CN110093313B

CN110093313B - 促进造血干/祖细胞分化为红系细胞的诱导培养基及应用

Info

Publication number: CN110093313B
Application number: CN201810081321.7A
Authority: CN
Inventors: 裴雪涛; 李艳华; 陈琳; 聂纪芹; 习佳飞; 岳�文; 姚海雷; 张博文
Original assignee: South China Institute Of Biomedicine; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: South China Institute Of Biomedicine; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2038-01-29
Also published as: CN110093313A

Abstract

本发明涉及红系细胞体外诱导分化的方法，具体涉及一种促进造血干/祖细胞分化成红系细胞的诱导培养基、方法及应用。所述诱导培养基中包括天冬氨酸和/或丝氨酸。所述方法包括将造血干/祖细胞扩增培养；将扩增后的造血干/祖细胞在诱导培养基中培养，所述诱导培养基中包含天冬氨酸和/或丝氨酸。本发明通过研究发现天冬氨酸和丝氨酸对于红系细胞的诱导分化作用，从而提供了一种可以用来作为诱导分化成红系细胞的培养基以及用来诱导分化成红系细胞的方法，该培养基以及该方法可以显著促进红系细胞的诱导分化，有利于提高红系细胞的表达量以及红系细胞的数量。

Description

促进造血干/祖细胞分化为红系细胞的诱导培养基及应用

技术领域

本发明涉及红系细胞体外诱导分化的方法，具体涉及一种促进造血干/祖细胞分化成红系细胞的培养基、方法及应用。

背景技术

很多因素均能够影响造血干/祖细胞在体外诱导分化为红系细胞，包括造血细胞来源、细胞因子等等。Daud在Metabolic Profiling of hematopoietic stem andprogenitor cells during proliferation and differentiation into red bloodcells中的研究提示，细胞代谢的变化对造血干/ 祖细胞扩增和分化为红细胞有重要的影响作用。

有关红系细胞在体外的诱导和成熟有待进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一，从而可以使得造血干/ 祖细胞诱导分化为红系细胞，促进红系细胞的表达和数量。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够促进造血干/祖细胞分化成红系细胞的培养基及其应用、以及提出一种能够促进造血干/祖细胞分化成红系细胞的方法。

本发明基于发明人的如下发现获得的：

发明人以带血单个核细胞为种子细胞，经过体外扩增和红系诱导，检测诱导过程中氨基酸水平的变化。然后发现了在体外诱导分化成红系细胞的过程中，培养基中天冬氨酸 (Asp)和丝氨酸(Ser)的消耗最为明显。进一步通过实验发现，单独或共同补加以上两种氨基酸能够提高红系细胞的细胞数以及红系细胞的表达量，可以促进红系细胞的诱导分化。

因此，基于发明人的以上发现，根据本发明的一方面，本发明提供了一种促进造血干/ 祖细胞分化为红系细胞的诱导培养基，所述培养基中包括天冬氨酸和/或丝氨酸。当培养基中含有天冬氨酸或者丝氨酸或者同时含有天冬氨酸和丝氨酸时，所述培养基可以用来作为诱导分化成红系细胞的培养基，从而可以显著促进红系细胞的诱导分化，有利于提到红系细胞的表达量以及红系细胞的数量。

根据本发明的一些实施例，所述诱导培养基可以进一步包括如下附加技术特征：

根据本发明的一些实施例，所述诱导培养基中所述天冬氨酸的浓度为50～200nmol/mL；所述丝氨酸的浓度为200～400nmol/mL。此时可以发挥红系细胞诱导分化的较佳效果，浓度过低时，不利于发挥诱导分化的作用；而超过一定的浓度，诱导分化的效果增加不显著，因此，当培养基中天冬氨酸的浓度为50～200nmol/mL；所述丝氨酸的浓度为200～400 nmol/mL时，可以发挥较佳的效果。

根据本发明的一些实施例，所述诱导培养基中所述天冬氨酸和所述丝氨酸的摩尔比为： (50～200)：(200～400)。当在培养基中同时添加天冬氨酸和丝氨酸时，相比较于单一添加天冬氨酸或者单一添加丝氨酸，红系细胞诱导分化的效果更为显著。

根据本发明的一些实施例，所述诱导培养基进一步包括Stemspan基础培养或者SCGM 基础培养基。本领域技术人员可知，其他可以用于造血干/祖细胞培养或者增殖或者红系增殖诱导的培养基均可以作为所述扩增和诱导培养基的基础培养基，然后在基础培养基的基础上添加天冬氨酸和/或丝氨酸，可以促进造血干/祖细胞诱导分化为红系细胞。

根据本发明的一些实施例，所述诱导培养基进一步包括干细胞因子(SCF)，所述干细胞因子的浓度为30～250ng/mL；

胰岛素样生长因子(IGF-1)，所述胰岛素样生长因子的浓度为10～100ng/mL；

红细胞生成素(EPO)，所述红细胞生成素的浓度为1～20U/mL；

转铁蛋白，所述转铁蛋白的浓度为50～400μg/mL；

地塞米松，所述地塞米松的浓度为0.1～5μM；

谷氨酰胺，所述谷氨酰胺的浓度为1～10mM；

和类脂，所述类脂的浓度为10～100μg/mL。

本发明中，类脂指的是在结构或者性质上与油脂相似的天然化合物，可以为蜡、磷脂、萜类和甾族化合物。

以上物质，与天冬氨酸和/或丝氨酸共同组成诱导培养基，可以作为红系细胞诱导分化的培养基。该培养基从而可以显著促进红系细胞的诱导分化，有利于提到红系细胞的表达量以及红系细胞的数量。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种天冬氨酸和/或丝氨酸在促进造血干/祖细胞分化成红系细胞中的应用。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种促进造血干/祖细胞分化成红系细胞的方法，包括：将造血干/祖细胞扩增培养；将扩增后的造血干/祖细胞在诱导培养基中培养，所述诱导培养基中包含天冬氨酸和/或丝氨酸。

根据本发明的一些实施例，所述方法可以进一步附加如下技术特征：

根据本发明的一些实施例，所述造血干/祖细胞来自于外周血、脐带血和/或骨髓。

根据本发明的一些实施例，所述方法能够提高红系细胞的表达和数量。

根据本发明的一些实施例，所述诱导培养基中所述天冬氨酸的量为：50～200nmol/mL；所述诱导培养基中所述丝氨酸的添加量为：200～400nmol/mL。

根据本发明的一些实施例，所述天冬氨酸和所述丝氨酸的摩尔比为(50～200)：(200～400)。

根据本发明的一些实施例，所述方法包括：将扩增后的造血干/祖细胞在诱导培养基中培养7～25天。

根据本发明的一些实施例，所述方法包括：将所述造血干/祖细胞在不含有天冬氨酸和丝氨酸的扩增培养基中培养5～10天后，更换诱导培养基，然后在诱导培养基中培养7～25 天。

根据本发明的一些实施例，所述扩增培养基为Stemspan基础培养基或者SCGM基础培养基。本领域技术人员可知，其他可以用于造血细胞培养或者增殖的培养基均可以作为扩增培养基，用于造血干/祖细胞的扩增培养。

根据本发明的一些实施例，所述扩增培养基包括如下组分：

干细胞因子(SCF)，所述干细胞因子的浓度为30～100ng/mL；

血小板生成素(TPO)，所述血小板生成素的浓度为5～50ng/mL；

白介素-3(IL-3)，所述白介素-3的浓度为10～50ng/mL；

白介素-6(IL-6)，所述白介素-6的浓度为1～50ng/mL；

和Flt3配体，所述Flt3配体的浓度为10～100ng/mL。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种促进造血干/祖细胞分化成红系细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒中包括天冬氨酸和/或丝氨酸。

根据本发明的一些实施例，所述试剂盒包括第一培养基和第二培养基，所述第一培养基为Stemspan基础培养基或者SCGM基础培养基；所述第二培养基包括Stemspan基础培养基或者SCGM基础培养基中的一种；与天冬氨酸和丝氨酸中的至少一种，所述天冬氨酸的量为：50～200nmol/mL，所述丝氨酸的浓度为200～400nmol/mL。

根据本发明的一些实施例，所述第一培养基包括如下组分：干细胞因子(SCF)，所述干细胞因子的浓度为30～100ng/mL，血小板生成素(TPO)，所述血小板生成素的浓度为5～50ng/mL，白介素-3(IL-3)，所述白介素-3的浓度为10～50ng/mL，白介素-6(IL-6)，所述白介素-6的浓度为1～50ng/mL，和Flt3配体，所述Flt3配体的浓度为10～100ng/mL，所述第二培养基包括如下组分：干细胞因子(SCF)，所述干细胞因子的浓度为30～250ng/mL，胰岛素样生长因子(IGF-1)，所述胰岛素样生长因子的浓度为10～100ng/mL，红细胞生成素(EPO)，所述红细胞生成素的浓度为1～20U/mL，转铁蛋白，所述转铁蛋白的浓度为50～400μg/mL，地塞米松，所述地塞米松的浓度为0.1～5μM，谷氨酰胺，所述谷氨酰胺的浓度为1～10mM，类脂，所述类脂的浓度为10～100μg/mL，天冬氨酸和/或丝氨酸，所述天冬氨酸的量为：50～200nmol/mL，所述丝氨酸的浓度为200～400nmol/mL。

根据本发明的一些实施例，所述试剂盒包括独立的试剂单元，每个试剂单元中天冬氨酸的量为：50～200nmol/mL；所述丝氨酸的浓度为200～400nmol/mL。将试剂盒中的天冬氨酸或者丝氨酸或者天冬氨酸和丝氨酸的组合物制备成独立的包装，即分成一个个独立的试剂单元，每个试剂单元中天冬氨酸的量为50～200nmol/mL，丝氨酸的量为200～400nmol/mL，从而方便使用。本领域技术人员也可以根据实际需要将每个试剂单元的浓度调整为 50～200nmol/mL或者200～400nmol/mL的整倍数，根据实际使用需要进行相应的稀释。

本发明所取得的有益效果为：本发明通过研究发现天冬氨酸和丝氨酸对于红系细胞的诱导分化作用，从而提供了一种可以用来作为诱导分化成红系细胞的培养基以及一种可以用来诱导分化成红系细胞的方法，该培养基以及该方法可以显著促进红系细胞的诱导分化，有利于提高红系细胞的表达量以及红系细胞的数量。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施例红系细胞诱导过程中培养上清中氨基酸的变化图。

图2为根据本发明的一个实施例红系细胞诱导过程中培养上清中丝氨酸和天冬氨酸的变化图。

图3为根据本发明的一个实施例诱导培养不同天数不同组细胞数的变化图。

图4为根据本发明的一个实施例诱导培养不同天数不同组细胞存活率的变化图。

图5a为根据本发明的一个实施例对照组CD71以及CD235a检测流式细胞图。

图5b为根据本发明的一个实施例补加Ser组CD71以及CD235a检测流式细胞图。

图5c为根据本发明的一个实施例补加Asp组CD71以及CD235a检测流式细胞图。

图5d为根据本发明的一个实施例补加Ser+Asp组CD71以及CD235a检测细胞图。

图6为根据本发明的一个实施例不同处理组对应得到的含有不同细胞表面标志物的红系细胞表达率(％)图。

图7为根据本发明的一个实施例不同处理组对应得到的含有不同细胞表面标志物的红系细胞的细胞数图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

如上所述，为了解决红系细胞体外诱导分化量少的问题，本发明提供了一种通过在培养基中添加氨基酸的方法以及相应的培养基，从而可以促进分化成红系细胞，从而提高红系细胞的细胞数以及红系细胞的表达量。

在本文中，造血干/祖细胞是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，造血干/祖细胞具有高度的自我更新或自我复制能力，可以分化成所有类型的血细胞。本发明提供的诱导培养基可以促进造血干/祖细胞分化成红系细胞。造血干/祖细胞在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为不同的祖细胞，例如红细胞系祖细胞。

在本文中，术语“红系细胞”包括红系祖细胞及其成熟阶段的细胞。红系祖细胞可以从各种来源中获得，例如外周血、脐带血和骨髓中造血干/祖细胞。红系祖细胞分化为成熟红细胞，该红细胞生成由以下阶段组成：(a)从造血干/祖细胞分化为红系祖细胞；(b)红系祖细胞分化为原红细胞；(c)从原红细胞分化为早幼红细胞；(d) 从早幼红细胞分化为中幼红细胞；(e)从中幼红细胞分化为晚幼红细胞；(f)从晚幼红细胞分化为网织红细胞；(g)从网织红细胞分化为红细胞。在文本中红系细胞包括经由红系祖细胞分化成成熟红细胞各个阶段的细胞。其中，脐带血是指胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞和祖细胞，主要包含造血干/ 祖细胞和间充质干细胞。

根据本发明的一些实施例，所述诱导培养基中所述天冬氨酸的浓度为50～200nmol/mL；所述丝氨酸的浓度为200～400nmol/mL。发明人研究发现，在红系细胞诱导分化时，所述诱导培养基中天冬氨酸的浓度可以为50～200nmol/mL，具体可以为60～200nmol/mL， 70～200nmol/mL，80～200nmol/mL，90～200nmol/mL，100～200nmol/mL，110～200nmol/mL， 120～200nmol/mL，130～190nmol/mL，140～180nmol/mL，150～200nmol/mL，160nmol/mL 等等。诱导培养基中所述丝氨酸的浓度可以为200～400nmol/mL，具体可以为210～400 nmol/mL，220～400nmol/mL，230～400nmol/mL，240～400nmol/mL，250～400nmol/mL， 260～380nmol/mL，270～370nmol/mL，280～360nmol/mL，290～350nmol/mL，300～350 nmol/mL，310nmol/mL，320nmol/mL，330nmol/mL，340nmol/mL。

根据本发明的一些实施例，所述诱导培养基同时含有天冬氨酸和丝氨酸的组合物时，所述天冬氨酸和所述丝氨酸的摩尔比为：(50～200)：(200～400)。当同时含有天冬氨酸和丝氨酸时，红系细胞的诱导效果更好。而且，当天冬氨酸和丝氨酸的摩尔比为(50～200)： (200～400)时，能够显著提高红系细胞的表达以及提高红系细胞的数量。

造血干/祖分化为红系细胞，可以使用例如诱导红系细胞分化的培养基。该培养基可以是无血清的或者是添加了血清、血浆、人或牛血清白蛋白的培养基，并且所述培养基可以含有SCF、EFO、TPO、地塞米松、胰岛素、氢化可的松和转铁蛋白等等。

根据本发明的一些实施例，所述可以促进红系细胞分化的诱导培养基进一步包括：

干细胞因子(SCF)，所述干细胞因子的浓度为30～250ng/mL；

红细胞生成素(EPO)，所述红细胞生成素的浓度为1～20U/mL；

转铁蛋白，所述转铁蛋白的浓度为50～400μg/mL；

地塞米松，所述地塞米松的浓度为0.1～5μM；

谷氨酰胺，所述谷氨酰胺的浓度为1～10mM；

和类脂，所述类脂的浓度为10～100μg/mL。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

其中，本发明中所用到的试剂、仪器以及厂家如下：

流式细胞仪，美国BD公司；

CO2培养箱，美国Thermo公司；

HPLC用到的色谱柱，美国安捷伦公司；

Stemspan培养基，加拿大stemcell公司；

SCGM培养基，cell Genix公司；

干细胞因子(SCF)，购置于peprotech；

血小板生成素(TPO)，购置于沈阳三生制药；

白介素-3(IL-3)，购置于peprotech；

白介素-6，购置于peprotech；

Flt3配体，购置于peprotech；

胰岛素样生长因子(IGF-1)，购置于RD；

地塞米松，购置于sigma；

谷氨酰胺，购置于gibco；

转铁蛋白，购置于sigma；

红细胞生成素(EPO)，购置于协和发酵麒麟(中国)制药

天冬氨酸，SIGM公司；

丝氨酸，SIGM公司；

类脂，购置于GIBCO公司；

其中，Stemspan扩增培养基：包含50ng/ml干细胞因子(SCF)、10ng/ml血小板生成素(TPO)、20ng/ml白介素-3(IL-3)、10ng/ml白介素-6(IL-6)以及50ng/ml Flt3配体。

SCGM诱导培养基：包含100ng/mlSCF、40ng/ul胰岛素样生长因子(IGF-1)、5U/ml红细胞生成素(EPO)、100ug/ml转鉄蛋白、1uM地塞米松、2mM谷胺酰胺及10μg/mL类脂。

实施例一

通过本实施例的实验研究发现，在红系细胞的诱导分化的过程中，天冬氨酸和丝氨酸的变化最为明显。实验过程如下：

(一)脐带血分离单个核细胞

将羟乙基淀粉与脐血(所述脐血为足月妊娠健康胎儿脐血，来源于武警总医院)按照 1:3～1:5的体积比混合，沉降红细胞20-30min，取上清，离心，将细胞悬于生理盐水中，在加入人淋巴细胞分离液的试管中缓慢加入等体积的细胞悬液，离心，分离中间白膜层即单个核细胞。

(二)扩增培养

将步骤(一)制备得到的单个核细胞按照如下步骤进行扩增培养：

按(2.5～3)×10⁶/mL的浓度接种6孔板，2mL/孔，利用Stemspan扩增培养基培养7天。

(三)诱导培养

步骤(二)扩增培养后的细胞离心，去除扩增培养基，细胞按照(2.5～3)×10⁶/mL的密度采用SCGM诱导培养基，继续进行培养，然后分别于诱导第4天、第7天、10天、 13天、16天进行传代培养，传代前取培养上清检测氨基酸的水平，同时以新鲜的SCGM 诱导培养基作为对照，检测氨基酸的水平。其中，氨基酸检测采用OPA(邻苯二甲醛)衍生法，利用安捷伦1100高效液相色谱检测氨基酸的水平。

测定结果如图1和图2所示，其中图1列出了所检测到的氨基酸分别在诱导后的第0天，第7天，第10天，第13天，第16天培养上清中不同氨基酸的水平。图1横坐标对应的是不同诱导天数中不同的氨基酸，其中每种氨基酸对应的诱导天数，从左到右分别为诱导后的第0天，第7天，第10天，第13天，第16天；纵坐标对应的是检测到的氨基酸的水平。横坐标中氨基酸采用本领域通过的氨基酸的表示方法，其中Asp为天冬氨酸，Glu 为谷氨酸，Ser为丝氨酸，His为组氨酸，Gly为甘氨酸，Thr为苏氨酸，Arg为精氨酸，Ala 为丙氨酸，Tyr为酪氨酸，Cyss为胱氨酸，Val为缬氨酸，Met为甲硫氨酸，Phe为苯丙氨酸，Iie为异亮氨酸，Leu为亮氨酸，Lys为赖氨酸，Pro为脯氨酸。从图1可以看出，在培养上清中，所有氨基酸中天冬氨酸和丝氨酸变化最为明显。图2为分别在不同的诱导时间中(诱导第0天，第7天，第10天，第13天，第16天)，诱导培养上清中天冬氨酸和丝氨酸的变化。实验结果表明，在诱导后的第7天、10天、13天、16天，天冬氨酸的含量分别降低了1.57、2.33、5.06、3.26倍，丝氨酸的含量分别降低14.73、16.21、11.04、2.55 倍。

实施例二

本实施例通过如下实验验证了天冬氨酸和丝氨酸对于红系细胞诱导分化的影响。

(一)脐带血分离单个核细胞

按照与实施例一相同的方法，从脐带血中分离得到单个核细胞。

(二)扩增培养

按照与实施例一相同的方法，进行扩增培养。

(三)红系诱导分化

将步骤(二)培养后的细胞中去除掉扩增培养基，然后细胞按照(2～3)×10⁶/mL的密度进行传代培养，同时更换为SCGM诱导培养基，将细胞分为四组，分别为对照组、补加Ser组、补加Asp组、补加Ser+Asp组，其中补加Ser组在SCGM诱导培养基中添加丝氨酸，补加Asp组在SCGM诱导培养基中添加天冬氨酸，补加Ser+Asp组在SCGM诱导培养基中同时添加丝氨酸和天冬氨酸，对照组不添加任何氨基酸，添加同等量的PBS。分别于更换为诱导培养基后的第7天、10天、14天调整细胞密度为(2～3)×10⁶/mL，补加相应的氨基酸于诱导培养基中进行传代培养，并检测细胞数、细胞存活率以及红系细胞表面标志CD71、CD235a的表达。请注意，各项检测在更换新的诱导培养基之前。

其中，天冬氨酸组：更换为SCGM诱导培养基后第7天、第10天、第14天向培养基中添加天冬氨酸，天冬氨酸(Asp)的添加量分别为74.22、117.49和164.94pmol/μL；

丝氨酸组：更换为SCGM诱导培养基后第7天、第10天、第14天向培养基中添加丝氨酸，丝氨酸(Ser)的添加量分别为298.43、300.42和291.15pmol/μL。

混合组：更换成SCGM诱导培养基后第7天、第10天、第14天向培养基中同时添加天冬氨酸和丝氨酸，其中天冬氨酸的添加量分别为74.22、117.49和164.94pmol/μL，丝氨酸的添加量分别为298.43、300.42和291.15pmol/μL。

其中，采用台盼蓝染色进行细胞数和存活率检测。其原理是：当细胞损伤或者死亡时，台盼蓝可以穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以用来鉴别死细胞和活细胞，分析细胞活力。其中，体外诱导培养不同的天数各组细胞数和细胞存活率的结果分别见表1-表3，其中n＝3代表每个实验重复了三次。

表1红系细胞体外诱导第10天不同处理组的细胞数和细胞存活率(n＝3)

	对照组	补加Ser组	补加Asp组	补加Ser+Asp组
					<![CDATA[细胞数(x10<sup>7</sup>)]]>	2.03±0.20	2.80±0.08**	<![CDATA[1.71±0.28<sup>##</sup>]]>	<![CDATA[2.64±0.08<sup>**&&</sup>]]>
存活率(％)	89.60±2.26	94.13±0.55*	<![CDATA[89.50±1.48<sup>##</sup>]]>	<![CDATA[89.40±1.05<sup>##</sup>]]>

注：*与对照组相比，差别显著，p<0.05，**p<0.01；##与补加Ser组相比，差别显著，p<0.01；&&与补加ASP组相比，差别显著，p<0.01

从表1可以看出，体外诱导红系细胞10d，补加Ser组和补加Ser+Asp组细胞数均明显高于对照组，分别为(2.80±0.08)×10⁷VS(2.03±0.20)×10⁷，P＜0.01；(2.64±0.08)×10⁷VS(2.03±0.20)×10⁷，P＜0.01；但补加Ser组和补加Ser+Asp组无差别。补加Ser 组细胞存活率高于对照组，(94.13±0.55)％VS(89.60±2.26)％，P＜0.05；且与补加ASP 组、补加Ser+Asp组差别显著(94.13±0.55)％VS(89.50±1.48)％，P＜0.01，(94.13± 0.55)％VS(89.40±1.05)％，P＜0.01。

表2红系细胞体外诱导第14天不同处理组的细胞数和细胞存活率(n＝3)

	对照组	补加Ser组	补加Asp组	补加Ser+Asp组
					<![CDATA[细胞数(×10<sup>6</sup>)]]>	5.94±0.78	6.15±0.87	5.98±0.91	6.28±0.30
存活率(％)	84.67±2.37	86.23±3.01	88.47±3.05	89.10±3.17

体外诱导第14天，各组无论是从细胞数还是存活率上来看，均未见差别。

表3红系细胞体外诱导第17天不同处理组的细胞数和细胞存活率(n＝3)

	对照组	补加Ser组	补加Asp组	补加Ser+Asp组
					<![CDATA[细胞数(×10<sup>6</sup>)]]>	6.35±0.56	6.93±0.40	7.31±0.49	<![CDATA[10.03±0.40<sup>***###&&</sup>]]>
存活率(％)	69.30±3.82	73.40±2.29	<![CDATA[81.10±2.99<sup>*#</sup>]]>	<![CDATA[80.00±1.93<sup>*#</sup>]]>

注：*与对照组相比，差别非常显著，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；#与补加Ser组相比，差别显著，p<0.05，###p<0.001；

&&与补加ASP组相比，差别显著，p<0.01

从表3可以看出，体外诱导红系细胞，在诱导后的第17天，从细胞数上来看，补加Ser+ASP组明显高于对照组和补加Ser组，(10.03±0.40)×10⁷VS(6.35±0.56)×10⁷，P ＜0.001，(10.03±0.40)×10⁷VS(6.93±0.40)×10⁷，P＜0.001，且与补加ASP组差别显著，(10.03±0.40)×10⁷VS(7.31±0.49)×10⁷，P＜0.01。从细胞存活率上来看，补加 Ser+Asp组高于对照组和补加Ser组，(80.00±1.93)％VS(69.30±3.82)％，(80.00± 1.93)％VS(73.40±2.29)％，P＜0.05。且补加Asp组存活率(81.10±2.88)％同样与对照组和补加Ser组差别显著，P＜0.05。

图3和图4为诱导培养不同天数不同组细胞数以及细胞存活率的变化图。其中，图3为诱导培养第7天，第10天，第14天和第17天，不同处理组的细胞数，图4为诱导培养第7天，第10天，第14天和第17天，不同处理组的细胞存活率。从图3和图4的结果可以看出，随着诱导时间延长，补加氨基酸有利于细胞存活。而且，随着诱导时间延长，补加Ser+Asp组无论是细胞数还是细胞存活率的增值都更为明显。

利用CD71-APC、CD235a-PE抗体，采用流式细胞术检测红系细胞表面标志CD71、CD235a的表达。其步骤包括：分别取诱导培养第17天的各组细胞，然后加入抗CD71-APC 抗体，抗CD235a-PE抗体各2.5μL，4℃放置30min，然后加入500μLPBS离心弃上清，加入500μLPBS重悬。然后用流式细胞仪检测各组细胞中CD71+、CD235a+细胞的表达情况。其中，CD71分子，又称转铁蛋白受体(TfR)，是与细胞的成熟、增殖、分化密切相关的分子，在扩增的细胞、网织红细胞、红系前体细胞中表达，随着红系细胞的成熟分化，CD71 分子的表达量逐渐降低。CD235a分子，为红细胞膜上的主要糖蛋白，在红细胞上表达。

其中，图5a-图5d分别表示的为对照组、补加Ser组、补加Asp组、补加Ser+Asp组中细胞表面标志物CD71和CD235a流式细胞图。图6位不同处理组对应得到的含有不同细胞表面标志物的红系细胞表达率图，图7为不同处理组对应得到的含有不同细胞表面标志物的红系细胞的细胞数图。其中，含有不同细胞表面标志物的红系细胞表达率图，即代表的为含有不同细胞表面标志物的红系细胞的数量占所有细胞的比率。表4代表的是不同处理组细胞表面标志物的含量的变化。

表4红系细胞体外诱导第17天不同处理组细胞表面标志物的变化(n＝3)

	对照组	补加Ser组	补加Asp组	补加Ser+Asp组
					CD71+/CD235+(％)	81.97±6.27	66.17±4.38	70.50±8.80	64.87±0.31
CD71-/CD235+(％)	10.33±6.18	25.13±5.43*	25.55±3.18*	22.63±1.07*

从表4和图5a-5d以及图6和图7可以看出，红系细胞诱导第17天，大部分红系细胞处于CD71/CD235a阶段，其中不补充任何氨基酸的对照组细胞表面标志物 (CD71+/CD235+)含量最高。代表红系成熟阶段的CD71-/CD235a+细胞，补加Ser组、补加Asp组和补加Ser+Asp组成熟红系细胞CD71-CD235a+表达高于对照组，且P值均小于 0.05。该组实验结果表明，补加氨基酸有助于红系细胞CD71-CD235a+成熟，且可获得更多的成熟红细胞。

综上所述，在培养基中添加天冬氨酸或者丝氨酸有助于红系细胞的扩增以及红系细胞表达量的提高。当同时添加天冬氨酸和丝氨酸时，其效果更为显著。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种促进造血干/祖细胞分化为红系细胞的诱导培养基，其特征在于，所述培养基为天冬氨酸和丝氨酸和SCGM基础培养基；

所述诱导培养基中所述天冬氨酸的浓度为50~200nmol/mL；

所述丝氨酸的浓度为200~400 nmol/mL。

2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基进一步包括：

干细胞因子SCF，所述干细胞因子的浓度为30~250ng/mL；

胰岛素样生长因子IGF-1，所述胰岛素样生长因子的浓度为10~100ng/mL；

红细胞生成素EPO，所述红细胞生成素的浓度为1~20U/mL；

转铁蛋白，所述转铁蛋白的浓度为50~400μg/mL；

地塞米松，所述地塞米松的浓度为0.1~5μM；

谷氨酰胺，所述谷氨酰胺的浓度为1~10mM；

和类脂，所述类脂的浓度为10～100μg/mL。

3.天冬氨酸和丝氨酸在促进造血干/祖细胞分化为红系细胞中的应用。

4.一种促进造血干/祖细胞分化为红系细胞的方法，其特征在于，包括：

将造血干/祖细胞扩增培养；

将扩增后的造血干/祖细胞在权利要求1所述的诱导培养基中培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述造血干/祖细胞来自于外周血、脐带血和/或骨髓。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将扩增后的造血干/祖细胞在诱导培养基中培养7~25天。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述造血干/祖细胞在不含有天冬氨酸和丝氨酸的扩增培养基中培养5~10天后，更换诱导培养基，然后在诱导培养基中培养7~25天。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增培养基还包括如下组分：

干细胞因子SCF，所述干细胞因子的浓度为30~100ng/mL；

血小板生成素TPO，所述血小板生成素的浓度为5~50ng/mL；

白介素-3IL-3，所述白介素-3的浓度为10~50 ng/mL；

白介素-6IL-6，所述白介素-6的浓度为1~50ng/mL；

和Flt3配体，所述Flt3配体的浓度为10~100 ng/mL。

9.一种促进造血干/祖细胞分化成红系细胞的试剂盒，其特征在于，

所述试剂盒的组成为第一培养基、第二培养基、天冬氨酸和丝氨酸，所述第一培养基为Stemspan基础培养基；所述第二培养基为SCGM基础培养基；所述天冬氨酸的浓度为50~200nmol/mL，所述丝氨酸的浓度为200~400nmol/mL。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述第一培养基还包括如下组分：

干细胞因子SCF，所述干细胞因子的浓度为30~100ng/mL，

血小板生成素TPO，所述血小板生成素的浓度为5~50ng/mL，

白介素-3IL-3，所述白介素-3的浓度为10~50 ng/mL，

白介素-6IL-6，所述白介素-6的浓度为1~50ng/mL，

和Flt3配体，所述Flt3配体的浓度为10~100 ng/mL，

所述第二培养基还包括如下组分：

干细胞因子SCF，所述干细胞因子的浓度为30~250ng/mL，

胰岛素样生长因子IGF-1，所述胰岛素样生长因子的浓度为10~100ng/mL，

红细胞生成素EPO，所述红细胞生成素的浓度为1~20U/mL，

转铁蛋白，所述转铁蛋白的浓度为50~400μg/mL，

地塞米松，所述地塞米松的浓度为0.1~5μM，

谷氨酰胺，所述谷氨酰胺的浓度为1~10mM，

类脂，所述类脂的浓度为10～100μg/mL，

天冬氨酸和丝氨酸，所述天冬氨酸的浓度为50~200nmol/mL，所述丝氨酸的浓度为200~400nmol/mL。