CN102336821B - Melan-A表位肽及其在预防和/或治疗肿瘤中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的Melan-A表位肽及其在预防和/或治疗肿瘤中的用途。具体而言，本发明公开了新的MHC-II类限制性Melan-A表位肽及使用所述表位肽制备对Melan-A具有特异性反应性的CD4⁺T淋巴细胞的方法。本发明还公开了在MHC-II类限制性下识别所述Melan-A表位肽的CD4⁺T淋巴细胞以及这些细胞在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的用途。本发明还涉及包括上述Melan-A表位肽的用于治疗或预防肿瘤的疫苗。

Description

Melan-A表位肽及其在预防和/或治疗肿瘤中的用途

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，具体涉及肿瘤特异性抗原Melan-A的表位肽及其在预防和/或治疗肿瘤中的用途。 

背景技术

免疫系统是人体抵御肿瘤的重要屏障。各种因素导致的肿瘤，如由于化学致癌剂或病毒导致的肿瘤，会使得肿瘤细胞出现表达突变蛋白、异位表达蛋白、正常蛋白表达水平过高和表达病毒蛋白等现象。在正常的免疫系统中，机体的免疫细胞可能会识别并清除这些异常细胞，从而使机体免于罹患肿瘤。而长期处于免疫抑制状态的人群，如器官移植、艾滋病患者等，肿瘤的发病率要远远高于正常人群。过继性T细胞免疫治疗则是肿瘤免疫治疗中的重要手段之一，专指向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接或通过激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，以达到治疗目的的治疗方法(Nat Rev Cancer，2008.8(4)：299-308)。输注的细胞包括LAK、NK细胞、T淋巴细胞等。在一定的条件下，这些方法都获得了一定程度上的成功。如NK细胞在造血干细胞移植后的抗白血病效应，美国癌症协会(NCI)Rosenberg SA教授领导下进行的肿瘤浸润淋巴细胞对黑色素瘤的治愈率可以达到50％以上(Science，2002.298(5594)：850-854)。 

近年来，随着一系列被CD4⁺T细胞识别的肿瘤抗原的鉴定，人们对于CD4⁺T细胞在抗肿瘤免疫反应中的作用有了更进一步的认识。但CD4⁺T淋巴细胞运用于过继性免疫治疗中的例子并不多。CD4⁺T淋巴细胞虽然不同于细胞毒性T淋巴细胞(在胞浆内含有穿孔素和颗粒酶等效应分子)，但在识别靶细胞后，却可以分泌大量的IFN-γ、IL-2等Th1类细胞因子。这些细胞因子不仅可以通过自分泌或旁分泌的方式为其它淋巴细胞提供生长因子，增强免疫提呈和淋巴细胞活化，而且可以直接促进肿瘤细胞的凋亡(Curr Opin Immunol，2004.16(3)：259-63)。CD4⁺T细胞在机体抗肿瘤免疫反应中起着重要的作用，同时激活CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞是免疫治疗的理想 策略。 

Melan-A为人类黑色素细胞分化抗原，表达于正常的黑色素细胞及几乎所有黑色素瘤患者的肿瘤细胞，而在其它组织中不表达(Melanoma Res，1998.8(4)：337-43)。Melan-A为黑色素瘤相关抗原中抗原性较强的一种，最易被体外黑色素瘤特异性多肽所激活的外周血淋巴细胞及肿瘤浸润淋巴细胞所识别。在Melan-A上有数个免疫优势表位，它们能在体内外诱导产生特异性T淋巴细胞免疫应答，因而在黑色素瘤特异性免疫治疗方面有着广阔的应用前景。 

发明概述 

本研究以亚洲人群为研究对象，通过合成长度为30个氨基酸，重叠部分为20个氨基酸的肽段覆盖Melan-A蛋白全长，在体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC)，产生对Melan-A特异性反应的CD4⁺T淋巴细胞，从而鉴定出新的MHC-II类限制性Melan-A表位肽。该表位肽可用于体外刺激产生对Melan-A具有特异性反应性的CD4⁺T淋巴细胞。这些抗原特异性细胞，在接受抗原刺激后可以分泌大量可以直接或间接杀伤肿瘤细胞的细胞因子，因此能用于对表达Melan-A的肿瘤的过继性免疫治疗。该表位肽还可以用作预防和/或治疗表达Melan-A的肿瘤的疫苗。 

因此，在一个方面，本发明提供了新的MHC-II类限制性Melan-A表位肽。 

在另一个方面，本发明提供了制备对Melan-A具有特异性反应性的CD4⁺T淋巴细胞的方法。 

本发明还提供了识别本发明的Melan-A表位肽并在识别后发生特异性反应的CD4⁺T淋巴细胞以及这些细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物组合物中的用途。 

最后，本发明还提供了包括本发明的Melan-A表位肽的用于预防和/或治疗肿瘤的疫苗。 

附图说明

图1：显示来自健康供者106(HD106)的外周血单个核细胞经Me1an-A混合肽刺激两周后出现对Melan-A的特异性反应。 

图2：显示来自HD106的对Melan-A具有特异性反应性的5号单克隆CD4⁺T细胞对Melan-A_21-50的特异性反应。 

图3：来自HD106的5号单克隆CD4⁺T细胞对已知Melan-A表位肽的识别。 

图4：显示不同HLA阻断抗体对HD106的5号单克隆CD4⁺T细胞特异性反应的影响。 

图5：来自HD106的5号单克隆CD4⁺T细胞对来源于不相关的健康供者(HD)的抗原提呈细胞所提呈的Melan-A_21-50的反应。 

图6：以来源于不相关的健康供者(HD)的抗原提呈细胞进行的HLA-DPB1高分辨分型检测结果。 

图7：来自HD106的5号单克隆CD4⁺T细胞识别天然Melan-A表位。 

发明详述 

本发明提供了分离的Melan-A表位肽，其由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成。本发明的Melan-A表位肽是新的MHC-II类限制性表位肽，其能在HLA-DP限制性条件下被CD4⁺T淋巴细胞特异性识别，具体地，本发明的Melan-A表位肽是HLA-DPB1*0501限制性表位肽。 

本文中，“表位肽”指的是包含抗原表位，在特定MHC限制性下能引起免疫反应的多肽或肽段。可以通过任何已知的制备多肽的方法获得本发明的分离的表位肽。例如本发明的分离的表位肽可以是合成的，如通过常规化学方法合成，这样的合成可以通过商业定制进行(如北京华大中生科技发展有限公司)。也可以通过基因工程方法得到本发明的分离的表位肽，如将编码表位肽的核酸序列插入合适表达载体中并转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，然后从培养物中回收表位肽。考虑到获得的方便性和纯度，本发明的表位肽优选是合成的。 

本发明还提供了一种制备对Melan-A具有特异性反应性的CD4⁺T淋巴细胞的方法，包括以下步骤： 

a)将起始细胞与本发明的Melan-A表位肽在抗原提呈细胞存在的条件下在培养基中共培养；和 

b)分离发生特异性反应的CD4⁺T淋巴细胞。 

本文中，“起始细胞”和“含有CD4⁺T淋巴细胞的起始细胞”可互换 使用。含有CD4⁺T淋巴细胞的起始细胞可以有多种来源，例如外周血单个核细胞、脐带血细胞和骨髓细胞等等。起始细胞也可以是上述来源的细胞经体外扩增所获得的细胞。可以通过任何合适的方法提高起始细胞中CD4⁺T淋巴细胞的含量。例如，外周血单个核细胞可以使用Ficoll-Hypaque(如GE Healthcare，Cat No.17-5442-03，密度为1.077g/ml)密度梯度离心法获得。优选地，起始细胞是从外周血单个核细胞分离的CD4⁺T淋巴细胞。可以采用免疫磁珠法(如美天旎CD4⁺磁珠(Cat No.130-045-101))从外周血单个核细胞分离CD4⁺T淋巴细胞。 

在本发明的制备方法中，“抗原提呈细胞”包括能够将抗原提呈至CD4⁺T淋巴细胞的任何细胞，其可以用本领域技术人员熟知的方法制备。在一个实施方案中，外周血单个核细胞分离出CD4⁺T淋巴细胞后的剩余细胞用剂量为2000-3000cGy的γ射线源照射后作为抗原提呈细胞。在另一个实施方案中，外周血单个核细胞分离出CD4⁺T淋巴细胞后的剩余细胞用丝裂霉素C处理后作为抗原提呈细胞。 

在本发明的制备方法中，步骤a)中的培养基可以是任何适于培养淋巴细胞的培养基，例如：IMDM培养基或IMSF培养基。优选的培养基是IMSF(Immunotech公司，产品号e108-11r)培养基。本领域技术人员应当清楚，在细胞培养过程中可以加入细胞因子并根据需要调整培养基中细胞因子的量或更新培养基以保证细胞正常生长。优选加入的细胞因子是IL-2和IL-7。例如，可以加入1-500U/ml的IL-2和1-100mg/ml的IL-7。 

此外，本领域技术人员应当了解，为了增强对淋巴细胞的刺激，步骤a)中的共培养可以包括重复添加抗原提呈细胞和本发明的Melan-A表位肽。 

CD4⁺T淋巴细胞对Melan-A的特异性反应包括分泌Th1类细胞因子。在一个具体实施方案中，所述特异性反应包括分泌IFN-γ、IL-2和IL-8。 

因此，对Melan-A发生特异性反应的CD4⁺T淋巴细胞的分离可以首先通过检测特定细胞因子的分泌而确定存在所述细胞，其次针对该特定细胞因子分离发生特异性反应的CD4⁺T淋巴细胞。其中所述特定细胞因子包括Th1类细胞因子，优选IFN-γ、IL-2、和IL-8，最优选IFN-γ。在一个具体的实施方案中，采用BD Pharmingen公司Perm/Fixing相应试剂和抗体，依照说明书进行细胞表面及细胞内IFN-γ/CD4染色，检测发生特异性反应的CD4⁺T淋巴细胞；然后采用美天旎公司IFN-gamma分离试剂盒 (130-054-201)分离IFN-γ分泌细胞。在另一个实施方案中，使用流式细胞术分离细胞。 

本发明的制备对Melan-A具有特异性反应性的CD4⁺T淋巴细胞的方法还可以进一步包括获得对Melan-A具有特异性反应性的CD4⁺T淋巴细胞的单克隆细胞。在一个具体实施方案中，所述单克隆细胞通过本领域技术人员熟知的有限稀释法获得。 

本发明还提供了特异性识别本发明的Melan-A表位肽的分离的CD4⁺T淋巴细胞。这些CD4⁺T淋巴细胞可以在识别所述表位肽后发生特异性反应，例如大量分泌可以直接或间接杀伤肿瘤细胞的Th1类细胞因子。在一个具体实施方案中，这些细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-8。这些细胞可以通过上面所述的方法制备。 

因此，本发明还提供了这些细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物组合物中的用途，具体地，所述肿瘤为黑色素瘤。优选地，所述药物组合物还可以包括药物学可接受的载体，如生理盐水等。本领域技术人员能够合理地预期这些细胞输入患者体内，在识别肿瘤细胞表达的Melan-A抗原后，可以大量分泌可以直接或间接杀伤肿瘤细胞的细胞因子，达到肿瘤治疗的目的。 

同样，本发明还提供了包括本发明的Melan-A表位肽的疫苗，其还包括合适的佐剂，如基于氢氧化铝的佐剂等。所述疫苗可以在体内刺激产生识别Melan-A抗原并发生特异性反应的CD4⁺T淋巴细胞，起到预防和/或治疗肿瘤如黑色素瘤的目的。 

可用任何安全途径为患者提供本发明的药物组合物或疫苗。可使用例如肠外注射，静脉内，关节内，肌肉内，真皮内与皮下的注射等及其类似途径。例如，静脉内注射较适合于本发明的药物组合物的施用，而肌肉内与皮下注射较适合于本发明疫苗的施用。 

可以以药物有效量施用本发明的药物组合物或疫苗。在本发明中，对患者施用的剂量指在施用一段适当时间后足以在患者身上产生有利的应答的剂量。施用剂量应由医师判断，视施用对象的各种因素而定，如年龄，性别，体重及其一般健康状况等。 

实施例 

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。 

实施例1：产生Melan-A特异性CD4⁺T淋巴细胞 

合成Melan-A重叠肽 

通过商业定制(北京华大中生科技发展有限公司)按照常规化学合成方法合成Melan-A重叠肽，每个肽段长度为30个氨基酸，重叠部分为20个氨基酸，覆盖Melan-A蛋白全长。所合成的肽段序列列于表1，肽编号的数字对应Melan-A上氨基酸位置。 

表1 

序列号	肽编号	肽序列
			SEQ ID NO：1	Melan-A1-30	MPREDAHFIY  GYPKKGHGHS  YTTAEEAAGI
SEQ ID NO：2	Melan-A 11-40	GYPKKGHGHS  YTTAEEAAGI  GILTVILGVL
			SEQ ID NO：3	Melan-A 21-50	YTTAEEAAGI  GILTVILGVL  LLIGCWYCRR
SEQ ID NO：4	Melan-A 31-60	GILTVILGVL  LLIGCWYCRR  RNGYRALMDK
			SEQ ID NO：5	Melan-A 41-70	LLIGCWYCRR  RNGYRALMDK  SLHVGTQCAL
SEQ ID NO：6	Melan-A 51-80	RNGYRALMDK  SLHVGTQCAL  TRRCPQEGFD
			SEQ ID NO：7	Melan-A 61-90	SLHVGTQCAL  TRRCPQEGFD  HRDSKVSLQE
SEQ ID NO：8	Melan-A 71-100	TRRCPQEGFD  HRDSKVSLQE  KNCEPVVPNA
			SEQ ID NO：9	Melan-A 81-110	HRDSKVSLQE  KNCEPVVPNA  PPAYEKLSAE
SEQ ID NO：10	Melan-A 91-118	KNCEPVVPNA PPAYEKLSAE  QSPPPYSP

制备人外周血单个核细胞 

运用无菌Ficoll-Hypaque(密度为1.077g/ml)(GE HealthGare，Cat No.17-5442-03)，采用密度梯度离心法，参照产品说明书从来自健康供者(已签署知情同意书)的外周血分离外周血单个核细胞(PBMC)。分离后细胞用PBS(pH 7.4)洗涤细胞两次后，最终用30ml PBS(含2mM EDTA，0.25％HSA，pH7.4)重悬，计数，离心洗涤细胞一次。 

从人外周血单个核细胞分离CD4⁺细胞 

采用美天旎CD4⁺磁珠(Cat No.130-045-101)及相应分离器、分离柱， 按说明书分离CD4⁺细胞。留取分离前、分离后样品进行流式检测分离纯度及分离效率。 

用混合肽刺激培养CD4⁺细胞 

获得的CD4⁺细胞液经离心后，用IMSF培养基(Immunotech公司，产品号e108-11r)将细胞密度调节至2×10⁷细胞/ml。取约2倍量CD4^-细胞用剂量为2000-3000cGy的γ射线源(温州三和科技发展有限公司，XF3500型)照射。将照射后的细胞洗涤一次，用IMSF培养基将细胞密度调节至2×10⁷细胞/ml，作为抗原提呈细胞。取同等体积CD4⁺细胞和射线处理过的抗原提呈细胞混合，加入等量混合的Melan-A合成肽至终浓度为2μM(每种)，IL-2(100000U/ml)20U/ml，IL-710ng/ml。接种入96孔U底板中，每孔100μl。37℃，5％CO₂条件下培养24小时。第二天每孔补入含IL-7(终浓度为20ng/ml)及IL-2(终浓度为100U/ml)的IMSF培养基100μl。继续培养48小时。此后每隔二到三天补充细胞因子一次。第6-8天再次加入合成肽及抗原提呈细胞(加入的量同第一次刺激时加入的量)，刺激培养一次。检测CD4⁺细胞的特异性反应 

取少量细胞，用IMSF培养基洗涤一次，加入三支细胞培养管中，每管约5×10⁵细胞，补充IMSF培养基至1ml，其中一管加入Melan-A混合肽(终浓度2μM)，一管加入佛波酯(浓度1mg/ml)(PMA)1μl，离子霉素(浓度250μg/ml)1μl做为阳性对照，另一管加入DMSO做为阴性对照。每管再加入Golgi Stop(按BD Pharmingen公司Perm/Fixing试剂盒说明书添加)0.7μl。37℃，5％CO₂条件下培养4小时。采用BD Pharmingen公司Perm/Fixing试剂盒(产品号554724)相应试剂，抗体及说明书，进行细胞表面及细胞内IFN-γ/CD4染色。 

结果如图1所示，来自健康供者106(HD106)的外周血单个核细胞经Melan-A混合肽刺激两周后出现对Melan-A的特异性反应，表明所合成Melan-A肽段中存在能够被CD4⁺T淋巴细胞识别并引起CD4⁺T淋巴细胞特异性反应的表位肽。 

实施例2：鉴定新的Melan-A表位肽 

分离发生特异性反应的CD4⁺T细胞 

检测到CD4⁺IFN-γ⁺细胞后，次日在已经接种入24孔板的CD4⁺细胞中每孔加入Melan-A混合肽至2μM，37℃，5％CO₂条件下培养3小时15分钟。按美天旎公司IFN-γ分选试剂盒(130-054-201)说明书分离IFN-γ分泌细胞。部分细胞采用流式分选的方法，按每10⁷细胞加入80μl预冷缓冲液重悬细胞，加入适量荧光标记抗CD4抗体(Beckman Coulter，IM2636U)，再次洗涤后，用适量洗液重悬后用流式细胞仪(eytomation公司，moflo)进行分选。 

有限稀释法获得对Melan-A发生特异性反应的单克隆CD4⁺T细胞 

将分离得到的CD4⁺IFN-γ⁺细胞用适量培养基(含10％人血清IMSF培养基)重悬，并通过系列稀释，用培养基将细胞密度稀释至0.6细胞/10μl。将自体或异体PBMC采用γ射线照射5000cGy，并用培养基将细胞密度调节至10⁶细胞/ml，加入PHA(植物凝集素，Sigma-Aldrich公司，L 9132)至终浓度为2μg/ml，IL-2至200U/ml，与等体积CD4⁺IFN-γ⁺细胞混匀，接种入Terasaki板中，每孔20μl，5％二氧化碳，37℃培养72-96小时。3-4天后观察Terasaki板中各孔细胞生长情况，将有细胞克隆形成的孔中的内容物完全吸出，移至96孔U底板中，每孔再补入200μl含100U/ml的IL-2、10ng/mlIL-7的含5％或10％人AB血清的IMSF培养基。每48小时向96孔U底板补充IL-2和IL-7及新鲜含10％人AB血清的IMSF培养基。直至细胞生长至较多数量，2×10⁵细胞/孔。 

检测单克隆CD4⁺IFN-γ⁺细胞对肽段的特异性反应 

将获得的单克隆细胞在24孔板培养。已经长满24孔板孔底的细胞全部吸入一支15ml离心管中，并用IMSF培养基洗涤孔底一次，将洗液一并转入离心管中，混匀，吸取少量细胞悬液计数。随后300g离心10min，弃掉上清液，用IMSF培养基将细胞密度调节至1×10⁵细胞/ml。接种入96孔U底板中，每孔100μl(10⁴细胞/孔)。 

使用实施例1中合成的Melan-A不同肽段和混合的重叠肽，检测单克隆细胞对肽段的特异性反应。用IMSF培养基将所述各种肽稀释至4μM， 对应接种入已经接种细胞的孔中，每孔100μl。剩余一孔加100μl培养基作为细胞空白对照，另设培养基空白对照，加入培养基200μl。37℃，5％CO₂条件下培养20h。 

使用IFN-γELISA检测试剂盒(Human IFN-γELISA KIT 96T(DKW22-1000-096))，按说明书检测细胞产生的IFN-γ。比较Melan-A特异性单克隆CD4⁺细胞对不同肽段的反应，即IFN-γ含量的不同。图2显示了来自健康供者HD106的5号单克隆细胞对Melan-A_21-50产生特异性反应Melan-A特异性单克隆CD4⁺T细胞对已知表位肽的识别 

在http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm网站检索Melan-A蛋白序列中已知表位，发现Melan-A_21-50包含两个表位肽，Melan-A_25-36及Melan-A_27-40，这两个表位肽也是HLA-II类分子限制性的。为了验证HD106的5号单克隆细胞所识别的Melan-A表位与已知表位不相同，进一步合成了上述2段已知表位肽，检测Melan-A特异性单克隆CD4⁺T细胞对已知表位肽是否具有反应性。用IMSF培养基将单克隆CD4⁺T细胞密度调节至1×10⁵细胞/ml。接种入96孔圆底板中，每孔100μl(10⁴细胞/孔)。用IMSF培养基将Melan-A_21-50肽段及已知表位肽浓度稀释至4μmol/L，对应接种入已经接种细胞的孔中，每孔100μl，工作浓度为2μmol/L。设立DMSO阴性对照孔。另设细胞空白对照及培养基空白对照孔。37℃，5％CO2条件下培养约24h。收集上清，按达科为ELISA检测试剂盒操作说明检测其中IFN-γ浓度。结果如图3所示，Melan-A特异性单克隆CD4⁺细胞在Melan-A_25-36及Melan-A_27-40的刺激下无明显IFN-γ分泌。 

根据以上实验结果，我们获得了来源于健康供者HD106的单克隆CD4⁺IFN-γ⁺细胞，其对Melan-A_21-50产生特异性反应，表明Melan-A_21-50肽段是能够被CD4⁺细胞特异性识别的表位肽；其对Melan-A_21-50中所包含的2个已知HLA-II类分子限制性表位肽无反应性，表明Melan-A特异性单克隆CD4⁺细胞所识别的Melan-A_21-50表位肽为新的Melan-A表位肽。 

实施例3：分析新表位肽的HLA-II类分子限制性 

HLA-II类分子功能阻断实验 

用IMSF培养基将5号单克隆CD4⁺T细胞密度调节至2×10⁵细胞/ml。 接种入96孔圆底板中，每孔50μl(10⁴细胞/孔)。用IMSF培养基将HLA-ABC(BD公司，555551)、HLA-DR(BD公司，347360)、HLA-DP(abcam公司，752191)及HLA-DQ(abcam公司，787516)功能阻断抗体稀释至2μg/ml，对应接种入已经接种细胞的孔中，每孔100μl，工作浓度为1μg/ml。37℃，5％CO₂条件下孵育1小时。设立不加阻断抗体封闭对照孔。用IMSF培养基将Melan-A_21-50稀释至8μmol/L，在上述加入阻断抗体及不加阻断抗体孔每孔加入50μl，工作浓度为2μmol/L。另设以等量DMSO替代Melan-A_21-50的阴性对照孔、细胞空白对照及培养基空白对照孔。37℃，5％CO₂条件下培养24h。收集上清，ELISA法检测其中IFN-γ浓度。 

图4显示HLA-II、HLA-DP阻断抗体抑制5号单克隆细胞对Melan-A_21-50肽段的特异性反应。结果表明Melan-A_21-50肽段是HLA-DP限制性的。这是首个被鉴定的HLA-DP限制性Melan-A表位肽。 

根据“肿瘤免疫表位肽库”的统计，本研究之前已发现的Melan-AMHC-II类分子限制性表位共7个，分别为HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0102、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DR11(包括DRB1*1101及DRB1*1104)、HLA-DR52(即HLA-DRB2*0202)及HLA-DQB1*0602限制性。由于这些表位多数为欧、美洲研究人员所发现，被研究人群为欧、美人群，故在免疫治疗的应用方面，这些表位更适用于欧、美人群，而不适用于亚洲人群，因为涉及这些表位的限制性MHC-II类分子等位基因在欧、美人群中表达比例较高，而在亚洲人群中表达比例相对较低(Brain，1999.122(Pt9)：1689-1696)。本发明发现的HLA-DP限制性Melan-A表位肽更适用于亚洲人群。 

交叉提呈实验 

复苏已知HLA分型健康人供者的PBMC，用2ml培养基重悬后，分为两部分，每部分1ml。其中一部分加入Melan-A_21-50肽段至终浓度为2μM，做为抗原提呈细胞，另一部分加入相应量的DMSO作为不加肽对照。37℃，5％二氧化碳条件下孵育2小时。用多聚甲醛固定5分钟，用10倍以上体积PBS洗涤细胞三次。将洗涤后的细胞用IMSF培养基重悬，将其细胞密度调节至2×10⁵细胞/ml。将这些细胞与Melan-A肽段特异性5号单克隆CD4⁺T细胞在37℃，5％二氧化碳条件下混合培养20小时，吸取上清用ELISA法 检测上清中IFN-γ。 

高分辨率HLA分型检测结果显示只有来源于含有HLA-DPB1*0501等位基因的个体的抗原提呈细胞才能将Melan-A_21-50肽段提呈至5号单克隆CD4⁺T细胞。因此，Melan-A_21-50是HLA-DPB1*0501限制性的表位肽(图5和图6)。 

实施例4：检测对Melan-A_21-50肽段的特异性反应 

将上述的5号单克隆细胞在24孔板培养。已经长满24孔板孔底的细胞全部吸入一支15ml离心管中，并用IMSF培养基洗涤孔底一次，将洗液一并转入离心管中，混匀，吸取少量细胞悬液计数。随后300g离心10min，弃掉上清液，用IMSF培养基将细胞密度调节至1×10⁵细胞/ml。接种入96孔U底板中，每孔100μl(10⁴/孔)。 

用IMSF培养基将所述Melan-A_21-50肽段稀释至4μM，，接种入已经接种细胞的孔中，每孔100μl。剩余一孔加100μl培养基作为细胞空白对照，另设培养基空白对照，加入培养基200μl。37℃，5％CO₂条件下培养24h。 

以培养24小时后的细胞培养上清液为样本，采用Bender Flowcytomix Human Th1/Th2分析试剂盒，按说明书中方法用流式细胞仪检测细胞培养上清中可溶性细胞因子的浓度。 

结果显示上述获得的单克隆CD4⁺T细胞在再次识别Melan-A_21-50肽段后可以大量分泌IFN-γ、IL-2和IL-8等细胞因子(表2)。这些细胞因子在肿瘤的预防和/或治疗中起重要作用。 

表2健康供者HD106的Melan-A特异性单克隆CD4⁺T细胞分泌的细胞因子 

注：表中细胞因子浓度单位为pg/ml。 

实施例5：Melan-A特异性CD4⁺T细胞对Melan-A天然表位的识别 

自健康供者HD106外周血单个核细胞分选获得CD14⁺T细胞，于含有IL-4(1000IU/ml)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(1000IU/ml)及10％胎牛血清的IMDM培养基(GIBCO公司，21056023)中培养至第5天，加入原核表达的Melan-A蛋白(10mg/L)，同时设立无关蛋白NY-ESO-1对照及树突状细胞空白对照，培养过夜后加入1000IU/ml TNF-α促进树突状细胞成熟，继续培养24h。 

离心收集前面获得的Melan-A特异性单克隆CD4⁺T细胞，重悬于IMSF培养基中，以10⁴细胞/孔接种于96孔圆底培养板中。同样收集树突状细胞，10⁴细胞/孔，与Melan-A特异性单克隆CD4⁺T细胞混合。设立Melan-A混合肽阳性对照、T细胞空白对照及培养基空白对照，培养24h。收集上清，按达科为ELISA检测试剂盒操作说明检测其中IFN-γ浓度。 

结果如图7所示，Melan-A特异性单克隆CD4⁺T细胞在树突状细胞提呈的Melan-A重组蛋白的刺激下所分泌的IFN-γ浓度，与阳性对照组中在Melan-A混合多肽直接刺激下所分泌的IFN-γ浓度基本一致；Melan-A特异性单克隆CD4⁺T细胞不能识别阴性对照组中树突状细胞提呈的无关蛋白NY-ESO-1。综合以上结果可知，Melan-A特异性单克隆CD4⁺T细胞可识别树突状细胞提呈的Melan-A天然表位，在其刺激下能特异性地分泌高浓度的IFN-γ。 

Claims (12)

1.分离的Melan-A表位肽，其在HLA-DP限制性条件下被CD4⁺T淋巴细胞特异性识别，所述表位肽由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成。

2.权利要求1的分离的Melan-A表位肽，其中所述HLA-DP限制性是HLA-DPB1*0501限制性。

3.一种制备对Melan-A具有特异性反应性的CD4⁺T淋巴细胞的方法，包括以下步骤：

a)将含有CD4⁺T淋巴细胞的起始细胞与权利要求1或2的分离的

Melan-A表位肽在抗原提呈细胞存在的条件下在培养基中共培养；和

b)分离发生特异性反应的CD4⁺T淋巴细胞；

其中所述特异性反应包括分泌Th1类细胞因子。

4.权利要求3的方法，其中所述起始细胞为人外周血单个核细胞。

5.权利要求3的方法，其中所述起始细胞为从人外周血单个核细胞分离的CD4⁺T淋巴细胞。

6.权利要求3-5任一项的方法，其中所述Th1类细胞因子选自IFN-γ、IL-2和IL-8。

7.分离的CD4⁺T淋巴细胞，其特异性识别权利要求1或2的Melan-A表位肽，并能够在识别后发生特异性反应，所述特异性反应包括分泌Th1类细胞因子。

8.权利要求7的分离的CD4⁺T淋巴细胞，其中所述Th1类细胞因子选自IFN-γ、IL-2和IL-8。

9.权利要求7或8的分离的CD4⁺T淋巴细胞，其通过权利要求3-6任一项的方法制备。

10.权利要求7-9任一项的分离的CD4⁺T淋巴细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物组合物中的用途。

11.权利要求10的用途，其中所述药物组合物还包括药物学可接受的载体。

12.用于预防和/或治疗肿瘤的疫苗，其包括权利要求1或2的Melan-A表位肽和佐剂。