CN102080065A - 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 - Google Patents
一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102080065A CN102080065A CN 201010580960 CN201010580960A CN102080065A CN 102080065 A CN102080065 A CN 102080065A CN 201010580960 CN201010580960 CN 201010580960 CN 201010580960 A CN201010580960 A CN 201010580960A CN 102080065 A CN102080065 A CN 102080065A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- cell
- cord blood
- hematopoietic stem
- ptn
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
本发明公开了一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用，包括1640培养基、胎牛血清FBS、血小板生成素、干细胞因子SCF、人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L，还添加了多效生长因子PTN。在现有的造血干细胞培养基中加入适当浓度的PTN，从而得到一种能够在体外更为有效的支持脐带造血干细胞的生长、扩增，更为重要的是能够显著提高造血干细胞在移植到受体体内后的植入能力和造血系统重建能力，从而为脐血干细胞在临床上的应用开辟了新的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞培养体系，尤其是一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用。
背景技术
在美国每年有25000例造血干细胞移植病例，并且这个数字还在增加。然而，60％的需要进行干细胞移植的美国人找不到配型相符的供体，从而限制了从这种非常具有潜力的治疗手段上受益的患者的数量。
脐带血被认为是这些患有致命疾病而又无法找到合适配型的患者的新的干细胞来源。相关研究表明脐血干细胞移植对配型要求较为宽松，所以脐带血干细胞移植的应用将会比现在的移植数量多一倍。然而这种前景目前并没有实现，因为脐带血干细胞(CB)的数量较少不足以对成人进行一次成功的移植。因此，开发对脐带血干细胞进行体外扩增的方法和技术成为其能够广泛
脐血干细胞作为一个理想的干细胞移植来源为50-60％的需要进行干细胞移植但是无法找到合适配型的成人患者提供可以应用的供体。但是由于每CB单位中HSC数量不足以满足成人移植的需要，导致在成人干细胞移植中会发生延迟植入和移植失败率的问题从而限制了它的应用。因此，有效的扩增CB能够拓宽其在成人干细胞移植领域的应用前景。不幸的是，迄今为止并没有在CB HSC扩增以及延迟植入和移植失败率方面取得明显的突破。
Pleiotrophin(PTN)属于肝素结合性生长因子家族，是一种可以同肝素结合的分泌性的生长/分化因子，具有刺激细胞黏附、迁移、存活、生长和分化的功能。研究发现通过RNA干扰方法下调细胞的PTN表达量能够明显的降低细胞的生长速度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种通过在体外培养CB细胞的系统中加入一定剂量的PTN，从而得到了一种能够更好地提高细胞在体外的生长和扩增效率以及CD34+细胞的比率的高效干细胞扩增培养基。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，包括1640培养基、胎牛血清FBS、血小板生成素、干细胞因子SCF、人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L，还添加了多效生长因子PTN。
各组分的含量如下：
1640培养基 0.90mL/mL
胎牛血清FBS 0.10mL/mL
血小板生成素 20ng/mL
干细胞因子 125ng/mL
人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L 50ng/mL
多效生长因子PTN 50-80ng/mL。
所述多效生长因子PTN来源于人类。
所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系在脐带血造血干细胞的体外扩增培养中的应用。
本发明的有益效果是：在现有的造血干细胞培养基中加入适当浓度的多效生长因子Pleiotrophin(PTN)，从而得到一种能够在体外更为有效的支持脐带造血干细胞的生长、扩增，更为重要的是能够显著提高造血干细胞在移植到受体体内后的植入能力和造血系统重建能力，从而为脐血干细胞(CB)在临床上的应用开辟了新的应用前景。有希望应用于脐血干细胞成人移植的研究中。经过这种培养基体外培养后的干细胞移植进入小鼠体内后，表现出更为明显的增殖能力以及良好的植入和造血系统重建能力。
附图说明
图1是应用不同培养基体外培养脐带血CD34+CD38-Lin-7天后检测结果(CD34+CD38-Lin-细胞比例)。
图2是应用不同培养基体外培养脐带血CD34+CD38-Lin-7天后检测结果(细胞数量)。
图3是应用不同培养基体外培养脐带血CD34+CD38-Lin-7天后检测结果(CD34+CD38-Lin-细胞数量)。
图4是人源干细胞移植到小鼠体内4周后检测外周血中人源CD45+细胞比例。
图5PTN直接注射对小鼠骨髓细胞扩增的影响(骨髓细胞总量)。
图6PTN直接注射对小鼠骨髓细胞扩增的影响(KSL细胞的比例)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，包括1640培养基、胎牛血清FBS、血小板生成素、干细胞因子SCF、人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L，还添加了多效生长因子PTN。
各组分的含量如下：
1640培养基 0.90mL/mL
胎牛血清FBS 0.10mL/mL
血小板生成素 20ng/mL
干细胞因子 125ng/mL
人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L 50ng/mL
多效生长因子PTN 50-80ng/mL。
所述多效生长因子PTN来源于人类。
所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系在脐带血造血干细胞的体外扩增培养中的应用。
本发明的技术路线如下：
1)人源PTN对人脐血CD34+细胞的体外扩增具有促进作用
a)取一份协和干细胞基因工程有限公司冻存的脐血干细胞样品37℃复苏。
b)取小部分进行核细胞计数，通过台盼蓝染色检测活力，CD34+细胞计数，并检测外来物以及病原体。
c)剩下的细胞以CD34+为标准应用Isolex 300i磁珠系统进行分离，收集CD34+细胞
d)CD34+细胞按照1*106/ml密度在37℃5％CO2条件下培养，将全部细胞分为四组：干细胞培养基(TSF)；干细胞培养基含20ng/ml的PTN；干细胞培养基含50ng/ml的PTN；干细胞培养基含80ng/ml的PTN。其中干细胞培养基的成分为：0.9mL的1640培养基其中添加0.1mL胎牛血清(FBS)、20ng血小板生成素(Thrombopoietin)、125ng干细胞因子(Stem cell factor，SCF)、50ng人FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3)，TSF培养基能够体外维持HSC的扩增。
e)培养7天之后，测定细胞总量、CD34+细胞在全部细胞中比例以及克隆形成数。
2)人源PTN对人脐带CD34+细胞处理后移植植入能力和造血系统重建能力的影响
a)取一份协和干细胞基因工程有限公司冻存的脐血干细胞样品37℃复苏。
b)取一小部分进行核细胞计数，通过台盼蓝染色检测活力，CD34+细胞计数，并检测外来物以及病原体
c)剩下的细胞以CD34+应用Isolex 300i磁珠系统进行分离，收集CD34+细胞
d)CD34+细胞在按照1*106/ml密度在37℃5％CO2条件下培养，将全部细胞分为两组：TSF培养基；TSF培养基含80ng/ml的PTN
e)七天后将细胞进行处理，然后移植进入NOD-SCID小鼠。并且将刚分离的CB细胞作为对照组也移植入一组小鼠中
f)在移植后4周时检测人源CD45细胞的植入情况
g)在移植后8周作为监测点计算小鼠的存活率，并且对存活小鼠外周血细胞中人源细胞的数量进行检测从而确定移植细胞在小鼠体内的多向分化能力。
3)PTN直接注射进入小鼠体内能够小鼠骨髓细胞的再生
a)将实验小鼠分成三组给予700cGY TBI，杀死小鼠的骨髓造血干细胞
b)分别对三组小鼠给予PTN、G-GSF以及生理盐水，持续7天
c)在第7天和14天检测小鼠骨髓细胞总数以及骨髓KSL细胞的数量
下面进行详细说明：
实施例1：
取一份协和干细胞基因工程有限公司存储的脐血干细胞样本37℃水浴复苏，4℃下以1000g/min离心5min；以干细胞培养基重悬细胞。取一小部分进行核细胞计数并通过台盼蓝染色检测活力；剩余细胞应用流式细胞仪筛选CD34+CD38-Lin-细胞。将细胞按照1*106/ml密度在37℃5％CO2条件下培养：其中一组使用TSF培养基；其它三组在TSF培养基中分别加入PTN至终浓度为20、50、80ng/ml。
培养7天后收集全部细胞进行细胞总数以及CD34+细胞数计数，结果证明：在PTN浓度20-80ng/ml的情况下细胞总量没有明显的差异，但是随着PTN浓度的增加CD34+CD38-Lin-细胞的数量和比例明显提高(图1、2、3)，所以80ng/ml的PTN浓度是作用最为明显的，在这个实验组中CD34+CD38-Lin-细胞的比例明显增高并且克隆形成细胞(CFC)的数量比对照组高4倍。这说明PTN对脐带CD34+CD38-Lin-细胞的扩增有明显的促进作用。以下将含80ng/ml PTN的TSF培养基称为高效干细胞扩增培养基。
实施例2：
取一份协和干细胞基因工程有限公司脐血干细胞样本37℃水浴复苏，4℃下以1000g/min离心5min；以干细胞培养基重悬细胞。取一小部分进行核细胞计数并通过台盼蓝染色检测活力，应用流式细胞仪筛选CD34+CD38-Lin-细胞。将细胞按照1*106/ml密度在37℃5％CO2条件下培养：其中一组使用TSF培养基；另一组使用高效干细胞扩增培养基培养。
培养7天后将细胞移植进入NOD-SCID小鼠中，一共分为三组：(1)移植当天分离细胞直接移植；(2)以干细胞培养基培养7天的细胞；(3)以高效干细胞扩增培养基培养7天的细胞。按照每个小鼠移植500个细胞的比例，移植4周后检测小鼠外周血中人源CD45+细胞，结果(见图4)：移植(3)细胞的小鼠外周血细胞中的人源CD45+细胞的数量是移植(2)细胞的3倍。而8周后检测小鼠外周血：移植(1)细胞的13只小鼠中只有1只能够检测到人源细胞(8％)；在移植(2)细胞的13只小鼠中有6只能够检测到人源细胞(46％)；而在移植(3)细胞的13只小鼠中全部能够检测到人源细胞(100％)。
以上实验充分证明：人源脐带CD34+CD38-Lin-细胞经过高效干细胞扩增培养基体外培养后具有明显增强的移植植入能力，并且能够更好的实现造血系统的重建。
实施例3：
对小鼠进行700cGy的辐射处理，杀死90％以上的骨髓造血干细胞。将小鼠分为三组：分别给予2μg/d的PTN；2μg/d的G-GSF；腹腔注射生理盐水，持续7天。
7天之后对所有小鼠的骨髓细胞进行检测，结果如图5、6：经过PTN处理的组中小鼠的骨髓细胞总数明显的高于其它两组；并且PTN组中的骨髓KSL细胞的数量增加了3倍；第14天时PTN组中的KSL细胞的数量分别是其它两个组中的4倍和4.3倍。以上实验说明PTN能够在体内明显的发挥作用，促进骨髓造血干细胞的增殖。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (4)
1.一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，包括1640培养基、胎牛血清FBS、血小板生成素、干细胞因子SCF、人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L，其特征在于，还添加了多效生长因子PTN。
2.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于，各组分的含量如下：
1640培养基 0.90mL/mL
胎牛血清FBS 0.10mL/mL
血小板生成素 20ng/mL
干细胞因子 125ng/mL
人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L 50ng/mL
多效生长因子PTN 50-80ng/mL。
3.根据权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系，其特征在于，所述多效生长因子PTN来源于人类。
4.如权利要求1所述的用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系在脐带血造血干细胞的体外扩增培养中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010580960 CN102080065A (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010580960 CN102080065A (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102080065A true CN102080065A (zh) | 2011-06-01 |
Family
ID=44086258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010580960 Pending CN102080065A (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102080065A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103740644A (zh) * | 2013-03-20 | 2014-04-23 | 曾宪卓 | 一种基于3d培养体系的扩增造血干细胞的方法 |
| CN105112374A (zh) * | 2015-09-13 | 2015-12-02 | 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 | 一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基及其应用 |
| CN105713879A (zh) * | 2014-12-01 | 2016-06-29 | 顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司 | 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 |
| CN110628718A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-31 | 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） | 干细胞扩增培养基及干细胞培养方法 |
| CN112042597A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-12-08 | 南京普恩瑞生物科技有限公司 | 一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法 |
| CN113881633A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-01-04 | 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 | 一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1630716A (zh) * | 2001-12-07 | 2005-06-22 | 杰龙公司 | 人胚胎干细胞衍生的造血细胞 |
| CN101658533A (zh) * | 2008-08-29 | 2010-03-03 | 首都医科大学宣武医院 | 抗肿瘤药物的干细胞递送 |
-
2010
- 2010-12-09 CN CN 201010580960 patent/CN102080065A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1630716A (zh) * | 2001-12-07 | 2005-06-22 | 杰龙公司 | 人胚胎干细胞衍生的造血细胞 |
| CN101658533A (zh) * | 2008-08-29 | 2010-03-03 | 首都医科大学宣武医院 | 抗肿瘤药物的干细胞递送 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《British Journal of Haematology》 19991231 FELICE LD,et al. Flt3L induces the ex-vivo ampli(R)cation of umbilical cord blood committed progenitors and early stem cells in short-term cultures 133-141 1-4 , 2 * |
| 《British Journal of Haematology》 19991231 LIU WI,et al. Thrombopoietin has a differentiative effect on late-stage human erythropoiesis 459-469 1-4 , 2 * |
| 《nature medicine》 20100321 Himburg HA，et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells 475-482，2119 1-4 第16卷, 第4期 2 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103740644A (zh) * | 2013-03-20 | 2014-04-23 | 曾宪卓 | 一种基于3d培养体系的扩增造血干细胞的方法 |
| CN103740644B (zh) * | 2013-03-20 | 2016-08-17 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 一种基于3d培养体系的扩增造血干细胞的方法 |
| CN105713879A (zh) * | 2014-12-01 | 2016-06-29 | 顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司 | 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 |
| CN105713879B (zh) * | 2014-12-01 | 2020-05-08 | 顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司 | 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 |
| CN105112374A (zh) * | 2015-09-13 | 2015-12-02 | 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 | 一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基及其应用 |
| CN105112374B (zh) * | 2015-09-13 | 2018-07-10 | 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 | 一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基及其应用 |
| CN110628718A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-31 | 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） | 干细胞扩增培养基及干细胞培养方法 |
| CN112042597A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-12-08 | 南京普恩瑞生物科技有限公司 | 一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法 |
| CN113881633A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-01-04 | 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 | 一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法 |
| CN113881633B (zh) * | 2021-12-06 | 2022-02-22 | 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 | 一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102080065A (zh) | 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 | |
| US5965436A (en) | Method of isolating mesenchymal stem cells associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes | |
| WO1998020731A9 (en) | Msc-megakaryocyte precursor composition and method of isolating mscs associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes | |
| CN102643784B (zh) | 一种造血干/祖细胞的体外扩增体系 | |
| CN105713879A (zh) | 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 | |
| CN107418930B (zh) | 一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法 | |
| CN103695369A (zh) | 脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法 | |
| Pytlík et al. | The cultivation of human multipotent mesenchymal stromal cells in clinical grade medium for bone tissue engineering | |
| Sharifiaghdas et al. | Isolation of human adult stem cells from muscle biopsy for future treatment of urinary incontinence | |
| CN103060269A (zh) | 一种提取及培养间充质干细胞的方法 | |
| KR20050042046A (ko) | 조혈 줄기세포의 증식방법 | |
| CN104114694A (zh) | 用于体外扩增造血干细胞和祖细胞的方法 | |
| CN101525596A (zh) | 一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法 | |
| KR102503086B1 (ko) | 어린 돼지 유래 줄기 세포 및 그 제조 방법 | |
| KR20080037281A (ko) | Ｃｄ9를 발현하는 인간 중간엽 줄기세포의 선별 및배양방법 | |
| KR101202836B1 (ko) | 세포응집을 이용한 인간 혈액 유래 혈구 세포괴의 유도와 이를 이용한 혈중 성체줄기세포 및 전구세포의 증폭방법 및 상기의 방법에 의해 제조된 줄기세포 | |
| CN203333673U (zh) | 用于富集、提纯干细胞的试剂盒 | |
| CN107641614A (zh) | 微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途 | |
| CN101429496A (zh) | 一种用于人外周血来源造血干细胞的培养基 | |
| CN101429495A (zh) | 一种人外周血来源造血干细胞的培养方法 | |
| CN110402286B (zh) | 自周边血液制备间质干细胞群的方法及其用途 | |
| WO2010140162A2 (en) | A process for preparing stem cell based formulations | |
| CN102199573B (zh) | 利用宫内膜干细胞诱导分化功能心肌细胞的方法 | |
| CN111040992A (zh) | 一种子宫内膜干细胞的分离培养方法 | |
| KR101134456B1 (ko) | 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포의 생산효율을 높이는 배양배지 조성물 및 세포 치료제 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110601 |