2: Expansión orientada a linaje mieloide de CMH En caso de aplicar el procedimiento descrito anteriormente empleando como factores de crecimiento G-CSF, SCF e IL-3 con el objetivo de tener una expansión madurativa de CMH, a los 20 días de cultivo se obtiene una tasa de expansión de la población de células con capacidad formadora de colonias (UFC) de aproximadamente 1.600 veces, generándose por tanto una dosis celular adecuada para su uso clínico. Si el tratamiento requiere un mayor número de células, se puede seguir repitiendo el procedimiento de duplicación del volumen cada 2 días hasta obtener la cantidad de células necesarias.
El producto obtenido por el procedimiento de la presente invención y empleando como factores de crecimiento IL-3, SCF, G-CSF consiste en un conjunto celular heterogéneo en cuanto a estado madurativo dentro del linaje hematopoyético mieloide. Las células obtenidas muestran mayoritariamente un fenotipo caracterizado por la expresión combinada de los marcadores CD34-, CD45+, CDllhigh, CD15+ y una restricción de su capacidad multi-potencial hacia linaje granulocitico/macrófago. Al inicio del cultivo el porcentaje de unidades formadoras de colonias de linaje granulocitico/macrófago supone un 35% del global la población de células con capacidad formadora de colonias mientras que al finalizar la etapa de expansión madurativa este porcentaje ha incrementado hasta el 91%. Este dato muestra la efectividad del procedimiento descrito en orientar a linaje mieloide/granulocitico las CMH.
Además el producto obtenido es adecuado para su uso en. terapia celular en el. aspecto de la bioseguridad. Las células obtenidas no presentan señales de inducción de apoptosis temprana.
El procedimiento es robusto, ya que independientemente de la pureza inicial de las células CD34+ se consigue la tasa de expansión esperada. Además, el procedimiento de la presente invención presenta una alta reproducibilidad lote á lote.
La presente invención es descrita a continuación en más detalle en referencia a un ejemplo y a un dibujo (figura 1) . Este ejemplo, sin embargo, no está destinado a limitar el alcance técnico de la presente invención.
EJEMPLO 2 La figura 1 muestra un sistema adecuado para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. Se sembraron 10.000 células CD34+ por mi, que fueron previamente descongeladas y purificadas, en una bolsa de teflón permeable a gas -3- (biorreactor ) que contenia 5 mi de medio de cultivo GMP comercial sintético suplementado con factores de crecimiento IL3, SCF y G-CSF a una concentración de 50 ng/ml. El cultivo se mantuvo durante 4 días, en los que la concentración de células aumentó hasta 50.000 células CD34+/ml. El día 4 sé duplicó el volumen de la bolsa de cultivo -3-, ampliando la capacidad de la bolsa con la presilla de bloqueo -4-. El medio de cultivo fresco fue almacenado en la bolsa de almacenamiento -1- y se transfirió a la bolsa de cultivo abriendo la presilla reguladora de caudal -2- a través del tubo de unión -5- con la bolsa de cultivo -3-hasta duplicar el volumen inicial. Esta operación se repitió cada dos días hasta el día 18. El día 20 se detuvo el cultivo.
Se obtuvo una ampliación del número de células con capacidad formadora de colonias de granulociticos/macrófagos 1.600 veces. La expansión de las células CD34+ fue de 200 veces, mientras que la expansión de las células mononucleares fue de 2.000 veces.
Si bien la invención se ha de'scrito con respecto a los ejemplos anteriores, éstos no se deben considerar limitativos de la invención, que se definirá por la interpretación más amplia de las siguientes reivindicaciones.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la expansión indiferenciada u orientada a linaje mieloide de células madre hematopoyéticas procedentes de sangre de cordón umbilical, sangre periférica movilizada o médula ósea, caracterizado porque comprende las etapas de: .) Expansión a volumen constante, en la que se siembran células CD34+, anteriormente purificadas por técnicas estándares conocidas en el estado de la técnica, tales como la selección positiva mediante perlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos contra CD34+, en un medio de cultivo sintético adecuado disponible comercialmente en el mercado, suplementado con factores de crecimiento: TPO, FLT3, SCF, IL-6 en caso de expansión indiferenciada de C H o- bien SCF, IL3, G-CSF en caso de expansión madurativa a linaje mieloide durante 4 días. El volumen inicial de la etapa a volumen constante es función de la disponibilidad de células procedentes de la purificación inicial de las células CD34+. El volumen final en la etapa de expansión a volumen constante también estará en dependencia de la densidad de siembra inicial. b) Expansión a volumen variable: en el día 4 del cultivo se añade medio fresco suplementado con factores de crecimiento: TPO, FLT3, SCF y IL-6, en caso de expansión indiferenciada de CMH o bien SCF, IL-3 y G-CSF en caso de expansión madurativa a linaje mieloide a una concentración de entre 5 y 100 ng/ml a la bolsa de cultivo hasta duplicar el volumen anterior contenido en la bolsa. Se repite dicha operación los días 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18. El cultivo se detiene a . los 20 días.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que en la etapa de expansión a volumen constante se siembran / de 100.000 a 1.000.000 de células CD34+ por mi de medio de cultivo.
« 3. Procedimiento, según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la concentración de factores de crecimiento TPO, FLT3, SCF, IL-6 en el medio de cultivo es de entre 5 y 100 ng/ml. ·
4. Procedimiento, según cualquiera de las . reivindicaciones anteriores, en el que a los 20 días de cultivo la tasa de expansión de la población CD34+ es de, como mínimo, 200 veces.
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