CN112042597B - 一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法 - Google Patents

一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112042597B
CN112042597B CN202010715441.5A CN202010715441A CN112042597B CN 112042597 B CN112042597 B CN 112042597B CN 202010715441 A CN202010715441 A CN 202010715441A CN 112042597 B CN112042597 B CN 112042597B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
mice
xenograft model
nsg
mouse
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010715441.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112042597A (zh
Inventor
朱燕萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd filed Critical Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010715441.5A priority Critical patent/CN112042597B/zh
Publication of CN112042597A publication Critical patent/CN112042597A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112042597B publication Critical patent/CN112042597B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，属于生物技术领域，包括：S1：获取单核细胞；S2：制备5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液；S3：NSG小鼠免疫模型的构建；S4：获得双人源化肿瘤异种移植模型。本发明提供的双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，采用hCD34+的脐带血造血干细胞作为免疫重建血液来源，GvHD反应小，动物存活时间长；筛选PDTX样本的标准具有生长速度快，生长大小均一的优点，具备和临床肿瘤组织学特性基本一致性的特点。

Description

一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法。
背景技术
癌症也称之为恶性肿瘤，是世界性的防治难题，并且近二十年来我国的恶性肿瘤发病率呈逐年上升趋势，目前肿瘤的主要治疗手段有手术、全身化疗、放疗、分子靶向治疗以及免疫治疗，其中肿瘤免疫治疗是继手术、放疗、化疗与分子靶向治疗后的一种新的能够改善肿瘤患者生存期的治疗方法，是一种通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的治疗方法。
自2011年FDA批准首个免疫检查点抑制剂ipilimumab应用于黑色素瘤治疗后,免疫制剂在临床上已用于非小细胞肺癌、肾癌、头颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、恶性黑色素瘤等的治疗,因此，肿瘤免疫治疗在肿瘤治疗中具有重要的研究意义和良好的应用前景。
免疫治疗在肿瘤治疗中显示出较高的抗肿瘤活性并提高生存率，但是持久的免疫反应只发生在一小部分患者中，免疫疗法需要一个功能正常的人体免疫系统的支持。基因改良的免疫缺陷小鼠PDTX模型是目前临床疗效的一线辅助评价工具，但由于其生物学和免疫学方面不符合人体微环境，具有显著免疫缺陷，因此在目前的免疫治疗背景下，它不适用于临床；另外，现有的人源化小鼠模型，其CD34+hsc细胞及接种到小鼠体内的样本，多为体外培养扩增。
因此，急需一种能够提供改良的人源化小鼠模型的双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，根据该方法获得改良的人源化小鼠模型，并将改良的人源化小鼠模型与完整肿瘤组织的人源异种移植模型(PDTX)相结合建成的双人源化小鼠模型性。
本发明提供了如下的技术方案：
一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，包括：
S1：获取单核细胞：
取新鲜脐带血，从所述新鲜脐带血中分离得到单核细胞；
S2：制备5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液：
将所述单核细胞通过CD34+微珠试剂盒分离得到CD34+HSC细胞液，将所述CD34+HSC细胞液调整至浓度为5*105cells/mL，然后将所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液保存至注射；
S3：NSG小鼠免疫模型的构建：
取3周龄且做过清髓处理的NSG小鼠，通过尾静脉注射所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液，然后在尾静脉注射后的第4周开始每隔两周对NSG小鼠进行免疫学指标检测，当NSG小鼠血液中的h CD45大于或等于25％，得到NSG小鼠免疫模型；
S4：获得双人源化肿瘤异种移植模型：
取复苏成功的样本，在小鼠身上进行传代，将传至P5代且肿瘤生长速度稳定的样本接种至所述NSG小鼠免疫模型内，得到双人源化肿瘤异种移植模型。
然后每周观察2次所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤的生长及小鼠的体重，当所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤体积达到80mm3时，即建立双人源化肿瘤异种移植模型。
优选的，所述S1中获取单核细胞的方法为：
通过合法申请获取脐带血，将新鲜脐带血在采血后24小时内送达实验室，然后用磷酸盐缓冲液1：3稀释血液，在Ficoll培养基上用密度梯度离心法分离单核细胞。
具体的步骤如下：
①按照14mL人淋巴细胞分离液Ficoll：30mL所述稀释血液，先加人淋巴细胞分离液Ficoll，后加入稀释后血液，离心30min，离心力900g，离心后移除上层血浆，留下2mL在分离界面层；
②转移所述分离界面层至新的50mL离心管，加入30mL 0.9％质量浓度的NaCl溶液，离心力400g，4℃离心5min，弃上清液，加入0.9％质量浓度的NaCl溶液，使总体积为10mL，重悬细胞；
③通过细胞计数和活力测定，取1*105个混合细胞进行流式检测；
④离心力400g，4℃离心所述重悬细胞，得到所述S2所需的新鲜分离的CD34+HSCs细胞。
脐带血是CD34+细胞的丰富来源，具有较高的增殖潜能，不易引起受体小鼠严重GVHD，更易形成功能完善的人源性免疫系统。而体外培养的人CD34+HSCs细胞没有或限制T淋巴细胞，其产量和纯度较低，增殖潜能较低，植入效率较低，T细胞功能较低，多系造血发育受限。培养的CD34+HSC也表达较少的CD34和CD133，并且他们的重组T细胞被报告为功能不活跃。此外，培养的细胞提供延迟的植入，这导致低频率分化的T细胞重新繁殖。因此，用培养的CD34+HSCs进行植入并不能形成功能完善的人源性免疫系统。
优选的，S2中所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液在温度为4℃的环境中进行保存，在该环境中有助于更好的保存CD34+HSC细胞的活性。
优选的，获取S3中所述3周龄且做过清髓处理的NSG小鼠的方法为：
用功率为100cGy/min的X射线照射三周龄NSG小鼠全身2.4min，该功率的X射线照射后的小鼠存活率较高。人免疫系统再NSG小鼠中的成功存活需要以某种方式一直宿主免疫系统预防排斥，照射抑制了宿主免疫系统，该清髓处理使动物变得暂时性或慢性免疫抑制。
优选的，尾静脉注射所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液的最佳时间为3周龄NSG小鼠照射X射线后4～24小时。
选择了NSG小鼠作为人源化小鼠免疫模型建立的首选是NSG小鼠比其他免疫缺陷小鼠模型具有以下优点：。
首先，它们在IL2受体共同γ链(IL2rγ零)中有突变，这是调节细胞因子IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21的高亲和力结合和信号传导所必需的。这种突变促进了人hspc的植入，从而重建了一个功能性的人免疫系统，该系统能够产生T细胞和B细胞依赖的免疫反应；
其次，与NOD-scid小鼠相比，NSG小鼠不发生胸腺淋巴瘤，寿命更长，并且能够在更长的时间内支持重组的人类免疫细胞。
而三周龄的NSG小鼠不再属于仔鼠，其体重和大小适宜，身体器官已经发育成熟，且在体重和体积生长上具有较大的生长空间，更加有利于后续观察小鼠体重的变化和小鼠体内肿瘤组织的体积变化。
优选的，所述S3中免疫学指标检测的方法如下：
①将尾静脉注射后的3周龄NSG小鼠断尾取血80～100μL，加入10μL EDTA抗凝；
②加入荧光标记的单克隆抗体，包括抗鼠CD45，抗人CD45,CD3,CD19,CD4,CD8；
③室温避光孵育20min，加入1mL流式细胞分析用溶血素，充分混匀；
④室温静置10min，加入2mL PBS,混匀，离心(1500rmp,5min)，弃上清液；
⑤再加入2mL PBS重悬细胞，混匀，离心(1500rmp,5min)，弃上清液；
⑥加入220μL PBS重悬细胞，进行流式检测。
当hCD45≥25％时说明人源性小鼠构建成功。
优选的，所述S4中复苏成功样本采用的是大小为2*2*2mm3且传至P5代的肿瘤组织块，进行传代的小鼠为常规免疫缺陷小鼠。
本发明的有益效果是：
目前应用于临床前的免疫系统人源化小鼠模型主要有两类，一类是将成熟的人外周血单核细胞(hPBMC)通过腹腔或者尾静脉注入免疫缺陷小鼠体内重建人的免疫系统，即hPBMC型；另一类是将人骨髓衍生的CD34+造血干细胞(HSC)通过腹腔或者尾静脉注入免疫缺陷小鼠12周后，同样实现了人类免疫系统的重建，即HSC(CD34+)型，而本发明是直接分离提取的新鲜CD34+HSCs细胞，新鲜的CD34+HSCs可在小鼠体内重建可检测的成熟人类白细胞(hCD45+)，并且不会出现移植物抗宿主病(GVHD)。同时随着时间的推移，小鼠外周血、脾脏和骨髓中重组的人类T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)细胞、树突状细胞(DC)和髓源性抑制细胞(MDSCs)增多。用本发明提及的免疫指标检测方法可以检测到小鼠体内新鲜的CD34+HSC细胞在人源化小鼠方面比体外扩增培养的同类细胞更有效；同时使用生长速度快，生长大小均一的肿瘤组织。
附图说明
图1：NSG小鼠尾端注射提取后脐带血细胞的免疫学指标检测数据表；
图2：胰腺癌肿瘤组织样本在常规免疫缺陷小鼠上进行P1传代时小鼠体内肿瘤组织生长的体积曲线图；
图3：胰腺癌肿瘤组织样本在常规免疫缺陷小鼠上进行P2传代时小鼠体内肿瘤组织生长的体积曲线图；
图4：胰腺癌肿瘤组织样本在常规免疫缺陷小鼠上进行P3传代时小鼠体内肿瘤组织生长的体积曲线图；
图5：胰腺癌肿瘤组织样本在常规免疫缺陷小鼠上进行P4传代时小鼠体内肿瘤组织生长的体积曲线图；
图6：胰腺癌肿瘤组织样本在常规免疫缺陷小鼠上进行P5传代时小鼠体内肿瘤组织生长的体积曲线图；
图7：建立成功的NSG小鼠免疫模型接种复苏成功的胰腺癌肿瘤组织样本后，小鼠体内肿瘤组织的体积数据表；
图8：根据图7的数据建立的曲线图；
图9：利用本发明提供的构建成功的双人源性小鼠进行分组给药试验后，本图为空白对照组小鼠体内肿瘤组织的体积变化数据表；
图10：利用本发明提供的构建成功的双人源性小鼠进行分组给药试验，本图为进行PD-1给药后小鼠体内肿瘤组织的体积变化数据表；
图11：利用本发明提供的构建成功的双人源性小鼠进行分组给药试验，本图为空白奥沙利铂+伊立替康+亚叶酸钙+氟尿嘧啶联合给药后小鼠体内肿瘤组织的体积变化数据表；
图12：利用本发明提供的构建成功的双人源性小鼠进行分组给药试验，本图为PD-1+奥沙利铂+伊立替康+亚叶酸钙+氟尿嘧啶联合给药后小鼠体内肿瘤组织的体积变化数据表；
图13：不同剂量X射线辐照后小鼠存活曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
以下结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
如图1-图12所示，一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，包括：
S1：获取单核细胞：
新鲜脐带血在采血后24小时内送达实验室，然后用磷酸盐缓冲液1：3稀释血液，在Ficoll培养基上用密度梯度离心法分离单核细胞；
S2：制备5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液：
将所述单核细胞通过CD34+微珠试剂盒分离得到CD34+HSC细胞液，将所述CD34+HSC细胞液调整至浓度为5*105cells/mL，然后将所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液在2-6℃的环境中保存至注射；
S3：NSG小鼠免疫模型的构建：
取3周龄且做过清髓处理的NSG小鼠，通过尾静脉注射所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液，然后在尾静脉注射后的第4周开始每隔两周对NSG小鼠进行免疫学指标检测，当NSG小鼠血液中的h CD45大于或等于25％时，得到NSG小鼠免疫模型；
S4：获得双人源化肿瘤异种移植模型：
取复苏成功的样本，在小鼠身上进行传代，将传至P5代且肿瘤生长速度稳定的样本接种至所述NSG小鼠免疫模型内，得到双人源化肿瘤异种移植模型。
然后每周观察2次所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤的生长及小鼠的体重，当所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤体积达到80mm3时，即建立双人源化肿瘤异种移植模型。
实施例2
如图1-图12所示，一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，包括：
S1：获取单核细胞：
取新鲜脐带血，从所述新鲜脐带血中分离得到单核细胞；
S2：制备5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液：
将所述单核细胞通过CD34+微珠试剂盒分离得到CD34+HSC细胞液，将所述CD34+HSC细胞液调整至浓度为5*105cells/mL，然后将所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液低温4℃保存至注射；
S3：NSG小鼠免疫模型的构建：
用功率为100cGy/min的X射线照射3周龄NSG小鼠2.4min，通过尾静脉注射所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液，然后在尾静脉注射后的4、6、8、10、12周免疫学指标检测，12周检测NSG小鼠血液中的h CD45大于25％，即得到NSG小鼠免疫模型；
S4：获得双人源化肿瘤异种移植模型：
取复苏成功的样本，在小鼠身上进行传代，将传至P5代且肿瘤生长速度稳定的样本接种至所述NSG小鼠免疫模型内，得到双人源化肿瘤异种移植模型。
然后每周观察2次所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤的生长及小鼠的体重，当所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤体积达到80mm3时，得到双人源化肿瘤异种移植模型。
实施例3
如图1-图12所示，一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，包括：
S1：获取单核细胞：
取新鲜脐带血，从所述新鲜脐带血中分离得到单核细胞；
S2：制备5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液：
将所述单核细胞通过CD34+微珠试剂盒分离得到CD34+HSC细胞液，将所述CD34+HSC细胞液调整至浓度为5*105cells/mL，然后将所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液低温4℃保存至注射；
S3：NSG小鼠免疫模型的构建：
用功率为100cGy/min的X射线照射3周龄NSG小鼠2.4min，然后NSG小鼠清髓处理6小时后通过尾静脉注射所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液，然后在尾静脉注射后的4、6、8、10、12周免疫学指标检测，
免疫学检测方法如下：
①将尾静脉注射后的3周龄NSG小鼠断尾取血80～100μL，加入10μLEDTA抗凝；
②加入荧光标记的单克隆抗体，包括抗鼠CD45，抗人CD45,CD3,CD19,CD4,CD8；
③室温避光孵育20min，加入1mL流式细胞分析用溶血素，充分混匀；
④室温静置10min，加入2mL PBS,混匀，离心(1500rmp,5min)，弃上清液；
⑤再加入2mL PBS重悬细胞，混匀，离心(1500rmp,5min)，弃上清液；
⑥加入220μL PBS重悬细胞，进行流式检测；
12周检测NSG小鼠血液中的h CD45大于25％，得到NSG小鼠免疫模型；
S4：获得双人源化肿瘤异种移植模型：
取大小为2*2*2mm3的肿瘤组织块注射至小鼠皮下进行传代培养，将传至P5代且肿瘤生长速度稳定的样本接种至所述NSG小鼠免疫模型内，得到双人源化肿瘤异种移植模型。
然后每周观察2次所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤的生长及小鼠的体重，当所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤体积达到80mm3时，即建立双人源化肿瘤异种移植模型。
实施例4
如图1所示，具体的，NSG小鼠免疫模型的构建中NSG小鼠免疫模型的选取：
取3周龄且做过清髓处理NSG小鼠十二只，依次编号为444、445、446、447、450、451、457、458、459、461、462和464，将上述十二只小鼠依次通过尾静脉注射所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞，然后在注射后8、10、12和18周免疫学指标检测这十二只小鼠的血液中hCD45的浓度，并记录检测结果，结果如表1所示，在12周时，12只小鼠血液中的hCD45大于25％。
实施例5
如图2-图6所示，S4中复苏样本的传代与选取：
使用常规免疫缺陷小鼠作为传代小鼠，取2*2*2mm3的胰腺癌肿瘤组织块注射至传代小鼠皮下，然后记录每代传代小鼠接种后体内肿瘤组织块的体积变化，当传代至P5代时，根据图2-图6的数据显示，第五代的组织样本5天成瘤，瘤体体积整体在800-1000mm3的范围内，可以得到生长速度稳定的胰腺癌肿瘤组织。
(其中，附图中788-1及788-2等均为小鼠编号，不具有其他特殊含义。)
实施例6
如图7-图8所示，取十四只S3中建立成功的NSG小鼠免疫模型，然后接种P5代复苏成功的胰腺癌肿瘤组织块2*2*2mm3，接种后记录小鼠体内肿瘤体积并根据记录的数据绘制曲线图，由图8可知，到达12天后，其中的编号456和448小鼠的肿瘤体积小于80mm3，不符合给药标准，剔除，最终得到12只达标小鼠。
实施例7
如图9-图12，用实施例6中12只达标的小鼠进行给药实验：其中：
444、458和446作为空白对照组，
464、462和445小鼠进行PD-1给药，
457、451和450小鼠进行奥沙利铂+伊立替康+亚叶酸钙+氟尿嘧啶联合给药，
459、461和447小鼠进行PD-1+奥沙利铂+伊立替康+亚叶酸钙+氟尿嘧啶联合给药
给药方式为统一在小鼠的身体右前肢进行给药，然后记录给药后的小鼠体内肿瘤组织的体积，由图中的数据可以看出给药方式PD-1+奥沙利铂+伊立替康+亚叶酸钙+氟尿嘧啶能够更好的控制胰腺癌肿瘤在小鼠体内的生长，结合该实验结果，可以在临床上对病人进行该种给药方式的治疗。
实施例8
小鼠清髓处理X射线功率的选择：
选取90只三周龄的小鼠，随机分成三组：对照组、高剂量组和低剂量组：
高剂量组：用功率为240cGy的X射线照射30只小鼠2.4min；
中剂量组：用功率为150cGy的X射线照射30只小鼠2.4min；
低剂量组：用功率为100cGy的X射线照射30只小鼠2.4min；
将上述三组小鼠在经过X射线照射后，统一接种5*105cells/mL的CD34+HSC细胞，然后观察并记录三组小鼠的存活情况：
高剂量组：小鼠接种后出现弓背怂毛，体重缓慢下降，从第五天开始出现大批量死亡；
中剂量组：小鼠接种后出现弓背怂毛，体重缓慢下降，从第8天开始持续有小鼠死亡；
低剂量组：30只小鼠存活良好。
因此，在本发明中小鼠的清髓处理中选择100cGy的照射功率能够更为有效的建立NSG小鼠免疫模型。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同替换、改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，其特征在于：包括：
S1：获取单核细胞：
取新鲜脐带血，从所述新鲜脐带血中分离得到单核细胞；
S2：制备5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液：
将所述单核细胞通过CD34+微珠试剂盒分离得到CD34+HSC细胞液，将所述CD34+HSC细胞液调整至浓度为5*105cells/mL，然后将所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液保存至注射；
S3：NSG小鼠免疫模型的构建：
取3周龄且做过清髓处理的NSG小鼠，通过尾静脉注射所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液，然后在尾静脉注射后的第4周开始每隔两周对NSG小鼠进行免疫学指标检测，当NSG小鼠血液中的hCD45大于或等于25％，得到NSG小鼠免疫模型；
S4：获得双人源化肿瘤异种移植模型：
取复苏成功的样本，在小鼠身上进行传代，将大小为2*2*2mm3，传至P5代且肿瘤生长速度稳定的样本接种至所述NSG小鼠免疫模型内，得到双人源化肿瘤异种移植模型；
所述S1中获取单核细胞的方法为：通过合法申请获取脐带血，将新鲜脐带血在采血后24小时内送达实验室，然后用磷酸盐缓冲液1：3稀释血液，在Ficoll培养基上用密度梯度离心法分离单核细胞；再从所述单核细胞分离纯化得到CD34+HSCs细胞；
所述单核细胞分离的步骤如下：
①按照14mL人淋巴细胞分离液Ficoll：30mL所述稀释血液，先加人淋巴细胞分离液Ficoll，后加入稀释后血液，离心30min，离心力900g，离心后移除上层血浆，留下2mL在分离界面层；
②转移所述分离界面层至新的50mL离心管，加入30mL 0.9％质量浓度的NaCl溶液，离心力400g,4℃离心5min，弃上清液，加入0.9％质量浓度的NaCl溶液，使总体积为10mL，重悬细胞；
③通过细胞计数和活力测定，取1*105个混合细胞进行流式检测；
④离心力400g，4℃离心所述重悬细胞，得到所述S2所需的新鲜分离的CD34+HSCs细胞；
所述S3中免疫学指标检测的方法如下：
①将尾静脉注射后的3周龄NSG小鼠断尾取血80～100μL，加入10μL EDTA抗凝；
②加入荧光标记的单克隆抗体，包括抗鼠CD45，抗人CD45,CD3,CD19,CD4,CD8；
③室温避光孵育20min，加入1mL流式细胞分析用溶血素，充分混匀；
④室温静置10min，加入2mL PBS,混匀，离心1500rmp，5min，弃上清液；
⑤再加入2mL PBS重悬细胞，混匀，离心1500rmp，5min，弃上清液；
⑥加入220μL PBS重悬细胞，进行流式检测；
所述S4中，接种P5代且肿瘤生长速度稳定的样本的NSG小鼠免疫模型，每周观察2次所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤的生长及小鼠的体重，当所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤体积达到80mm3时，即建立双人源化肿瘤异种移植模型。
2.根据权利要求1所述的一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，其特征在于：S2中所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液在温度为4℃的环境中进行保存。
3.根据权利要求1所述的一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，其特征在于，获取S3中所述3周龄且做过清髓处理的NSG小鼠的方法为：
用功率为100cGy/min的X射线照射三周龄NSG小鼠全身2.4min。
4.根据权利要求1所述的一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，其特征在于：尾静脉注射所述5*105cells/mL的CD34+HSC细胞液的最佳时间为3周龄NSG小鼠照射X射线后4～24小时。
CN202010715441.5A 2020-07-22 2020-07-22 一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法 Active CN112042597B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010715441.5A CN112042597B (zh) 2020-07-22 2020-07-22 一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010715441.5A CN112042597B (zh) 2020-07-22 2020-07-22 一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112042597A CN112042597A (zh) 2020-12-08
CN112042597B true CN112042597B (zh) 2022-04-29

Family

ID=73602795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010715441.5A Active CN112042597B (zh) 2020-07-22 2020-07-22 一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112042597B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113424799B (zh) * 2021-06-28 2022-09-02 中国人民解放军陆军特色医学中心 一种基于成骨龛微环境修饰的pdx模型的构建方法及应用
CN115910214B (zh) * 2022-10-13 2023-10-13 南京普恩瑞生物科技有限公司 一种利用肿瘤活组织生物样本库模拟临床试验评估抗肿瘤药物药效的方法及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4563573B2 (ja) * 2000-12-07 2010-10-13 株式会社カネカ 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体
US7332334B2 (en) * 2003-04-18 2008-02-19 Oklahoma Medical Research Foundation Hematopoietic stem cells treated by in vitro fucosylation and methods of use
CN101310007A (zh) * 2005-04-19 2008-11-19 约翰·霍普金斯大学 使用来自脐带血的基质细胞将来自脐带血的有核细胞增量(expanding)及移植(engrafting)的方法
BRPI0819887A2 (pt) * 2007-12-06 2017-05-23 Csl Ltd métodos e agentes para inibição de celulas-tronco leucêmicas, e para o tratamento de uma condição de câncer hematológico em um paciente, e, uso de uma molécula de ligação a antigeno
JP2012531896A (ja) * 2009-06-29 2012-12-13 チェン，チンフェン ヒト化非ヒト哺乳動物を製造する方法
JP2012531894A (ja) * 2009-06-29 2012-12-13 レスコフ，イリヤ，ビー． ヒト血液癌の非ヒト哺乳動物モデル
ES2336637B1 (es) * 2009-11-02 2011-01-21 Banc De Sang I Teixits Procedimiento parala expansion indiferenciada u orientada a linaje mieloide de celulas madre hematopoyeticas procedentes de sangre de cordonumbilical, sangre periferica movilizada o medula osea.
CN102080065A (zh) * 2010-12-09 2011-06-01 协和干细胞基因工程有限公司 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用
SG11201402112RA (en) * 2011-12-06 2014-09-26 Massachusetts Inst Technology Use of humanized mice to determine toxicity
CN104313054A (zh) * 2014-09-24 2015-01-28 中国人民解放军第三军医大学 表达人外源胰岛素原的人造血干细胞及其应用
CN104771240A (zh) * 2015-03-30 2015-07-15 南京普恩瑞生物科技有限公司 肿瘤模型及其制备方法、利用该肿瘤模型筛选抗肿瘤治疗方案的方法
CN107137425B (zh) * 2017-05-22 2021-04-13 湖南昭泰生物医药有限公司 一种循环肿瘤细胞小鼠模型、其构建方法及应用
CN110115248A (zh) * 2018-02-07 2019-08-13 南京普恩瑞生物科技有限公司 一种生长抑素基因缺陷的免疫缺陷小鼠、其制备方法及其用途
CN109022362B (zh) * 2018-08-02 2022-01-25 武汉大学 一种高白细胞性白血病pdx模型的建立方法
CN110476892A (zh) * 2019-09-09 2019-11-22 中南大学湘雅二医院 一种骨肉瘤异种移植小鼠模型的构建方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112042597A (zh) 2020-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112042597B (zh) 一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法
CN105176927A (zh) 一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤nk/cik细胞的制备方法
EP2878666B1 (en) Industrial preparation of natural killer cells (nks) and injection using human allogeneic karyocytes
JP3619853B2 (ja) ナチュラルキラー細胞の増殖方法
CN112243954A (zh) 一种粒细胞肿瘤的pdx模型建立方法
CN104262459A (zh) 一种急性单核细胞白血病相关抗原mlaa-34 表位多肽及其疫苗和制药应用
CN117025530B (zh) 用肿瘤坏死因子受体超家族激动剂扩增肿瘤浸润淋巴细胞（til）的方法
CN102065871A (zh) 用于诱导移植耐受的干细胞组合物
CN1291105A (zh) 半抗原修饰的肿瘤细胞膜和制备及应用半抗原修饰的肿瘤细胞膜的方法
Metheny III et al. Intra-osseous co-transplantation of CD34-selected umbilical cord blood and mesenchymal stromal cells
Handgretinger et al. Ex vivo and in vivo T-cell depletion in allogeneic transplantation: towards less or non-cytotoxic conditioning regimens
CN105219727A (zh) 一种用于激活结直肠癌特异性免疫反应的试剂盒
Mohamed et al. Stem-cell therapy with bone marrow (hematopoietic) stem cells for intestinal diseases
Hays et al. Growth of normal hemopoietic cells in cultures of bone marrow from leukemic mice
US20230112372A1 (en) Primatized rodent
Watanabe et al. Establishment of T-cell clones recognizing difference in H-2K antigen and inducing graft-versus-host disease
EP2442837B1 (en) Bone marrow extracellular matrix extract and therapeutic use thereof
Tian et al. A clinical trial of cytokine induced killer cells treating patients with malignant tumor after radiochemotherapy
Tian et al. Induction of transplantation tolerance by combining non-myeloablative conditioning with delivery of alloantigen by T cells
Ikehara Innovative BMT methods for intractable diseases
CN105219714A (zh) 一种用于激活肺癌特异性免疫反应的试剂盒
CN111643525A (zh) 引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用及其方法
CN116254226A (zh) 具有使nk和cik细胞活性增强的高效靶向杀伤功能的制备方法
CN111733130A (zh) 一种诱导dc-cik扩增的培养方法
CN102336821B (zh) Melan-A表位肽及其在预防和/或治疗肿瘤中的用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant