CN104114694A

CN104114694A - 用于体外扩增造血干细胞和祖细胞的方法

Info

Publication number: CN104114694A
Application number: CN201280052478.8A
Authority: CN
Inventors: 梅琳达·L·图斯凯; 马克·A·柯克兰
Original assignee: Cytoplasmic Matrix Private LP
Current assignee: Cytoplasmic matrix therapeutics Australia Pty Ltd.
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2014-10-22
Also published as: KR20140063861A; JP2014527820A; US9518250B2; EP2748309A4; JP6112462B2; SG11201400851PA; WO2013040644A1; EP2748309A1; CA2885665A1; AU2012313347A1; US20140286915A1; IL231668A0

Abstract

本发明涉及造血细胞，并且更具体地涉及用于长期体外培养及体外扩增造血细胞的方法。本发明还提供了有用于培养细胞的组合物，例如用于培养造血细胞特别是造血干细胞(HSC)和造血祖细胞(HPC)的培养基。本发明进一步提供了包括生长因子组合的组合物以及利用改变的生长和环境条件的方法，所述组合物和方法适用于体外培养及体外扩增HSC和/或HPC。

Description

用于体外扩增造血干细胞和祖细胞的方法

技术领域

本发明涉及造血细胞，并且更具体地涉及用于长期体外培养和体外扩增造血细胞的方法。本发明还提供了有用于培养细胞的组合物，例如用于培养造血细胞的培养基，特别是造血干细胞(HSC)和造血祖细胞(HPC)。

背景技术

循环的血细胞(例如红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞)是源自于造血祖细胞(HPC)和造血干细胞(HSC)的可识别的前体细胞的终末分化的产物。

血液病和免疫疾病及癌症的治疗中，造血细胞的移植能力在解决许多疾病的发病机制中提供了巨大的益处和进步。用于骨髓移植的HPC的扩增是人类长期骨髓培养物在用于疾病治疗中的潜在应用的一个此类实例。

目前利用人类自体和异体骨髓移植作为疾病(如白血病、淋巴瘤以及其他危及生命的疾病)的疗法。但是对于这些程序，必须移取大量的供体骨髓以确保有足够的细胞用于治疗程序的移植。通过扩增来增加造血细胞(例如HSC和HPC)的数量的能力可以减少对大量骨髓捐赠的需要，并且可以使得有可能获得小量骨髓捐赠后再在注射给接受者之前在体外扩大祖细胞的数量的能力。

已被证明，人类骨髓培养物呈现有限的造血潜能，其生产的造血祖细胞和成熟的血细胞的数目不断减少，并且在六至八周细胞生产停止。这在很大程度上归因于HPC对各种环境影响的依赖性，例如体内发现的必需生长因子(造血生长因子和细胞因子)。除了这些因子之外，与细胞表面分子和细胞外基质的相互作用对于造血祖细胞的存活和增殖可能是重要的。但是，尽管为使用外源性生长因子以推进体外扩增做出了许多努力，仅仅成功地实现了多能细胞的数量的有限增加。

脐带血提供了可以操纵和利用以有效的移植治疗儿童疾病的HSC和HPC的源。这些细胞已经显示出了许多优于后来在生活中采集的祖细胞的优点，包括移植物抗宿主病(GvHD)的发病率较低以及供体和受体之间的免疫不相容的更大的宽容度。

与骨髓和动员的外周血相比，使用脐带血作为HSC源还提供了相当大的优势，由于这些细胞的相对免疫学和复制型不成熟，由此导致更低的GvHD发病率、更大的人类白细胞抗原不匹配的容许度以及在移值后增加的增殖潜能。但是存在缺陷，因为使用脐带血进行移植部分地受限于每单位获得的细胞数量低以及中性粒细胞和血小板的延迟重建。另外，各个脐带血样本中低数量的HSC和HPC通常限制了脐带血移植在完全长大成年的接受者中的唯一用处。

目前存在两种主要选择以增加可以用于移植的HSC和HPC的细胞剂量：多个脐带血输血或者体外扩增。在成人移值中已经成功的使用了双脐带血，由此减少了旧病复发并增加了改善生存的潜力。但是，利用了多种脐带血双移植要求更高的人类白细胞抗原(HLA)匹配的严格性，并且其还与GvHD的发病率增加相关联。另外由于多个脐带血移植不影响细胞组成，此选项提供减轻重建延迟的能力有限。由于这些因素，为产生充足的用于长期植入的HSC和/或HPC并且为了增加能够产生短期重建的造血细胞和多能细胞的数量，对体外扩增的兴趣有所增加。所扩增的细胞可单独移植、或与来自相同或不同的单位的未操纵细胞一起移植，以增加长期植入并同时尽量减少重建延迟。

临床试验表明体外扩增是增加细胞剂量的安全且可行的方法，尽管其最初被看到只产生温和的扩增且伴有高程度的细胞分化。最近，已经证明显著扩增能够复育的HSC和HPC是可能的，但对于最佳扩增条件并没有明确的共识。因此，用于扩增造血祖细胞的方法可以提高脐带血移植的有效性并且还可以使得造血细胞源(如脐带血)成为用于在成人中移植的HPC的可行来源。

更加容易地扩增HSC和HPC的群体的能力还可以在形成化疗的补充治疗中提供益处，或者在治疗涉及造血细胞的改变的其它病状中提供援助，并且还可以为人类长期骨髓培养物提供了进一步的应用。可以提供HSC和HPC扩增的成功的方法可以极大地促进生产大量的特定谱系的进一步分化的前体细胞，并且反过来提供大量具有各种应用(包括输血)的分化的造血细胞。这将极大地改善治疗特性并且提高治疗(如化疗)的效果。

因此，需要提供用于改进造血细胞(如HSC和HPC)的培养和维护的体系、增强的条件、组合物和方法，从而增加可用于移植的细胞剂量并且在体外长期培养下有利地影响造血细胞的成活力和多能性。还需要此类改进以提供改进的体外扩增，从而导向产生出充足的用于长期植入的造血细胞，并由此增加能够产生短期重建的HPC和其它多能细胞的数量，并且在体外长期培养下有利地影响造血祖细胞的成活力和多能性。

包括由本说明书中的对文献、行为、材料、装置、物品等的论述只是为了为本发明提供背景。这并非暗示或表示任何或所有这些事项构成了现有技术基础的一部分或因为其存在于本申请的各个权利要求的优先权日之前而为与本申请相关领域中的公知常识。

发明内容

HSC操纵作为化疗或放疗的补充治疗是有用的。例如，将HSC本地化为外周血中，然后从将接受化疗的受试者中分离出来并且在治疗后将所述细胞返回。骨髓是体内最丰富的组织之一，并且因此经常是由化疗药物和放射首先损伤的器官。其结果是，血细胞的生产在化疗或放射治疗过程中迅速被破坏，并且在患者重新接受化疗之前，必须终止化疗或辐射以使造血系统补充血细胞供应。

因此，通过使用HSC和/或HPC移植来治疗血液病和癌症，如多发性骨髓瘤和白血病。HSC和HPC通常源自于自体骨髓或匹配的供体，然而，供体和接受者之间的相容性往往是限制。通常很难找出合适且相容的供体，在白种人患者中找到匹配的供体的成功机率只有50％。另外，在少数名族(ethnic group)中找到适合的供体的概率显著降低。因此，目前需要提供HSC和/或HPC的替代来源以协助那些目前需要治疗。

本发明提供了用于延长造血细胞的体外成活力的方法和组合物，从而增加它们的数量并同时维持自我更新和多能性的属性。经确定，通过在ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3或它们的片段或功能性等价物中的任何一种的存在下培养HPC和/或HSC的群体，可以延长HPC和/或HSC群体的体外成活力或者HPC和/或HSC群体的培养或扩增。

本文所描述的是用于在体外富化和扩增HSC和HPC的方法和组合物，其通过在在特定的组合物的存在下并且在特定的培养条件下生长细胞。在完成基于细胞培养的HSC和HPC的扩增后，可以将所述细胞分离以供进一步使用(例如在移植中)，由此通过增加所移植的HSC和HPC的数量来减少潜在的炎症反应。

认为本发明还可以提供新颖的组合物，其利用了如前所述的新颖的生长因子组合的效应以及与各种培养条件的组合，所述培养条件如可获自许多来源(例如来自脐带血)的HSC和/或HPC上的氧水平，从而在体外增加培养物的寿命以及这些细胞的多能性(pluripotency)、多潜能性(multipotency)、维持和/或扩增。本发明还进一步提供了方法以及源自于使用这些方法得到的产物，这些方法在氧浓度低于正常环境氧浓度的环境中进一步培养HSC和/或HPC的群体，其为培养物和所得的细胞群体提供了有益影响。

对各种目标群体使用各种条件和新颖化合物，能够为由所得到的扩增的细胞类型以及在收获前所培养和/或扩增的细胞数量所定义的特定终点选择适合的培养条件。因此，已经为所有目标群体的增强的倍扩增鉴定出优化的条件，具有直接临床翻译以增加可移植细胞剂量并最小化重建延迟的潜力。

另外，本发明提供了方法、扩增的细胞群体、能够移植给有需求的接受者的细胞群体、用于控制生产大量特定谱系的祖细胞以及它们的更分化的造血细胞的装置和组合物。在本发明的一个实施方式中，提供了使用各因素单独和组合的影响的优化，控制产生并维持由让人联想起造血利基方面的条件所致的自我更新，多能性和分化的特性。

本说明书(包括权利要求)中使用的术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprised)”或“包含(comprising)”应当被解释为指定所述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤或组分或它们的群组的存在。

在审阅了以下描述的本发明的具体实施方式之后，本发明的其它方面对本领域普通技术人员而言将是为而易见的。

附图说明

为了进一步理解本发明的方面和优点，应当参考以下详细说明并且结合附图一起考虑。

图1显示了基于细胞表面标志物或集落形成单位所确定的目标群体的纯度。在生长因子血小板生成素(T,50ng/ml)、干细胞因子(S,50ng/ml)、Flt-3配体(F,80ng/ml)和白细胞介素-6(I,100ng/ml)(T、TS、TSF、TSFI)的组合的存在下，在一系列的氧含量(2.5％≈19mmHg、5％≈38mmHg、10％≈75mmHg且20％≈150mmHg)下培育富集了CD34⁺的细胞，与血小板生成素、干细胞因子和粒细胞集落刺激因子(TSG，各100ng/ml)进行比较。利用细胞表面标志物通过流式细胞计来鉴定目标群体，并且通过在‘完全’甲基纤维素培养基中生成以对爆式集落形成单位-红细胞(BFU-E)、集落形成单位-粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM)、集落形成单位-粒细胞/红细胞/单核细胞/巨噬细胞(CFU-GEMM)、和总爆式/集落形成单位进行计数。N＝4个独立的脐带血单位，每个各进行一式三份。结果表示为平均值±该平均值的标准误差。字母a–d标示统计学上不同的组，p值如图所示。

图2显示了表型和功能评估的HSC、HPC和多能细胞的倍扩增。通过手动计数、流式细胞计和细胞集落形成单位计数来确定生长因子的组合与氧水平对目标群体的倍扩增的影响。倍扩增描绘了目标群体数量相对于培养前的数值的增加。生长因子的组合是血小板生成素(T,50ng/ml)、干细胞因子(S,50ng/ml)、Flt-3配体(F,80ng/ml)和白细胞介素-6(I,100ng/ml)(T,TS,TSF,TSFI)，与血小板生成素、干细胞因子和粒细胞集落刺激因子(TSG,各100ng/ml)进行比较。测试的氧水平为2.5％、5％、10％和20％。N＝4个独立的脐带血单位，每个进行一式三份。结果表示为平均值±该平均值的标准误差。字母a–c标示统计学上不同的组，p值如图所示。

图3显示了目标群体的累积倍扩增以及在串行扩增过程中的相对基因表达水平。使用生长因子组合TSFI在5％和10％氧中确定了造血干细胞、祖细胞和多能的靶细胞的累积倍扩增，与TSG在20％氧中进行比较。基于手动细胞计数、检测细胞表面标志物和菌落形成单位计数评估了目标群体细胞数量的变化。相对于在每个时间点在一种条件(TSFI在10％氧中)下的表达，确定了相对于管家基因的定量的基因表达水平。N＝4个独立的脐带血单位，每个进行一式三份。结果表示为平均值±该平均值的标准误差。显示了跨越3周(W0–W3)的串行扩增。字母a–c标示统计学上不同的组，p值如图如示。

图4显示了利用三种评估的方法可能区分的造血细胞类型。1)分化的分子(CD)的表面标志物簇的表达模式，用于表型鉴定干细胞、祖细胞和多能细胞，如右手侧所示，且对于谱系定型细胞如下图所示。2)使用集落/爆式形成单位(CFU/BFU)测定对粒细胞(G)、红细胞(E)、单核细胞(M)和巨噬细胞(M)进行多能细胞的功能评价，如(*)所示。3)自我更新的造血干细胞的基因表达模式，且对于祖细胞和多能细胞标示在左手侧。(细胞图像改编自A.Rad,2007.)。

图5显示在CD34+富集后，只有具有成活力且CD34+纯度为80％以上的样品才用于体外扩增。在单步及串行扩增培养之前和之后都对细胞进行了评估。使用台盼蓝排除法通过手动计数确定成活细胞数量。目标群体的纯度为通过流式细胞计确定的表达表面标志物组合的细胞的百分比，且集落生成为通过CFU测定的每1000个接种的细胞的爆式或集落形成单位的数量。在每个时间点，使用存活的细胞数量以及目标群体的纯度或集落生成来计算相对于培养前的数的倍扩增和累积倍扩增的终点。目标群体纯度和集落生成也被用来作为终点。相对于两个管家基因的平均值量化了基因表达的实时PCR，并且相对于用TSFI在10％氧中发现的表达进行了确定。

图6显示了在不同生长因子的组合(在文本中所指示的浓度下)的存在下且在不同的氧气浓度(2％、5％、10％和室内空气(20％O₂))下的总细胞的倍扩增和由表型标志物(CD34+CD45+7AAD-)定义的HSC亚群的倍扩增。数据是10个不同实验的平均值，并且所有的数值都计算为相比于接种的群体的倍扩增。(无–未添加生长因子；TF–血小板生成素、Flt-3配体；TFI–血小板生成素、Flt-3配体、白细胞介素-6；TFS–血小板生成素、Flt-3配体、SCF；TFSI-血小板生成素、Flt-3配体、SCF、白细胞介素-6；TSG-血小板生成素、SCF、G-CSF)。

图7显示了在图6中所述的每个培养条件中每1000个细胞的总集落。

图8显示了总细胞的倍扩增和由表型标志物–CD34+,CD34+CD133+和CD34+CD38-定义的HSC亚群的倍扩增。所有分析都只选通(gate)为存活的细胞(7AAD-)。在以50ng/ml或100ng/ml添加或未添加ficolins-1、ficolin-2或ficolin-3的条件下，在10％氧中，在TFSI生长因子的存在下培养细胞。

图9显示了在TFSI+/-50或100ng/ml的ficolins-1、ficolin-2或ficolin-3的存在下在10％O₂中培养的细胞的总集落数量和集落形态。在这些生长因子中培养8天之后，将来自各条件的1000个细胞接种至半固态培养基(Methocult,Stem Cell Technologies,Vancouver)中，每个条件一式三份并且进一步培养12～14天。然后在倒置显微镜下计数集落的数量和类型。

图10显示了总细胞的倍扩增和由表型标志物–CD34+,CD34+CD133+和CD34+CD38-定义的HSC亚群的倍扩增。所有分析都只选通为存活的细胞(7AAD-)。在以50ng/ml或100ng/ml添加或者未添加ficolins-1、ficolin-2或ficolin-3的条件下，在5％氧中，在TFSI生长因子的存在下培养细胞。

图11显示了在TFSI+/-50或100ng/ml的ficolins-1、ficolin-2或ficolin-3的存在下在5％O₂中培养的细胞的总集落数和集落形态。在这些生长因子中培养8天后，将来自每个条件的1000个细胞接种至半固态培养基(Methocult,Stem Cell Technologies,Vancouver)中，每个条件一式三份并且进一步培养12～14天。然后在倒置显微镜下计数集落的数量和类型。

具体实施方式

人类自体和异体骨髓移植方法被用作许多疾病的疗法，如白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤以及其他危及生命的疾病。因此，在血液病、免疫疾病和癌症的治疗中，HSC和HPC被转向为日益更受欢迎且确立形式的药物治疗。

在用于移植目的的相容性骨髓供体不可用时，脐带血常常被作为寻求收获HSC和HPC的源。在体外进行的研究已经证明，从脐带血获得的HSC比获自骨髓的那些具有更好的增殖和移植能力。因此，认为使用脐带血相比于造血干细胞的其它来源提供若干优势，例如存在在脐带血中比在骨髓中更不那么严格要求匹配HLA的事实。可惜的是，脐带血中存在且可用的造血细胞的数量通常少于总的有核细胞的0.1％。低群体的这些细胞以及将它们成功地扩增为适合用于移植的密度的有限倾向性，经常给它们的应用带来限制和问题，因为未能达到阈细胞剂量限值(在一些情况下至少为1.7x10⁵CD34+个细胞/kg)已经被视为与较低的移植成功率相关。

增加干细胞数量的方法可以进一步减少与骨髓/外周血干细胞采收相关的时间和不适并随后增加干细胞供体的库。增加干细胞数量的方法还允许将脐带血用于成人患者，从而扩大了异体移植的应用。

因此，本发明的方法和组合物为造血细胞的培养、扩增和维护提供了改进的体系和工序。本发明的方法为可以从HPC或HSC样品获得的子代的数量提供了改进，并且同时保持或增加这些细胞的再增能力和多能性。

1.定义

本文使用的术语“造血干细胞”或“HSC”是指未成熟的血细胞，其具有自我更新和分化成更成熟的血细胞的能力，所述更成熟的血细胞包含粒细胞(例如，早幼粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红血球)、血小板(例如，成巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)和单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)。本领域已知此类细胞可以包括或不包括CD34+细胞。CD34+细胞是表达CD34细胞表面标志物的不成熟的细胞。认为CD34+细胞包括具有上述干细胞特性的细胞亚群。

本领域还众所周知，造血干细胞可以包括多能干细胞、多潜能干细胞(例如，淋巴干细胞)和/或致力于特定造血谱系的干细胞。所述致力于特定造血谱系的干细胞可以是T细胞谱系、B细胞谱系、树突状细胞谱系、朗格汉斯细胞谱系、红系的、巨核细胞的、脊髓的和/或巨噬细胞的细胞谱系。此外，HSC也指长期HSC(LT-HSC)和短期HSC(ST-HSC)。LT-HSC和ST-HSC是例如基于它们的细胞表示标记物的表达来区分化的。LT-HSC是CD34-、SCA-1+、Thy1.1+/lo、C-kit+、lin-、CD135-、Slamf1/CD150+，而ST-HSC是CD34+、SCA-1+、Thy1.1+/lo、C-kit+、lin-、CD135-、Slamf1/CD150+、Mac-1(CD11b)lo(“lo”指的是低表达)。另外，ST-HSC与LT-HSC相比较少的静态(即，更加活跃)且更具增殖性。但是，LT-HSC有无限的自我更新(即，它们存活在整个成年期)，而ST-HSC具有有限的自我更新(即，它们只在有限的时间段内存活)。

任何这些HSC都可以用于任何本文所述的方法中。任选地，ST-HSC是有用的，因为它们是高度增殖性并由此迅速增加HPS的数量和它们的子代。类似地，本领域已知此类细胞可以包括或不包括CD133+细胞，其也可以在“血液制品”中发现，并且还已知包括具有如上所定义的“祖细胞”特性的细胞亚群。另外，HSC任选地获自于血液制品。

如在本发明中所考虑的，所扩增的HSC保留了至少一些初始干细胞或HSC的多能性。多能性包括干细胞活性或潜力，如分化成其它血细胞类型的能力或不分化而繁殖的能力。

本文所考虑的“血液制品”包括从身体获得的产物或含有造血起源的细胞的身体器官。此类来源包括未分级的骨髓、脐带、外周血、肝脏、胸腺、淋巴和脾脏。所有上述粗制的或未分级的血液制品都可以通过许多途径用来富集具有造血干细胞特性的细胞。例如，可以利用它们表达的细胞表面分子来选择更成熟的分化的细胞。任选地，通过选择CD34+细胞对血液制品进行分级。CD34+细胞包括能够自我更新和多能性的细胞的亚群。此类选择是使用例如市售的磁性抗-CD34珠来完成的。未分级的血液制品任选地直接获自于供体或从冷冻保护的储存中获取。使用特定的干细胞标志物来分离HSC的能力为本领域技术人员所熟知。

根据本发明，认为所有上述粗制的或未分级的血液制品都可以通过许多途径用来富集具有造血祖细胞或“HSC”特性的细胞。

本文中使用的术语“HPC”是指在循环血液中稀少的并且可以分化为各种专门的细胞类型并产生血细胞类型的造血祖细胞。通常理解的是，它们在处在不同成熟阶段的血液中存在。

作为非限制性的实施方式，所述血液制品可以由更分化的子代耗尽。可以针对它们具有的和表达的细胞表面分子来选择更成熟的分化的细胞。还可以采用特异性配体和受体并且在进一步操纵之前富集所述HPC。

在本发明中，认为术语“环境的(ambient)”是指完全包围或围绕本发明的培养基区域的区域。认为本说明书在上下文中使用的术语“环境的”可以由本领域中最小量技术的人员所理解并且该术语为本领域技术人员所众所周知。

本文中使用的术语“环境氧浓度”应理解为是指不同的环境介质中或在周围的环境中每单位体积中发现的环境可用的氧气量，并且认为其为本领域技术人员所理解的术语。

本文中使用的术语“基质细胞”被认为包含成纤维细胞和间充质细胞，具有或不具有其他细胞和元素，并且可以在造血祖细胞之前或与其基本同时接种，由此确立有利于后续的HSC和/或HPC的附着和生长的条件。成纤维细胞可以通过活组织检查从任何组织或器官获得，并且包括胎儿成纤维细胞。这些成纤维细胞和间充质细胞可以使用编码例如所述造血生长因子之一的外源DNA来转染。

根据本发明，认为术语“质细胞的条件培养基”是指其中已经培育有前述基质细胞的培养基。在本发明的方法中，所述培育进行一段时间以充分使所述基质细胞向培养基中分泌因子。然后可以使用此类“基质细胞的条件培养基”来补充HPC的培养以促进它们的增殖和/或分化。因此，当在不含任何前述试剂下培养细胞时，在本文中是指除了可能存在于血清、普通的营养培养基或存在于含有造血祖细胞的血液制品分离物(未分级的或分级的)中的此类试剂之外，在未添加此类试剂的情况下来培养细胞。

如本发明中所考虑的，术语“接种的基质细胞”或“基质细胞接种的培养基”是指向不含基质细胞的细胞培养容器中引入基质细胞以作为促进HPC的存活、增殖或分化的接种物，但是排除天然存在于分离的血液制品中的基质细胞。

本文中所提及的“受试者”是例如骨髓供体或者患有或有风险患有耗尽或有限的血细胞水平的个体。任选地，所述受试者是骨髓采收之前的骨髓供体或是骨髓采收之后的骨髓供体。所述受试者任选地是骨髓移植的接受者。本文所述的方法在具有有限的骨髓储备的受试者(例如老龄受试者)或先前已经接受免疫耗减治疗(如化疗)的受试者中是特别有用的。所述受试者，任选地与对照血细胞水平相比，具有降低的血细胞水平或具有发展降低的血细胞水平的风险。本文所使用的术语“对照血细胞水平”是指在改变受试者中血细胞水平的事件之前或基本上不存在该事件的受试者中的血细胞平均水平。改变受试者中的血细胞水平的事件包括例如贫血、创伤、化疗、骨髓移植和放射治疗。例如，所述受试者患有由例如创伤所致的贫血或失血。

如本发明中所考虑的，术语“采收造血干细胞”、“采收造血祖细胞”、“采收HSC”或“采收HPC”被认为是指细胞的取出和分离，并且被认为是本领域技术人员可以意识到的技术。在一个例子中，“采收”可以通过使用多种方法来完成，例如基于酶、非酶、离心、电气或尺寸的方法，或者优选地通过使用培养基(例如，用来培育细胞的培养基)或缓冲液来冲洗所述细胞。任选地收集、分离所述细胞并且进一步地扩增以生成甚至更大群体的HSC或HPC和分化的子代。

如本发明所考虑的，术语“控制曲线”被认为是指通过测量不同体积的可以在相同条件下培养的血液制品的生长特性所产生的统计与数学相关曲线，并且其中所述细胞可以被采收并在规则时间间隔上计数。本发明中所考虑的这些“控制曲线”可以在随后的场合中用作估算细胞数量的一种方法。

根据本发明的方法，认为任何适合扩增的容器、瓶或适合的管(如12、24或96孔板，12.5cm2T烧瓶或气体可渗透袋)都可以用于任何本发明的培养方法。

如本发明所考虑的，术语“造血生长因子”被认为是指影响造血细胞的存活、增殖或分化的至少一种因子。这些生长因子可通过纯化方式获得、通过重组方法获得，或者可以是衍生的或合成的。因此，与本发明的方法和组合物有关的特别令人感兴趣的生长因子是造血生长因子。

如本发明所考虑的，术语“ficolin”被认为涉及存在于ficolin家族中的若干种变体蛋白质，主要包括ficolin-1(M-ficolin)、ficolin-2和ficolin-3。这些都是分泌模式-识别凝集素，其有助于病原体的先天免疫识别。Ficolin具有一个纤维蛋白原样结构域和一个胶原蛋白样结构域，并且作为二硫键连接的均聚-寡聚体循环。在配体结合后，ficolin与MASP丝氨酸蛋白酶联合以触发凝集素补体级联。人类中的Ficolin-1是由FCN1基因(SEQ ID:1)编码的，ficolin-2是由FCN2基因(SEQ ID:3)编码的，且ficolin-3是由FCN3基因(SEQ ID:5)编码的。翻译自FCN1、FCN2和FCN3的蛋白质产物分别提供为SEQ ID:2、SEQ ID:4和SEQ ID:6。

Ficolin是结构上与血管生成素样蛋白相关的蛋白质，并且具有相似的结构域结构，特别是单纤维蛋白原样结构域。在氨基酸水平上检查ficolin与血管生成素样蛋白的同源性，但是只看出仅约20～25％水平的同源性。该ficolin家族的蛋白质的特征在于存在前导肽、短的N-末端片段、随后为胶原蛋白样区和C-末端纤维蛋白原样结构域。还在其它蛋白质(如补体蛋白C1q、称为聚集蛋白的C型凝集素、和肌腱蛋白)中单独地发现了胶原蛋白样结构和纤维蛋白原样结构域。然而，所有这些蛋白质都识别不同的对象，并且在功能上是不同的。

在所有本发明所述的培养方法中，除另有规定外，所使用的培养基可以是常规适合于培养细胞的培养基。本领域中已知的并且能够用于细胞培养的培养基的例子包括RPMI、DMEM、ISCOVES。典型地，这些培养基补充有人类或动物的血浆或血清。此类血浆或血清可以含有少量的造血生长因子。在本发明的优选的条件下，所采用的培养基未添加血清。

2.用ficolin培养HSC和/或HPC

扩增来源于适合来源(例如脐带血或骨髓)的HPC或HSC的群体的能力可以给医学界提供可观的益处，并且改善成功地进行治疗、移植手术或用于血液病和肿瘤疾病的需要高细胞剂量的其它疗法的前景。

在本发明中，已经发现单独使用或组合使用特定的试剂(如ficolin)可以增强HSC和HPC群体的扩增。Ficolin是在结构上与血管生成素样蛋白相关的蛋白质，并且具有相似的结构域，特别是单纤维蛋白原样结构域。它们在此以前已确认为免疫功能的调节剂，但是没有研究它们对造血干细胞或造血祖细胞的影响。

已经看出这些试剂为造血细胞的自我更新和扩增提供了增强作用。如本发明人所发现的(参见实施例)，发现在存在(但不是不存在)ficolin的条件下能够实现最原始类的集落形成细胞CFU-GEMM的维持，表明这些试剂在有选择地保留原始HSC群体中是最可能活跃的。

因此，在本发明的一个方面，提供了对适合于生长HSC和/或HPC的培养基的补充物，其中所提供的该补充物是试剂ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合中的一种或多种。

如本发明中所考虑的，ficolin的片段和功能等价物应理解为包括含有纤维蛋白原样结构域的片段(在ficolin1的情况下，例如氨基酸115～325)、或者含有凝集素结合活性的较小的片段(作为非限制性的例子，在ficolin1的情况下，氨基酸200～300)。

在一个实施方式中，用于培养或扩增的造血细胞的群体可以采收自例如获自于适合受试者的骨髓样品、先前确立的培养物或脐带血。任选地，所述HSC可以获自于从包含未分级的骨髓、脐带、外周血、肝脏、胸腺、淋巴和脾脏的群组中选出的血液制品。

在进一步的实施方式中，从本发明的方法或组合物的使用和应用中获得的造血细胞群体可以包括HSC和/或HPC，该HSC和/或HPC由于在移植接受者中具有增强的恢复血细胞和免疫细胞的能力而包含提高的治疗潜力。在又另一个实施方式中，认为根据本发明的方法培养的细胞群体能够保留进行分化以生成用于其它组织(如，例如脑细胞、肌肉细胞和肝细胞)的细胞的潜能。

可以认为，未分级的血液制品可以直接获自于供体或者从冷冻保护的储存中获取，但是认为这些仅仅是能够得到此类血液制品的非限制性例子，从而为在本发明的方法中使用的造血细胞提供来源。根据本发明，认为造血细胞可来源于任何适合的动物，例如人类、非人类灵长类动物、猪或鼠。在优选的实施方式中，所述造血细胞是人类细胞。

在本发明的一个实施方式中，如本发明中使用的用于培养HSC和/或HPC的方法可以采用任何本文所述的生长因子并且可以补充有ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合中的一种或多种。在优选的实施方式中，向所述培养体系中加入ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、它们的片段或功能等价物或组合以便其在所述培养基中占约50ng/mL～200ng/mL。在更加优选的实施方式中，ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、它们的片段或功能等价物或组合在所述培养体系中的浓度为约50ng/mL～100ng/mL。

3.在低氧(O ₂ )环境中培养HPC和/或HSC

在本发明中，发明人还已确定当以低于环境氧浓度的水平向细胞培养物中提供氧量时，可以提供增强的生长特性，如提高纯度的目标群体，且对集落生成没有影响或影响非常有限。

低浓度的氧对细胞(如HPC和/或HSC)生长的影响可以通过添加试剂(如ficolin或其功能等价物)来进一步减弱，由此以对集落生成的最小影响提供了提高纯度的目标群体。

因此，在本发明的进一步方面，提供了用于在体外延长HPC和/或HSC群体的成活力的方法、或用于培养或扩增HPC和/或HSC群体的方法，其中所述方法包含在ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合的存在下并且在与正常的环境氧浓度相比降低了氧浓度的环境中培养所述HPC和/或HSC群体。

所述造血细胞的培养优选在增加此类细胞的数量和/或此类细胞的集落形成潜力的条件下来进行。所使用的条件是指本领域中众所周知的条件的组合(例如温度、CO₂含量、营养培养基等)。但是特别地，发明人已经发现培养环境中的氧浓度对于造血祖细胞的扩增是至关重要的。

在本发明的实施方式中，本发明的HSC和/或HPC的群体可以在低氧环境中培养以增强它们自我更新的概率并且降低分化的概率，并且是在试剂(如ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合)的存在下来这样进行的。

在进一步的实施方式中，提供了用于改变在体外延长HPC和/或HSC群体的成活力的能力的方法、或用于培养或扩增HPC和/或HSC群体的方法，其在培养过程中通过适当选择的氧浓度，并且已经向所述培养体系中添加了试剂，如ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合。

在另一个实施方式中，所述培养体系中的氧浓度构成低于大气中存在的环境氧浓度水平。在更优选的实施方式中，氧的浓度低于培养气氛的约20％，更优选地，氧气占培养气氛的约1％～约12％。在特别优选的实施方式中，氧气构成培养气氛的约10％。

在进一步的实施方式中，本发明的细胞是在试剂(如ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物)的存在下、在氧气的浓度低于环境中存在的环境氧水平的环境中培养的，并且其中所述细胞是在约1％～约12％氧气的氧浓度下培养的。

在另一个实施方式中，本发明的细胞是在任何一种或多种试剂(如ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或片段或功能等价物)的存在下、在其中氧气的浓度为至少0.5％、或至少1.0％、或至少1.5％、或至少2.0％、或至少2.5％、或至少3.0％、或至少3.5％、或至少4.0％、或至少4.5％、或至少5.0％、或至少5.5％、或至少6.0％、或至少6.5％、或至少7.0％、或至少7.5％、或至少8.0％、或至少8.5％、或至少9.0％、或至少9.5％、或至少10.0％、或至少10.5％、或至少11.0％、或至少11.5％、或至少12.0％、或至少12.5％、或至少13.0％、或至少13.5％、或至少14.0％、或至少14.5％、或至少15.0％、或至少15.5％、或至少16.0％、或至少16.5％、或至少17.0％、或至少17.5％、或至少18.0％、或至少18.5％、或至少19.0％、或至少19.5％、或至少20.0％的环境中来培养的。

在优选的实施方式中，可以使用5～10％范围的氧浓度，在试剂(如ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合中的任何一种或多种)的存在下来培养脐带血HSC和/或HPC。在特别优选的实施方式中，在HSC和/或HPC的培养中可以使用约5％的氧浓度。

根据本发明的方法，认为根据所述方法并且使用本发明的组合物并且在降低的氧的条件下培养和扩增HSC和/或HPC群体所必要的时间为可以由本领域技术人员来确定的时间。这可以理解为其可根据培养过程中接种的细胞的原始数量而变化。作为非限制性的例子，可以将培养基的褪色用作铺满(confluency)的指标。

还认为，在本发明的实施方式的应用中，可在相同的条件下培养不同体积的血液制品，从而生成在后续的场合可以用来评估细胞数量的“控制曲线”。认为本领域并由此本领域的普通技术人员充满了用来确定适当培养时间的技术，该培养使用了修改的氧浓度条件和本发明的方法。但是如本领域普通技术人员可以设想的，各种因素可能影响在细胞培养中遇到的测量或时间间隔。如培养时的初始接种密度可能影响培养时间的考虑。例如，如果初始接种更多的细胞，那么相对于如果初始提供较少数量细胞进行接种而言，用于培养的最佳时间可以缩短。

但是可以认为，如监控细胞数量的变化等技术的应用(例如通过测定光密度或直接计数)、通过监控培养基的pH的变化或检查生长速率的放缓(例如，通过计算细胞的倍增时间)都代表了确定合适的培养时间的有效且适当的方法。

在本发明的进一步实施方式中，除了适合于生长HPC和/或HSC的培养基之外，还提供了ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合，其中培养条件包括低于环境水平的氧浓度，并且更优选的氧浓度低于约15％、低于约14％、低于约13％、低于约12％、低于约11％、低于约10％、低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％或低于约5％。

在优选的实施方式中，向培养基中提供ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合，其中氧浓度为约5％。在特别优选的实施方式中，除了培养基之外，还提供了ficolin-1或其片段或功能等价物，其中氧浓度为约5％。

4.使用改变的培养条件使用ficolin培养HSC和/或HPC

造血细胞群体如HSC和/或HPC的体内扩增取决于通常发现这些细胞的骨髓环境中的多重因素的综合影响。这个区域相当普遍地称为“造血利基”。

最原始且多能的干细胞通常位于骨髓中的骨小梁空间内骨内膜面的紧邻处。因此，这种利基由干细胞和邻近的基质细胞(包括成骨细胞)之间的细胞相互作用、以及与细胞外基质成分的相互作用、不同细胞类型之间的三维相互关系、以及生长因子和其他可溶性信号分子在骨髓腔内的扩散所构成。

因此，在本发明的进一步方面，提供了用于在试剂的存在下并且额外地在本文所述的生长因子的存在下培养HSC和/或HPC的方法，所述试剂如ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合，所述生长因子可以为细胞的培养提供附加益处，如提高HSC和/或HPC细胞的更新和多能性的属性。

在利用本发明的方法中，可以取出HSC和/或HPC的富集群体，并且使用试剂和/或生长因子来对它们进行刺激从而在体外产出更成熟的血细胞，所述试剂和/或生长因子可以促进造血细胞的维持或促进扩增和/或分化。此类扩增群体的血细胞可以在体内应用，例如补充患者的造血细胞群，或者可以实验使用。此类分化的细胞包括上述那些以及T细胞、浆细胞、红细胞、巨核细胞、嗜碱性粒细胞、多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和血小板。

与本发明的方法和组合物有关的特别令人感兴趣的生长因子是造血生长因子。这些生长因子可以通过纯化获得、通过重组方法获得，或者可以是衍生的或合成的。

在本发明的实施方式中，提供了在常规生长培养基中，在ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合的存在下，通过添加选自于包含白细胞介素3、白细胞介素6和白细胞介素11(I)、干细胞因子(S)、血小板生成素(T)、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和FLT-3配体(F)的群组中的生长因子，从而培养或扩增HSC和/或HPC群体的方法。

如由本发明的发明人所确定的，且如实施例中所讨论的，单独的血小板生成素只产生了60％的细胞存活率，这低于优选的移植标准且不适合于维持研究用的细胞培养物。当向所述培养基中提供生长因子的组合TS时，看到了提高了扩增细胞的存活率。另外，TS将最原始的HSC(CD34⁺CD38^--)的百分比提高至高于培养前所观察到的水平，并且大幅提高了倍扩增。

因此，在本发明进一步的实施方式中，向包含HPC和/或HSC以及ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或其片段或功能等价物的培养基中提供生长因子TS，从而提高所扩增的培养物的成活力。

在进一步的实施方式中，可以使用生长因子的组合来培养HPC和/或HSC的群体，其中所述培养在培养基中包含血小板生成素(T)、干细胞因子(S)、FLT-3配体(F)和白细胞介素-6(I)。在本发明的进一步实施方式中，除了生长因子组合TSFI之外，还提供了试剂ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合。

在本发明的又进一步实施方式中，可以以约50ng/mL～100ng/mL范围的浓度提供各个生长因子。在优选的实施方式中，在本发明的方法或组合物的应用中，以约50ng/mL提供T，以约50ng/mL提供S，以约80ng/mL提供F，并且以约100ng/mL提供I。

也如本发明人所确定的，向组合TS中添加Flt-3配体(F)对大多数目标群体的纯度和倍扩增具有最小的加性效应，但是已经确定其显著减少BFU-E和CFU-GEMM的集落生成。因此，在进一步的实施方式中，提供了生长因子F与TS的组合在HSC和/或HPC的存在下培养前述细胞。

在本发明的方法的应用中，观察至添加白细胞介素-6(I)降低了使用TSFI(当与使用TS或TSF相比时)的目标群体的整体纯度和集落生成，但是这个组合还显示出活细胞倍扩增的显著增加以及临床上预测的CD45⁺CD34⁺群体和CD133⁺群体的相应增加，并且更多原始的CD34⁺CD38^--群体。

与CD34⁺CD38^--扩增的增加一起，本发明人还确定白细胞介素-6与其它生长因子的组合可能影响脐带血HSC的命运。组合TSFI显著增加了CFU-GM、CFU-GEMM和总爆式/集落形成单位的倍扩增，指示出更好的短期再植能力。相反，生长因子组合TS和粒细胞集落刺激因子(G)(即TSG)导致了类似的活细胞的倍扩增，但分化细胞的比例较高。这种以其它干细胞和祖细胞群体的扩增为代价的向粒系分化的移动，可能以移植后更少的有益效果导致最原始的HSC的耗尽。

认为通过采用本发明的方法和组合物，能够使HSC(如HPC)的培养进行6、7或8周，并且可以在这个时间间隔期间采收造血祖细胞以用于随后与含有促进造血细胞的维持、扩增和/或分化的造血生长因子的培养条件接触。

因此，在进一步的实施方式中，向用于培养HSC和/或HPC的培养基中提供生长因子TSFI，从而将所述期间增加至前述细胞可以培养的期间。优选地，它们可以培养6周的时间，更优选7周的时间，以及甚至更优选8周的时间。在本发明的进一步实施方式中，除了生长因子组合TSFI之外，还提供了试剂如ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合。

5.在选定的培养基的条件下使用ficolin和低氧来培养HSC和/或HPC

在本发明的进一步方面，提供了在低氧环境中并且在生长因子和试剂(如ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合)的存在下以及与环境水平相比在降低的氧浓度的存在下培养HSC和/或HPC的方法和组合物。

在一个实施方式中，在培养基中并且在ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合中的任何一种的存在下，以及在氧浓度低于环境氧浓度的环境中，以任何前述的浓度和组合提供生长因子组合TSFI。在优选的实施方式中，氧的浓度低于20％。在更优选的实施方式中，在其中5％～10％的氧水平的存在下提供生长因子组合TSFI，这增强了所有目标群体的倍扩增。在特别优选的实施方式中，在10％的氧水平的存在下提供生长因子组合TSFI，这可以提供增强了倍扩增的所有目标HSC/HPC群体。

通过应用本发明的方法和组合物，已经证明，生长因子组合TSFI在5％和10％的氧水平下增强了所有目标群体的倍扩增，因此其代表了用于增强来自脐带血的可移植细胞剂量的最所需的条件。

本发明人还已经确定，在使用上文所述的方法和组合物中，如果在生长因子组合如TS±F的存在下培养HSC和/或HPC，那么效果是提高了这些细胞的自我更新的概率并且由此降低了分化的概率。

在本发明的进一步实施方式中，可以在生长因子组合TS±F的存在下并且在环境氧水平的存在下培养本发明的造血细胞，从而提供最大化的纯度。在更优选的实施方式中，在生长因子组合TS±F的存在下，氧构成所述培养气氛的约20％。在进一步优选的实施方式中，在约20％的氧水平下提供生长因子组合TS±F，从而提供扩增的同时最大化纯度以提高原始的CD34⁺CD38^—HSC群体的纯度。

在本发明的进一步方面，提供了培养HSC和/或HPC的方法，其中可以在低氧环境中并组合试剂(如ficolin)与优化的生长因子TSFI培养所述HSC和/或HPC，从而提高它们自我更新的概率并且降低分化的概率。在一个实施方式中，在生长因子TSFI的存在下，培养体系中的氧构成所述培养气氛的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％和15％。在另一个实施方式中，在生长因子TSFI的存在下，氧浓度构成培养气氛的约10％。在又另一个实施方式中，在生长因子TSFI的存在下，氧浓度构成培养气氛的约10％。在特别优选的实施方式中，氧浓度构成约5％。

在另一个实施方式中，除了生长因子组合TSFI之外，还提供了ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物，其中氧浓度低于环境水平，并且更优选地低于约10％、低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％或低于约5％。

在优选的实施方式中，除了生长因子组合TSFI之外，还提供了ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物，其中氧浓度为约5％。

在特别优选的实施方式中，除了生长因子组合TSFI之外，还提供了ficolin-1或其片段或功能等价物，其中氧浓度为约5％。

6.以选定的培养基用于培养HSC和/或HPC的组合物

如前所讨论的，与本发明的方法和组合物有关的特别领域感兴趣的生长因子是造血生长因子。因此，本发明的进一步方面，针对的是提供用于在体外延长HPC和/或HSC群体的成活力的培养组合物、或用于在常规生长培养基中培养或扩增HSC和/或HPC群体的培养组合物，所述培养组合物在本发明的方法中使用。

在本发明的实施方式中，提供了组合物，其可以包括ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它们的片段或功能等价物或组合。在优选的实施方式中，将ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、它们的片段或功能等价物或组合添加至培养体系中以便在培养基中构成50ng/mL～200ng/mL。在优选的实施方式中，ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、它们的片段或功能等价物或组合在培养体系中浓度为约50ng/mL～200ng/mL。在更优选的实施方式中，ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、它们的片段或功能等价物或组合在培养体系中的浓度为约50ng/mL～100ng/mL。

在特别优选的实施方式中，提供在培养体系中的ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、它们的片段或功能等价物或组合的浓度为约50ng/mL、或约51ng/mL、或约52ng/mL、或约53ng/mL、或约54ng/mL、或约55ng/mL、或约56ng/mL、或约57ng/mL、或约58ng/mL、或约59ng/mL、或约60ng/mL、或约61ng/mL、或约62ng/mL、或约63ng/mL、或约64ng/mL、或约65ng/mL、或约66ng/mL、或约67ng/mL、或约68ng/mL、或约69ng/mL、或约70ng/mL、或约71ng/mL、或约72ng/mL、或约73ng/mL、或约74ng/mL、或约75ng/mL、或约76ng/mL、或约77ng/mL、或约78ng/mL、或约79ng/mL、或约80ng/mL、或约81ng/mL、或约82ng/mL、或约83ng/mL、或约84ng/mL、或约85ng/mL、或约86ng/mL、或约87ng/mL、或约88ng/mL、或约89ng/mL、或约90ng/mL、或约91ng/mL、或约92ng/mL、或约93ng/mL、或约94ng/mL、或约95ng/mL、或约96ng/mL、或约97ng/mL、或约98ng/mL、或约99ng/mL、或约100ng/mL。

在又一个实施方式中，可以额外的包括选自于包含白细胞介素3、白细胞介素6和白细胞介素11(I)、干细胞因子(S)、血小板生成素(T)、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和FLT-3配体(F)的群组中的生长因子。

在本发明的另一个实施方式中，以50ng/mL～100ng/mL的浓度提供每种生长因子。在更优选的实施方式中，以约50ng/mL提供T，以约50ng/mL提供S，以约80ng/mL提供F，和以约100ng/mL提供I。在进一步实施方式中，当培养在培养基中包含血小板生成素(T)、干细胞因子(S)、FLT-3配体(F)和白细胞介素-6(I)时，使用生长因子的组合与HPC和/或HSC一起培养。

7.使用选定的培养基组成来HSC/HPC的方法

在本发明的进一步方面，提供了用于在体外培养HSC和/或HPC以生产造血源分化细胞的方法，其中在第一培养步骤中，在条件环境下将第一量的造血祖细胞扩增一段时间，从而相对于所述第一量增加经培养的造血祖细胞的数量或者增加造血祖细胞的数量，由此产生第二量的造血祖细胞。增加经培养的造血祖细胞的数量所需的时间可以由本领域技术人员已知的测量方法来确定，例如测量培养物的细胞数量、光密度或pH，或通过计算细胞的倍增时间。

在第二培养步骤中，将所述第二量的经培养的造血细胞(如造血祖细胞)的至少一部分培养于包括从由上述造血生长因子所构成的群组中选出的至少一种试剂、接种的基质细胞和基质细胞条件培养基的环境中，从而生产造血源分化细胞，所述造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化。

在本发明的方法的应用中，所述培养可以进一步包含可以是多个第二培养步骤的第二培养步骤，它们中的每一个包含仅培养第二量的造血细胞(如HPC)的一部分。

在本发明的进一步方面，将造血祖细胞连续地培养延长的一段时间，并且隔开的时间点或间歇性地采收培养细胞的等分试样。在本发明的实施方式中，将细胞悬浮于含有生长因子和本文所述的其它试剂的培养基中，并且通过搅拌和离心所述培养基来采收所述细胞。因此，在本发明的实施方式中，可以扩增造血祖细胞的数量，并且同时地采收正在扩增的这些细胞的一部分以用于治疗，从而发育出甚至更大群体的分化细胞。

认为本发明集合了造血利基的许多不同方面，包括生长因子的类型及浓度的优化以最大化造血自我更新、其它新颖和已知因子的添加和培养条件及体系的优化。这些方面的总和代表了一种新颖且有效的体系，其用于增加能够再植组织和器官(如移植后的骨髓)的HSC的数量。

与天然产生的细胞群体相比，使用本发明的方法提供了分离的细胞群体具有富集群体的细胞。典型地，所述细胞群体是HSC或HPC细胞群体，其选择性地富集自生物源。所述细胞群体可以包含富集群体的HSC和/或HPC CD34+CD38-或CD133+CD38-细胞。

8.使用根据本发明的方法培养的HSC和/或HPC以用于移植或治疗

在本发明的进一步方面，根据本发明的方法培养的造血细胞可以用于受试者的骨髓移植。

根据本发明的方法培养的造血细胞的潜在应用，可以设想用于补充或替代目前用作疾病(如白血病、淋巴瘤以及其他危及生命的疾病)的疗法的人类自体和异体骨髓移植。

在本发明的进一步方面，提供了治疗需要基于造血干细胞的治疗的个体的方法，其包含：从所述个体或从供体取出造血干细胞；在含有一定量本文所考虑的生长因子组合、有效于促进造血干细胞的扩增的蛋白质(如任何前述的ficolin蛋白质)的培养基中培养所述细胞；采收经培养的细胞；以及将该经培养的细胞移植至所述个体中。

例如，在受试者接受化疗、放射治疗或骨髓移植之前、同时或之后将由本发明的方法生产的HSC供给给该受试者。所述受试者任选地已耗尽骨髓，例如涉及以骨髓损失或贫骨髓为特征的先天性、遗传性或获得性综合症。因此，所述受试者任选地为需要造血的受试者。任选地，所述受试者是骨髓供体或是患有或具有耗尽骨髓风险的受试者。

采用本发明的方法和条件，能够增加培养HPC的时间段并且刺激HPC数量的扩增和/或菌落形成单位的潜能。在一个实施方式中，认为一旦扩增，即可将所述细胞例如返回至体内补充或增补患者的造血祖细胞群。在个体已经经历化疗一段时间之后的情况下，这可能是有利的。另外，有一些遗传性疾病如地中海贫血、镰状细胞性贫血、先天性角化不良、Shwachman-Diamond综合征和Diamond-Blackfan贫血症，其中HPC数量被减少，那么本发明的扩增HSC和/或HPC数量的方法可能是有用的且适用的。

现在将通过参考以下非限制性的实施例来更全面地说明本发明。

实施例

实施例1

CD34⁺细胞富集

根据巴望健康人类研究伦理委员会(Barwon Health Human Research Ethics Committee)(97/14和SJOG139)和迪肯大学人类研究伦理委员会(Deakin University Human Research EthicCommittee)(EC72-2009)的批准，在所有参与者都提供了书面知情同意书的条件下，在BarwonHealth,Geelong Hospital和St.John of God Hospital Geelong,Australia采集了足月分娩的脐带血。

在采集的24小时内，通过Ficoll-paque Plus(GE Healthcare)密度梯度离心获得了单核细胞，随后使用直接抗体标记的磁珠试剂盒和双柱(Miltenyi Biotec)进行CD34⁺细胞富集。使用细胞等分试样进行流式细胞术分析，且剩余的冷冻保存在复苏冷冻培养基(RecoveryFreezing Media)(Invitrogen)中。

为了确定培养条件对HSC的影响，使用脐带血富集CD34⁺细胞，以得到最小≥80％CD34⁺的纯度和成活力以进行扩增研究。以三种方式来评估培养的造血细胞群体的变体：1)表型，通过流式细胞计检测表面标志物；2)功能，使用CFU测定；和3)基因组，通过实时PCR(图4)。将培养后的目标群体的纯度或集落生成、目标群体数量的倍扩增和相对基因表达作为终点(图5)。

体外扩增

在37℃下将冷冻保存的细胞解冻，转移滴加至10x体积的干细胞系II培养基(StemlineII media)(Sigma Aldrich)中，在室温下在400相对离心力(rcf)下离心10分钟，并且重悬于杜氏磷酸缓冲盐水(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline)(D-PBS,Invitrogen)中以使用台盼蓝染色剂(Trypan Blue stain)(Sigma Aldrich)进行手动活力细胞计数。

在涂布有10μg/ml RetroNectin(重组人纤维连接蛋白片段，Scientifix)的组织培养孔(Interpath)中培养CD34⁺富集的细胞，并且以0.5x10⁴活细胞每1.1cm²接种在1ml干细胞系II培养基中。该培养基中补充有人重组生长因子(Millipore)：血小板生成素(T，50ng/ml)±干细胞因子(S，50ng/ml)±Flt-3配体(F，80ng/ml)±白细胞介素-6(I，100ng/ml)(T、TS、TSF、TSFI)，与血小板生成素+干细胞因子+粒细胞集落刺激因子(TSG)(各100ng/ml，干细胞系II制造商的建议)进行比较。在与外周血(10％，～75mmHg)、脐带血(5％，～38mmHg)和骨髓(2.5％，～19mmHg)(Galaxy R⁺incubators,HD Scientific)一致的生理相关的氧水平下培养细胞，并且与环境氧水平(20％，～150mmHg)(Heraeus incubator,KI Scientific)进行比较，得到总共20个独立的条件。

对于单步扩增，在采收前将细胞培养8周，而对于串行扩增，分别在培养1周和2周后，以每1.1cm²2x10⁴个活细胞、再以1.1cm²3x10⁴个活细胞进行重新接种。通过移液操作和D-PBS洗涤来采收细胞，随后使用台盼蓝染色剂进行成活力计数。

使用阶梯式添加的生活因子T、TS、TSF、TSFI来培养富集的CD34⁺细胞，并且与FDA批准的HSC扩增培养基(干细胞系II)的制造商推荐的–TSG进行比较，并且对于所有的组合，在生理相关的氧水平2.5％、5％和10％以及环境(20％)中培养细胞。

通过流式细胞计测定表型来确定目标群体的纯度。在本研究中，7AAD存活率的平均培养前的数值为85±5％，且CD45+CD34+、CD133+和CD34+CD38--的纯度分别为81±5％、61±8％和2.8±0.1％(数据未示出)。对于培养后的群体，与所有其它生长因子组合(>81±3％,p≤0.01)相比，使用单独的血小板生成素的整个氧气组的存活率都较低(T,60±6％)(图1)。CD45+CD34+的纯度为24±2％，且CD34+CD38--细胞的纯度为2.2±0.4％。但是，来自单独的T条件的细胞不足以用于进一步分析。添加的干细胞因子(S)未导致CD45+CD34+纯度的变化，但是将CD34+CD38--的百分比(4.8±0.6％,p≤0.01)提高到了高于培养前的水平。通过添加Flt-3配体(F)未观察到纯度的显著差异。添加白细胞介素-6(I)对CD133+纯度没有影响(12±1％)，但是与TS或TSF相比，导致了CD45+CD34+和CD34+CD38--细胞的纯度的损失。使用了TSG的所有目标群体的纯度是最低的(p≤0.01)。有趣的是，观察到了氧效应，20％的氧在所有的目标群体中得到了最大的纯度(p≤0.01)(图1)。

倍扩增的检查显示，在5％和10％氧中增加了活细胞的数量，并且当在环境(20％)氧中培养时扩增最低。在5％氧中还增强了CFU-GM的倍扩增，并且在5％和10％氧中增强了总爆式/集落形成单位的扩增。另外，在该研究中，在2.5％氧中观察到的中等水平的倍扩增与体内和体外数据一致。

通过流式细胞计的表型分析

通过流式细胞计(FACSCalibur,Becton Dickinson)测定了培养前和培养后的目标细胞纯度，对于HSC、HPC和多能细胞(CD133-PE Miltenyi Biotec)采用CD45-FITC+CD34-PE+7AAD、CD34-FITC+CD133-PE+7AAD和CD38-FITC+CD34-PE+7AAD；且对于谱系定型细胞采用：CD61-FITC+CD34-PE+7AAD、CD11b-FITC+CD14-PE+7AAD、CD3-FITC+CD19+7AAD(CD11b-FITC Beckman Coulter；其它为BD Biosciences)(图4)。使用MiltenyiBiotec改变的ISHAGE协议测定了活性CD45⁺CD34⁺群体，并且根据公布的建议确定了CD34⁺CD38^--选通。用于扩增实验的富集了CD34⁺的样品具有大于80％7AAD成活力和CD34⁺纯度。

通过集落形成单位(CFU)测定进行功能分析

按照制造商的说明，将培养前和培养后的细胞接种于具有重组细胞因子(H4434；STEMCELL Technologies)的‘完全’甲基纤维素培养基中，并且培育14天以用于爆式形成单位-红细胞(BFU-E)、集落形成单位-粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM)、集落形成单位-粒细胞/红细胞/单核细胞/巨噬细胞(CFU-GEMM)和总爆式/集落形成单位的计数(图4)。

通过每1,000细胞的集落形成单位的数量来确定集落生成。BFU-E和CFU-GM的培养前的数值为71±5和74±5，CFU-GEMM为13±2且总爆式/集落形成单位为158±5每1,000细胞(数据未示出)。培养后评估显示，TS产生了最高数量的BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM和总爆式/集落形成单位(44±5、31±3、4.8±0.5和80±6集落每1,000细胞)。TSF导致了较低集落生成的BFU-E、CFU-GEMM和总爆式/集落形成单位，使用TSFI进一步降低了BFU-E和总爆式/集落形成单位。对于BFU-E和总爆式/集落形成单位，使用TSG的培养得到了与TSFI相当的数值，但是CFU-GEMM的数量甚至更低(p≤0.01)(图1)。

在所有的群体中，使用TS±F获得了最大的培养后纯度和集落生成。特别令人感兴趣的是，使用TS将CD34+CD38--细胞的纯度提高到了比培养前水平更高的水平。在表型和功能上，在TSG的存在下，目标群体的纯度最低。另外，观察到了氧效应，在环境水平下提高了目标群体的纯度，但是未提高集落生成。

RNA、cDNA和实时-PCR

将培养前和培养后的样品储存在Trizol(Invitrogen)中直至使用RNAspin微型RNA分离试剂盒(Illustra)分离RNA，并且使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)进行定量分析。以Superscript III第一链合成试剂盒(Invitrogen)使用随机六聚体进行逆转录。使用7500FAST实时PCR系统(Applied Biosystems)进行实时PCR。将SybrGreen PCR Master Mix(AppliedBiosystems)用于对应于HoxB4(正向：5’-CCTGGATGCGCAAAGTTCA-3’–SEQ ID:7，反向：5’-GCTTGGGCTCCCCGC-3’–SEQ ID:8)和Nf-yα(正向：5’-GATGGTCATGATGGTTCCTG-3’–SEQ ID:9，反向：5’-GGTATTGTTTGGCATTCACG-3’–SEQ ID:10)(Sigma Genosys)的引物对。将Taqman PCR Master Mix(Applied Biosystems)用于CD34预优化的基因表达分析(Hs00156373_m1；Applied Biosystems)，并用于管家基因β肌动蛋白(正向：5’-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3’–SEQ ID:11，反向：5’-TGATCCACATCTGCTGGAAGG-3’–SEQ ID:12，探针：fam-ATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC-tamra–SEQ ID:13)和GAPDH(正向：5’-CCACATCGCTCAGACACCAT-3’–SEQ ID:14，反向：5’-CCAGGCGCCCAATACG-3’–SEQ ID:15，探针：fam-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-tamra–SEQ ID:16)(Sigma Genosys)。

在每个时间点，相对于所述两种管家基因的平均值，对基因表达水平进行定量(图5)。相对于在10％氧中的TSFI，确定了串行扩增过程中的基因表达。结果表示为平均值±标准误差。采用软件程序Minitab(版本15)图基比较(Tukey’s comparison)进行了单向方差分析(one-way ANOVA)，显著性水平p≤0.05。

纯度和倍扩增的测定

对单步扩增的培养前和培养后进行了细胞评估，并且在串行扩增过程中每周一次。使用培养前和培养后的目标群体纯度和集落形成单位的集落生成来确定细胞群体比例的整体变化(图5)。

倍扩增反映了在培养后的目标细胞数量的增加。在每个时间点，将活细胞数乘以特定目标细胞群体的纯度或集落生成，由此得出每个时间点的目标细胞数量。将培养前和培养后的这些数量进行比较以确定这些细胞群体的倍扩增。累积倍扩增指示了目标群体数量在连接几周的倍扩增。

结果表示为平均值±标准误差。通过图基的成对比较(Tukey’s pairwise comparison)采用一般线性模型的统计分析进行了双向方差分析(two-way ANOVA)，显著性水平p≤0.05。

临床上有效的提高了倍扩增的HSC、HPC和多能细胞

主要的临床兴趣是倍扩增的细胞群体，其代表了增加的移植细胞剂量。单独的血小板生成素(T)不足以确保临床上有效的扩增，其仅使活细胞数量增加了一倍(2.0±0.3)，未改变CD45+CD34+细胞数量，并且仅使CD34+CD38--细胞数量增加了一倍(2.6±0.8)(图2)。没有充足的细胞用于分析CD133+细胞或CFU分析。添加干细胞因子(S)将活细胞的扩增提高至25±4倍，相应地增加了所有的目标群体。使用添加的Flt-3配体(F)观察到了最小的增强。但是，在培养基中包含白细胞介素-6(I)极大地提高了活细胞的倍扩增(99±7倍)和所有目标群体(p≤0.01)(图2)。具体地，CD45+CD34+、CD133+和CD34+CD38--细胞数量分别被扩增了21±3、19±2和78±10倍。TSG导致了类似的活细胞的扩增，但是不是目标HSC和HPC群体；表现出更大程度的分化，主要是沿向粒细胞谱系(数据未示出)。观察到了活细胞倍扩增的温和的氧效应，在5％和10％氧中整体上增加，且在20％氧中最低(p≤0.04)。

使用CFU分析功能性地测定了多能细胞的倍扩增。生长因子组合或氧水平对BFU-E的倍扩增没有影响(18±1.2倍)(图2)。但是，与所有生长因子组合相比，TSFI极大地增强了CFU-GM和总爆式/集落形成单位的扩增(27±3和22±3倍)，并且与TSG(7±1,p≤0.01)相比，增强了CFU-GEMM的扩增(17±3)。另外，5％氧增强了CFU-GM的倍扩增(≤0.02)，并且在5％和10％氧中培养增强了总爆式/集落形成单位的扩增，而20％氧导致了这两种集落类型的较低的扩增(p≤0.01)。与纯度数据对比起来，来自倍扩增的两个表型和功能分析的结构表明，TSFI得到了最佳扩增的HSC、HPC和多能细胞，最佳的氧水平为5％和10％。

通过多个脐带血单位验证一致的增强的扩增

为了确定的优化条件的临床有效性，在10个独立的脐带血单位中评估了倍扩增，在5％和10％氧中使用TSFI对每一个进行培养。所有群体的平均值图1和图2中所列的数据一致，87±13倍扩增的活细胞，分别为19±3、17±5和73±15倍扩增的CD45+CD34+、CD133+和CD34+CD38--细胞。集落生成群体的平均扩增(BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM、总爆式/集落形成单位)在25±5至36±6之间(表1)。虽然通过多个目标群体看到了一系列数值，在5％和10％氧中的TSFI的优化的条件在所有样本中导致了所有群体的扩增，由此在多个脐带血单位中表现出了稳健的效果(表1)。

表1显示了在5％和10％氧中用TSFI进行脐带血体外扩增的验证。确定了优化的条件(TSFI在5％和10％氧中)用于多个脐带血单位的临床有效性。通过表型和功能评估了目标细胞群体的倍扩增。生长因子组合由血小板生成素(50ng/ml)、干细胞因子(50ng/ml)、Flt-3配体(80ng/ml)和白细胞介素-6(100ng/ml)构成。N＝10个独立的脐带血单位，每个进行一式三份。

用增强的累积HSC和祖细胞倍扩增进行的串行扩增

扩增条件可以导致HSC的耗尽和随之而来的长期再增殖潜力的损失。通过检查累积倍扩增，串行扩增间接地评估了这种损失。将优化的条件(TSFI在5％和10％氧中)与在20％氧中的TSG进行了比较。

流式细胞计分析显示，在20％氧中TSG在三周之后在培养物中产生了最大的总存活细胞数；但是，与此同时地发生有较低扩增的CD45+CD34+(p≤0.01)(图3)。相比而言，在5％和10％氧中的TSFI导致了增强累积倍扩增的CD45+CD34+细胞(p≤0.01)。关于嗜中性粒细胞和巨核细胞前体的扩增，在20％氧中的TSG主要导致粒系分化，而在5％和10％氧中的TSFI导致了巨核细胞的增强扩增(CD61+)和粒细胞的连续扩增(CD11b+CD14-，N＝1脐带血一式三份，数据未示出)。在单步和串行扩增中，无论如何也未检测到B细胞(CD19+)或T细胞(CD3+)，由此确认扩增的细胞保持了低的免疫原性(数据未示出，N＝4个脐带血，每个一式三份)。

经过3周的串行扩增的功能评估显示，在20％氧中的TSG导致了低累积倍扩增的BFU-E，其在第3周降低至低于最初的扩增水平，同时完全耗尽CFU-GEMM。比较起来，用在5％氧中的TSFI(CFU-GM和CFU-GEMM)以及用在10％氧中的TSFI(所有的爆式和集落形成单位，p≤0.02)增强了累积倍扩增。值得注意的是，当与5％TSFI和20％TSG两者相比时，在10％氧中的TSFI显示显著地增强了CFU-GM和总爆式/集落形成单位的扩增(p≤0.01)(图3)。

根据单步和串行扩增的发现，造血干细胞和祖细胞标志物CD34的相对基因表达水平、以及与HSC自我更新相关的基因HoxB4和Nf-yα的相对基因表达水平，使用在10％氧中的TSFI是最高的，并且使用在5％和10％氧中的TSFI高于使用TSG20％氧(p≤0.01)，表明更大比例的CD34+细胞和自我更新HSC存在于整个培养期间(图3)。总的来说，所有目标群体和相对基因表达水平的分析表明，在10％氧中的TSFI产生了最大累积倍扩增和比例的HSC、HPC和多能细胞，降低了HSC和HPC耗尽的可能性。

实施例2

长期培养

CD34+造血祖细胞来源于人类脐带血，是使用磁性抗人CD34+珠(Miltenyi Biotec)分离得到的。所有培养条件都是在含有实施例1中所述的生长因子和其它添加剂的干细胞系培养基(Millipore)接种1～2x10⁴个细胞。对每种培养条件，进行培养物一式三份。因此，每种培养条件使用三个培养孔，每个孔在1ml培养基中接种1～2x10⁴个CD34⁺细胞。在至少三个不同的脐带血样本上独立地进行所有实验。在低氧培养箱中，在2％、5％、10％或20％(大气)氧压的存在下培养细胞。在整个培养期间有规律地监控氧压。

在培养8天后，从所有培养孔中采收所有细胞，计数并且进行表面抗原染色。用于表面表型测定的抗体包括抗-CD34(BD Biosciences)、抗-CD133(Miltenyi Biotec)、抗-CD38(BD Biosciences)和抗-CD45(BD Biosciences)抗体，用于评估祖细胞的分布。通过使用7AAD染色来评估细胞成活力。使用多参数FACScan流式细胞计分析并且根据实施例1中描述的方法进行细胞的流式细胞计分析。根据尺寸(前向和侧向散射)和成活力(7AAD-)对细胞进行选通。适当的对照包括匹配的同型抗体以确立阳性和阴性的象限，以及适当的单色染色剂以确立补偿。对于每个样品，采集至少10,000个列表模式事件。

集落形成分析

为了确定HPC是否保留了产生髓系和红系集落的能力，如下进行了甲基纤维素分析。向3.0ml具有细胞因子(IL-320ng/ml；GMCSF30ng/ml；红细胞生成素3IU/ml；干细胞因子50ng/ml；都来自Stem Cell Technologies,Vancouver)加上0.5ml的DMEM(2％FCS，10IV/ml青霉素，10ug/ml链霉素，1mM L-谷氨酰胺)的甲基纤维素培养基加入1x10⁴/ml的细胞。使用注射器和钝针以避免气泡，将1ml该混合物加入到刻痕的陪替氏培养皿中。对每个条件进行一式三份的分析。然后将陪替氏培养皿放置在在具有5％CO₂培育箱中在37℃下培养10～14天。在10～14天之后，通过人工计数来确定集落数。将积聚了40个以上细胞的集落评价为了阳性集落。在14～21天后基于显示为血红蛋白的金棕色的色素来评价红系集落，而粒细胞集落则通过他们的主要透明外观来鉴定。将混合的集落定义为含有髓样细胞、红系细胞和巨核细胞前体的集落。

实施例3

培养条件的优化

在由50ng/ml血小板生成素、80ng/ml的Flt-3配体、100ng/ml白细胞介素-6、50ng/ml干细胞因子(SCF)和100ng/ml的G-CSF构成的生长因子的不同组合的存在下，在2％、5％、10％或20％氧的存在下，将来自10个不同的脐带血样本的细胞培养8天(图1)。在所有测试的样本中，血小板生成素、Flt-3配体、SCF和白细胞介素-6(TFSI)的组合无论是在5％还是在10％O₂中，都提供了最大总扩增的CD34+CD45+造血细胞，平均为30倍增加(相比于培养前的数值)(图6)。这在集落分析中甚至更加明显(图7)。

已经证明，脐带血单位之间的细胞变化性可对扩增能力造成影响。使用十个独立的脐带血单位测试了如上所述的优化的体外扩增条件以确认一致性。发现在用TSFI在5％和10％氧中那些扩增，每个脐带血样本中的所有目标群体都经历了扩增。由于平均库存的脐带血单位仅含有足够用于移植入体重<40kg的接受者的细胞(Kogler G.,et al.,1998)，所有>3的倍扩增值是用于临床应用的优选最小目标。优化的条件表明，这在10个样本中有9个能够实现，剩余的脐带血单位通过表型评估(3.5～22倍)和通过功能分析(1.4～2.9倍扩增)显示出合理的扩增。一致实现的较高的扩增数值使得其中扩增部分的脐带血体积的协议可行，允许来自同一脐带血单位的未操纵的细胞和扩增的细胞两者能够移植，由此以最小的重建延迟最大化长期植入的可能性并且不增加GvHD。

评估了采用所述优化的培养条件的长期再增殖潜力，并且确定相比于在20％氧中的TSG(血小板生成素(T)+干细胞因子(S)+粒细胞集落刺激因子(G))，优化的条件(TSFI在5％和10％氧中)在所有目标细胞和集落群体中产生了显著更高的累积倍扩增。另外，在10％氧中的TSFI显示出增强且连接扩增的CD45⁺CD34⁺细胞、CFU-GM、CFU-GEMM和总爆式/集落形成单位，由此展现出造血干细胞和祖细胞随时间推移的更好的维持和扩增。比较而言，在20％氧中的TSG导致了CFU-GEMM的分化和耗尽，表明了自我更新的HSC的损失。在使用上述的优化的培养条件中发现，临床相关基因CD34⁺以及自我更新相关基因HoxB4和Nf-yα(Sharma,S.,et al.,2006；Zhu J.,et al.,2005；Stein M.I.,et al.,2004)的相对表达水平，使用在10％氧中的TSFI时是最高的，并且在整个患行扩增中，在5％和10％氧中的TSFI都高于在20％氧中的TSG。

实施例4

Ficolin的影响

采用实施例3(TFSI在5％或10％O₂中)中最好的方法，在TFSI生长因子的存在下，检查了以50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml向培养基中添加ficolins-1、ficolin-2或ficolin-3的效果。对于全部的ficolin，添加200ng/ml在任何实验中都未证明是显著有益的(数据未示出)。50ng/ml和100ng/ml的Ficolin-1诱导了总细胞数以及CD34+细胞、CD34+CD133+和CD34+CD38-细胞的一致增加，在10％O₂下最显著(图8)。这种增强的扩增也反映为增加的集落形成单位(图9)。尽管在5％O₂下ficolin-1对表型扩增的影响不是那么显著(图10)，但是这种培养条件在扩增集落形成单位上是最有效的，与单独的TFSI相比，在100ng/ml下在5％O₂中看到了总集落数大于3-倍的增加(图11)。

ficolin-2对表型的影响在10％O₂下是最小的(图6)，但是在5％O₂下更加显著(图10)。再次，由表型测定的扩张低估了在两个氧浓度下的集落形成细胞的扩增程度(图9，图11)。使用ficolin-3，这种差异甚至更加显著，其中在任何一个氧浓度下，表形定义的HSC没有扩增的迹象(图8，图10)，但集落形成细胞的扩增清晰，特别是在100ng/ml(图9，图11)。

在所有实验中特别值得注意的是，在存在而不是不存在ficolin下的最原始的类的集落形成细胞、CFU-GEMM的维持(图9,图11)，表明这些试剂有选择性地保存原始的HSC群体。

但应当理解的是，在不脱离本文所概述的本发明的精神的情况下，可以进行各种其它修改和/或改变。

Claims

1.一种延长HPC和/或HSC群体的体外成活力、或者培养或扩增HPC和/或HSC群体的方法，所述方法包括在ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3或它们的片段或功能等价物中的至少一种的存在下培养所述HPC和/或HSC群体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述HPC和/或HSC的更新能力和/或多能性被维持或提高。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中进一步在氧气浓度低于正常环境氧浓度的环境中培养所述HSC和/或HPC。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中在约50ng/ml～200ng/ml范围浓度的至少一种ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3及它们的片段或功能等价物的存在下培养所述HSC和/或HPC。

5.根据权利要求4所述的方法，其中在ficolin-1或其片段或功能等价物的存在下培养所述HSC和/或HPC。

6.根据权利要求3～5中任一项所述的方法，其中氧的浓度低于约20％。

7.根据权利要求3～6中任一项所述的方法，其中氧的浓度低于约12％。

8.根据权利要求3～7中任一项所述的方法，其中氧的浓度为约5％～10％。

9.根据权利要求3～8中任一项所述的方法，其中氧的浓度为约5％。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中在从包含白细胞介素3、白细胞介素6和白细胞介素11、干细胞因子、干细胞配体、FLT-3配体和血小板生成素的群组中选出的生长因子的存在下培养所述HSC和/或HPC。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中在生长因子血小板生成素、干细胞因子、Flt-3配体和白细胞介素6的存在下培养所述HSC和/或HPC。

12.根据权利要求10或权利要求11所的方法，其中以约50ng/mL～100ng/mL的浓度提供所述生长因子。

13.根据权利要求11所述的方法，其中以约50ng/mL提供血小板生成素，以约50ng/mL提供干细胞因子，以约80ng/mL提供Flt-3配体且以约100ng/mL提供白细胞介素6。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中培养所述HPC以相对于初始的HPC数量增加HPC的数量以生产第二量的HPC。

15.根据权利要求14所述的方法，其中将所述第二量的HPC分离并且进一步培养于单独的培养基中。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述单独的培养基含有从包含白细胞介素3、白细胞介素6和白细胞介素11、干细胞因子、干细胞配体、FLT-3配体和血小板生成素的群组中选出的生长因子，所述生长因子促进HPC的维持、扩增和/或分化，从而生产造血源分化细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述培养基包括接种的基质细胞和/或为基质细胞条件培养基。

18.根据权利要求1～17中任一项所述的方法，其中在HPC和/或HSC的扩增和/或分化之前，将HPC培养6～8周的时间。

19.根据权利要求1～18中任一项所述的方法，其中所述HSC获自于从包含未分级的骨髓、脐带、外周血、肝脏、胸腺、淋巴和脾脏的群组中选出的血液制品。

20.一种用于延长培养物中的HSC和/或HPC的体外成活力的培养基，其包括从包含白细胞介素3、白细胞介素6和白细胞介素11、干细胞因子、干细胞配体、FLT-3配体和血小板生成素的群组中选出的造血生长因子以及至少一种用于增强HSC或HPC的自我更新和/或抑制HSC或HPC的分化的试剂。

21.根据权利要求20所述的培养基，其中所述试剂选自于由ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、和它们的片段或功能等价物所构成的群组。

22.根据权利要求21所述的培养基，其中所述ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、或它们的片段或功能等价物以约50ng/ml～200ng/ml范围的浓度存在。

23.根据权利要求22所述的培养基，其中所述至少一种试剂是ficolin-1或其片段或功能等价物。

24.一种细胞群体，其衍生自根据权利要求1～19中任一项所述的方法培养的HSC和/或HPC。

25.一种细胞群体，其衍生自使用权利要求20～23中任一项所述的培养基培养的HSC和/或HPC。

26.衍生自使用权利要求20～23中任一项所述的培养基并根据权利要求1～19中任一项所述的方法培养的HSC和/或HPC的细胞群体。

27.根据权利要求24～26中任一项所述的衍生自HSC和/或HPC的细胞群体，其中所述衍生的细胞是扩增的HSC和/或HPC细胞。

28.根据权利要求24～26中任一项所述的衍生自HSC和/或HPC的细胞群体，其中所述细胞是CD34+细胞、CD34+CD133+细胞和CD34+CD38-细胞。

29.根据权利要求24～28中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞可以配制用于临床造血干细胞移植或用于在有需求的受试者中增强造血功能。

30.根据权利要求29所述的细胞群体，其中所述受试者是人类。

31.一种治疗与缺乏造血功能相关的病症的方法，包含向有需要的受试者给药治疗有效量的根据权利24～28中任一项所述的细胞群体。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。

34.根据权利要求1所述的方法，其基本上相同于上文参照任何实施例和/或附图的描述。

35.根据权利要求20所述的培养基，其基本上相同于上文参照任何实施例和/或附图的描述。