JP2014527820A - 造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ増殖のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は造血細胞に関する。より具体的には、造血細胞の長期インビトロ培養及びエクスビボ増殖のための方法に関する。本発明はまた、細胞の培養に有用な組成物、例えば、造血細胞（特に造血幹細胞（ＨＳＣ）及び造血前駆細胞（ＨＰＣ））の培養のための培地を提供する。本発明はさらに、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣのインビトロ培養及びエクスビボ増殖に適用可能な組成物及び方法であって、成長因子組合せを含む組成物並びに改変された成長及び環境条件を利用する方法を提供する。【選択図】なし

Description

発明の分野

本発明は造血細胞に関する。より具体的には、造血細胞の長期インビトロ培養及びエクスビボ増殖のための方法に関する。本発明はまた、細胞の培養に有用な組成物、例えば、造血細胞（特に造血幹細胞（ＨＳＣ）及び造血前駆細胞（ＨＰＣ））の培養のための培地を提供する。

発明の背景

赤血球、白血球、血小板及びリンパ球のような循環血液細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）及び造血幹細胞（ＨＳＣ）を起源とする認識可能な前駆体細胞の最終分化の産物である。

造血及び免疫学的障害並びに癌の治療における造血細胞の移植可能性は、多くの疾患の病理への取り組みに多大な利益と利点を与えてきた。骨髄移植のためのＨＰＣの増殖は、疾患の治療用途へのヒト長期骨髄培養物の潜在的適用のそのような例の一つである。

ヒト自家及び同種骨髄移植は、疾患、例えば白血病、リンパ腫、及び他の生死にかかわる疾患の治療法として現在利用されている。しかしながら、これらの方法では、生着に十分な細胞が確実に存在するようにドナーの骨髄を大量に取り出さなければならない。ＨＳＣ及びＨＰＣなどの造血細胞の数を増殖により増加させることができれば、大量の骨髄提供の必要性を低減し、得られた少量の骨髄提供をインビトロで増殖して前駆細胞の数を増加させてからレシピエントに注入することが可能になろう。

ヒト骨髄培養物の造血能力には制限があり、造血前駆細胞と成熟血液細胞の産生数は漸減すること、及び細胞産生が６〜８週で終わることが示されている。これは主に、ＨＰＣが種々の環境影響、例えば、インビボで見出される必須成長因子（造血成長因子及びサイトカイン）に依存していることに起因する。これらの成長因子に加えて、細胞表面分子と細胞外マトリックスとの相互作用が、造血前駆細胞の生存と増殖にとって重要な場合がある。しかしながら、インビトロ増殖の進展のために外来成長因子を使用した多くの試みが行なわれたにもかかわらず、多能性細胞数のわずかな増加に成功したにすぎない。

臍帯血は、操作可能並びに幼年期疾患の移植治療で効果的に利用可能なＨＳＣ及びＨＰＣの供給源になる。これらの細胞には、生命後期で収集される前駆細胞を超えるいくつかの利点があり、例えば、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発生率が低く、ドナーとレシピエントとの間の免役不適合の忍容性が大きい。

臍帯血の使用には、骨髄及び集められた末梢血と比較してＨＳＣ源としての多くの利点があるが、これは臍帯血細胞の相対的な免疫学的及び複製的未熟度に起因し、この未熟度により、ＧｖＨＤの発生率の低さ、ヒト抗原白血球不適合の忍容性の大きさ、移植後の増殖能力の増加がもたらされる。しかしながら、移植のための臍帯血の使用は単位当たりに得られる細胞数が低く、部分的に制限されており、また、好中球及び血小板の再構成が遅いという欠点が存在する。さらに、各臍帯血試料のＨＳＣ及びＨＰＣ数が少ないことにより、完全に成長した大人のレシピエントにおける臍帯血移植の単独での有用性は一般に限られている。

現在、ＨＳＣ及びＨＰＣの細胞用量を増加するために利用可能な２つの主要な選択肢は、複数の臍帯血ユニットからなる輸液とするか、又はエクスビボ増殖させるかのいずれかである。二重臍帯血が成人の移植で成功裡に使用されており、その結果、再発が減少し、生存率改善の可能性が増大している。しかしながら、複数の臍帯血ユニットを利用する二重移植は、ヒト抗原白血球（ＨＬＡ）の一致のさらなる厳密性を必要とし、ＧｖＨＤの発生率の増加とも関連する。さらに、複数の臍帯血移植は細胞組成に影響を与えないことから、この選択肢では、再構成の遅延を緩和する能力に制限がある。これらの理由から、長期生着のための十分なＨＳＣ及び／又はＨＰＣの生成並びに短期再構成を生じ得る造血細胞及び多分化能細胞数の増加のために、エクスビボ増殖に対する関心が高まっている。増殖した細胞は、単独で又は同じ若しくは異なる単位由来の操作されていない細胞と一緒に移植して、長期生着を増強させながら再構成の遅延を最小化することができる。

エクスビボ増殖は当初、高度に分化した細胞の穏やかな増殖のみを生じるとみられていたが、臨床試験により、細胞用量を増加させる安全で実効性のある手段であることが示された。最近では、最適な増殖条件についての明確な合意はないものの、再増殖可能なＨＳＣ及びＨＰＣの有意な増殖が可能であることが示されている。したがって、造血前駆細胞の増殖方法は、臍帯血移植の有効性を増大し、さらに臍帯血などの造血細胞源を、成人の移植のための実行可能なＨＰＣ源となし得るであろう。

ＨＳＣ及びＨＰＣ集団の増殖をより容易なものになし得ることは、化学療法の補足的な治療手段を形成する利点をもたらし、造血細胞の変化が関係する他の疾患状態の治療を援助し、ヒト長期骨髄培養物にさらなる用途も提供し得る。ＨＳＣ及びＨＰＣの増殖をもたらし得る首尾のよいアプローチは、特定系列の前駆体細胞への多数のさらなる分化を容易にし、輸血を含む多様な用途を有する多数の分化造血細胞を提供するであろう。これにより化学療法などの治療法の態様と帰結が改善されるであろう。

このように、移植に利用可能な細胞用量を増加させ、長期インビトロ培養下での造血細胞の生存及び多能性に好適に作用する造血細胞（例えば、ＨＳＣ及びＨＰＣ）の培養及び維持を改善する系、増大条件、組成物及び方法を提供することが必要とされている。そのような改善は、エクスビボ増殖を改善して長期生着のために十分な造血細胞の生成を導き、これにより短期再構成が可能なＨＰＣ及び他の多分化能細胞の数を増加させ、インビトロにおける長期培養下での造血前駆細胞の生存及び多能性に好ましい影響を与えるためにも必要である。

文献、行為、材料、装置、物品などの議論は、本発明の構成を提供する目的でのみ本明細書中に含まれる。これらの事項の一部又はすべてが、本出願の各請求項の優先日の前に存在していたかのように先行技術の一部を形成し、又は本発明に関連する分野に共通する一般的知識をなすものとは示唆も意図もされない。

ＨＳＣの操作は、化学療法又は放射線療法に対する補充療法として有用である。例えば、ＨＳＣを末梢血に局在化し、化学療法を受ける予定の対象から単離し、化学療法の後に戻す。骨髄は、身体において最も多産性の組織の１つであり、それゆえ化学療法薬又は放射線によって最初に損傷を受ける器官となることが多い。結果として、血液細胞生産が化学療法及び放射線治療の間に急速に破壊されることとなり、化学療法又は放射線を停止して造血系に血液細胞の供給を補充させてから改めて化学療法を行わなければならない。

このように、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣ移植が、造血障害並びに多発性骨髄腫及び白血病などの癌を治療するためにしばしば使用される。ＨＳＣ及びＨＰＣは、一般に自家骨髄又は適合ドナーが供給源となるが、ドナーとレシピエントの間の適合性は限定的であることが多い。適合性のある適切なドナーを見つけることは一般に困難であり、白色人患者において一致ドナーがうまく見つかる割合は５０％にすぎない。さらに少数民族においては適切なドナーが見つかる可能性は著しく減少する。したがって、現に必要性を有する患者の治療を援助するためにＨＳＣ及び／又はＨＰＣの代替源を提供する必要性が目下存在する。

本発明は、造血細胞のエクスビボでの生存を延長させて、自己再生性及び多能性を維持しながら造血細胞の数を増加させるための方法及び組成物を提供する。ＨＰＣ及び／又はＨＳＣの集団をフィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物のいずれか１つの存在下で培養することを通じて、ＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団のエクスビボでの生存或いはＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団の培養又は増殖が延長され得ることが明らかになっている。

本明細書には、細胞を、特定の組成物の存在下及び特定の培養条件下で成長させることにより、エクスビボで、ＨＳＣ及びＨＰＣを富化及び増殖させるための方法及び組成物が開示される。ＨＳＣ及びＨＰＣ増殖による細胞増殖が完了したら、移植などのさらなる使用のために細胞を分離することができ、移植されたＨＳＣ及びＨＰＣの数の増加による炎症反応の可能性を低減することができる。

本発明はまた、種々の供給源（例えば臍帯血）から取得可能なＨＳＣ及び／又はＨＰＣに対する、上述の新規成長因子組合せ、及びそれと種々の培養条件（例えば酸素レベル）との組合せの効果を利用して、エクスビボにおけるこれらの細胞の培養の寿命、並びに多能性、多分化能、維持及び／又は増殖を増大させる新規組成物を提供することができると考えられる。本発明はさらに、酸素濃度が通常の周囲酸素濃度未満である環境でＨＳＣ及び／又はＨＰＣの集団がさらに培養される方法、及びそれらの方法の使用から生じる製品を提供し、培養及び得られる細胞集団に利益をもたらす。

種々の条件及び新規化合物を種々の標的集団に利用することによって、得られる増殖細胞のタイプ並びに採取前に培養及び／又は増殖される細胞の数で定義される特定のエンドポイントに関する適切な培養条件の選択が可能になる。結果として、すべての標的集団（これらは、直接臨床に適用されて移植可能な細胞用量を増加させ、再構成の遅延を最小化する可能性を有する。）の増殖倍数の増大のための最適化された条件が特定される。

さらに、本発明は、特定の系列の前駆細胞及びより分化した造血細胞を制御下で産生するための方法、増殖細胞集団、必要とするレシピエントに移植可能な細胞の集団、装置、及び組成物を提供する。本発明の一実施形態では、各要素の単独又は組合せの効果が最適化された、造血ニッチの態様に類似した条件からもたらされる、制御された産生並びに自己再生性、多能性及び分化特性の維持が提供される。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」又は「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書（特許請求の範囲を含む。）において、記載された特徴、整数、工程又は成分の存在を特定するが、他の１つ又は複数の特徴、整数、工程若しくは成分又はその群の存在を除外するものではないと解釈される。

以下の本発明の具体的な実施形態を参照すれば本発明の他の態様も当業者に明らかとなろう。

本発明の態様及び利点のさらなる理解のために、添付の図面を考慮しつつ以下の詳細な説明を参照されたい。

Ｆｉｇｕｒｅ１は、細胞表面マーカー又はコロニー形成単位に基づいて決定される標的集団の純度を示す。ＣＤ３４^＋富化細胞を、一連の酸素レベル（２．５％、約１９ｍｍＨｇ；５％、約３８ｍｍＨｇ；１０％、約７５ｍｍＨｇ；及び２０％、約１５０ｍｍＨｇ）にわたって、成長因子：トロンボポエチン（Ｔ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子（Ｓ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆ）（８０ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン−６（Ｉ）（１００ｎｇ／ｍｌ）の組合せ（Ｔ、ＴＳ、ＴＳＦ、ＴＳＦＩ）の存在下でインキュベートした（トロンボポエチン、幹細胞因子及び顆粒球コロニー刺激因子の組合せ（ＴＳＧ、各々１００ｎｇ／ｍｌ）を比較対象とした）。標的集団は、細胞表面マーカーを用いるフローサイトメトリーによって、また、「完全」メチルセルロース培地で増殖させて芽球形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、コロニー形成単位−顆粒球／赤血球／単球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、及び全芽球／コロニー形成単位を数え上げることによって確認した。Ｎ＝４の独立した臍帯血ユニット、各々３連で実施。結果は平均±平均の標準誤差で表す。文字ａ〜ｄは、示されたｐ値を有する統計学的に異なる群を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ１は、細胞表面マーカー又はコロニー形成単位に基づいて決定される標的集団の純度を示す。ＣＤ３４^＋富化細胞を、一連の酸素レベル（２．５％、約１９ｍｍＨｇ；５％、約３８ｍｍＨｇ；１０％、約７５ｍｍＨｇ；及び２０％、約１５０ｍｍＨｇ）にわたって、成長因子：トロンボポエチン（Ｔ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子（Ｓ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆ）（８０ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン−６（Ｉ）（１００ｎｇ／ｍｌ）の組合せ（Ｔ、ＴＳ、ＴＳＦ、ＴＳＦＩ）の存在下でインキュベートした（トロンボポエチン、幹細胞因子及び顆粒球コロニー刺激因子の組合せ（ＴＳＧ、各々１００ｎｇ／ｍｌ）を比較対象とした）。標的集団は、細胞表面マーカーを用いるフローサイトメトリーによって、また、「完全」メチルセルロース培地で増殖させて芽球形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、コロニー形成単位−顆粒球／赤血球／単球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、及び全芽球／コロニー形成単位を数え上げることによって確認した。Ｎ＝４の独立した臍帯血ユニット、各々３連で実施。結果は平均±平均の標準誤差で表す。文字ａ〜ｄは、示されたｐ値を有する統計学的に異なる群を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ２は、表現型的及び機能的に評価されたＨＳＣ、ＨＰＣ及び多分化能細胞の増殖倍数を示す。標的集団の増殖倍数に対する成長因子組合せ及び酸素レベルの効果は、手動による計数、フローサイトメトリー及びコロニー形成単位の計数によって決定した。増殖倍数は、培養前の値に対する標的集団数の増加を表す。成長因子組合せは、トロンボポエチン（Ｔ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子（Ｓ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆ）（８０ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン−６（Ｉ）（１００ｇ／ｍｌ）（Ｔ、ＴＳ、ＴＳＦ、ＴＳＦＩ）であり、トロンボポエチン、幹細胞因子、及び顆粒球コロニー刺激因子（ＴＳＧ、各々１００ｎｇ／ｍｌ）を比較対象とした。試験した酸素レベルは２．５％、５％、１０％及び２０％であった。Ｎ＝４の独立した臍帯血ユニット、各々３連で実施。結果は平均±平均の標準誤差で表す。文字ａ〜ｃは、示されるｐ値を有する統計学的に異なる群を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ２は、表現型的及び機能的に評価されたＨＳＣ、ＨＰＣ及び多分化能細胞の増殖倍数を示す。標的集団の増殖倍数に対する成長因子組合せ及び酸素レベルの効果は、手動による計数、フローサイトメトリー及びコロニー形成単位の計数によって決定した。増殖倍数は、培養前の値に対する標的集団数の増加を表す。成長因子組合せは、トロンボポエチン（Ｔ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子（Ｓ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆ）（８０ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン−６（Ｉ）（１００ｇ／ｍｌ）（Ｔ、ＴＳ、ＴＳＦ、ＴＳＦＩ）であり、トロンボポエチン、幹細胞因子、及び顆粒球コロニー刺激因子（ＴＳＧ、各々１００ｎｇ／ｍｌ）を比較対象とした。試験した酸素レベルは２．５％、５％、１０％及び２０％であった。Ｎ＝４の独立した臍帯血ユニット、各々３連で実施。結果は平均±平均の標準誤差で表す。文字ａ〜ｃは、示されるｐ値を有する統計学的に異なる群を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ３は、連続増殖の際の標的集団の累積増殖倍数及び相対的遺伝子発現レベルを示す。造血幹細胞、前駆細胞及び多分化能標的細胞の増殖倍数は、５％及び１０％酸素下の成長因子組合せＴＳＦＩについて決定した（２０％酸素下のＴＳＧを比較対象とした）。標的集団細胞数の変化は、手動の細胞計数、細胞表面マーカーの検出、及びコロニー形成単位の計数に基づいて評価した。遺伝子発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子に対して相対的に定量し、各時点において１つの状態（１０％酸素下のＴＳＦＩ）での発現を比較対象として決定した。Ｎ＝４の独立した臍帯血ユニット、各々３連で実施。結果は平均±平均の標準誤差で表す。連続増殖は３週間（Ｗ０〜Ｗ３）にわたって示された。文字ａ〜ｃは、示されるｐ値を有する統計学的に異なる群を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ３は、連続増殖の際の標的集団の累積増殖倍数及び相対的遺伝子発現レベルを示す。造血幹細胞、前駆細胞及び多分化能標的細胞の増殖倍数は、５％及び１０％酸素下の成長因子組合せＴＳＦＩについて決定した（２０％酸素下のＴＳＧを比較対象とした）。標的集団細胞数の変化は、手動の細胞計数、細胞表面マーカーの検出、及びコロニー形成単位の計数に基づいて評価した。遺伝子発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子に対して相対的に定量し、各時点において１つの状態（１０％酸素下のＴＳＦＩ）での発現を比較対象として決定した。Ｎ＝４の独立した臍帯血ユニット、各々３連で実施。結果は平均±平均の標準誤差で表す。連続増殖は３週間（Ｗ０〜Ｗ３）にわたって示された。文字ａ〜ｃは、示されるｐ値を有する統計学的に異なる群を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ４は、３つの評価方法を用いて識別可能な造血細胞のタイプを示す。１）幹細胞、前駆細胞及び多分化能細胞についての表面マーカーＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）分子の発現パターンは右側に示し、抗原感作細胞系列は下に示した。２）多分化能細胞の機能的評価は、（^＊）で示されるように、顆粒球（Ｇ）、赤血球（Ｅ）、単球（Ｍ）及び巨核球（Ｍ）細胞に関するコロニー／芽球形成単位（ＣＦＵ／ＢＦＵ）アッセイで行った。３）自己再生造血幹細胞、前駆細胞及び多分化能細胞についての遺伝子発現パターンは左側に示した（細胞画像はＡ．Ｒａｄ，２００７のものを一部改変）。 Ｆｉｇｕｒｅ５は、ＣＤ３４＋富化後、８０％以上の生存率及びＣＤ３４＋純度を有する試料のみをエクスビボ増殖のために使用したことを示す。細胞は、単一ステップ及び連続増殖に関して培養前及び培養後の両方で評価した。生存細胞数は、トリパンブルー排除法を用いて手動の計数により決定した。標的集団の純度は、フローサイトメトリーにより表面マーカー組合せを発現している細胞の割合として決定し、クローン形成能は、ＣＦＵアッセイに関する１０００個の播種細胞当たりの芽球又はコロニー形成単位として決定した。各時点で、生存細胞数及び標的集団の純度若しくはクローン形成能を用いて、培養前の数に対する増殖倍数又は累積増殖倍数のエンドポイントを計算した。また、標的集団の純度及びクローン形成能をエンドポイントとしても使用した。遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲを２つのハウスキーピング遺伝子に対して相対的に定量し、１０％酸素下のＴＳＦＩで見られる発現に対して相対的に決定した。 Ｆｉｇｕｒｅ６は、異なる酸素濃度（２％、５％、１０％、及び室内空気（２０％Ｏ_２））での異なる成長因子組合せ（文字で示されている。）の存在下の、全細胞及び表現型マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋７ＡＡＤ−）により定義されるＨＳＣサブセットの増殖倍数を示す。データは１０個の異なる実験の平均値であり、すべての値は、播種集団と比較した増殖倍数として計算している（なし：成長因子の添加なし；ＴＦ：トロンボポエチン、Ｆｌｔ−３リガンド；ＴＦＩ：トロンボポエチン、Ｆｌｔ−３リガンド、インターロイキン−６；ＴＦＳ：トロンボポエチン、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ；ＴＦＳＩ：トロンボポエチン、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、インターロイキン−６；ＴＳＧ：トロンボポエチン、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ）。 Ｆｉｇｕｒｅ７は、Ｆｉｇｕｒｅ６に記載の培養条件の各々における１０００細胞当たりの全コロニーを示す。 Ｆｉｇｕｒｅ８は、全細胞及び表現型マーカー（ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋、及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−）により定義されるＨＳＣサブセットの増殖倍数を示す。分析はすべて、生存細胞のみ（７ＡＡＤ−）についてゲートした。細胞は、１０％酸素下、ＴＦＳＩ成長因子の存在下、フィコリン−１、フィコリン−２又はフィコリン−３の５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌの添加あり又は添加なしで培養した。 Ｆｉｇｕｒｅ９は、１０％Ｏ_２の下、５０又は１００ｎｇ／ｍｌのＴＦＳＩ＋／−フィコリン−１、フィコリン−２又はフィコリン−３の存在下で培養した全コロニー数及び細胞のコロニー形態を示す。これらの成長因子下での８日間の培養後、各条件につき１０００個の細胞を、半固形の培地（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ，Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，バンクーバー）に各条件につき３連で播種し、さらに１２〜１４日間培養した。次いで、コロニーの数及び種類を倒立顕微鏡下で計数した。 Ｆｉｇｕｒｅ１０は、全細胞及び表現型マーカー（ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋、及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−）により定義されるＨＳＣサブセットの増殖倍数を示す。分析はすべて、生存細胞のみ（７ＡＡＤ−）についてゲートした。細胞は、５％酸素下、ＴＦＳＩ成長因子の存在下、フィコリン−１、フィコリン−２又はフィコリン−３の５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌの添加あり又は添加なしで培養した。 Ｆｉｇｕｒｅ１１は、５％Ｏ_２の下、５０又は１００ｎｇ／ｍｌのＴＦＳＩ＋／−フィコリン−１、フィコリン−２又はフィコリン−３の存在下で培養した細胞の全コロニー数及びコロニー形態を示す。これらの成長因子下での８日間の培養後、各条件につき１０００個の細胞を、半固形の培地（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，バンクーバー）に各条件につき３連で播種し、さらに１２〜１４日間培養した。次いで、コロニーの数及び種類を倒立顕微鏡下で計数した。

発明の詳細な説明

ヒト自家及び同種骨髄移植法は、疾患、例えば、白血病、骨髄腫、リンパ腫、及び他の生死にかかわる疾患のための治療法として利用されている。このように、造血疾患、免疫学的障害及び癌などの治療において、ＨＳＣ及びＨＰＣは、ますます一般的で確立された形態の医学的処置となっている。

臍帯血は、移植目的に適した骨髄ドナーが利用できない場合のＨＳＣ及びＨＰＣの採取源とされることが多い。インビトロで行われた試験において、臍帯血から取得されたＨＳＣが、骨髄から取得されたものよりも良好な増殖性と生着性を有することが示されている。このように、臍帯血の使用は、他の造血細胞供給源を上回るいくつかの利点を提供するものと考えられ、例えば、臍帯血の方が骨髄よりもＨＬＡ適合性の要件が厳しくないという事実がある。残念なことに臍帯血に存在し、利用可能な造血細胞の数は、全有核細胞の０．１％に満たないことも少なくない。これらの細胞集団が少ないことと、移植に適した密度に首尾よく増大する性質が限定されていることが、それらの使用を制限し、難しくする原因となることが多く、例えば少なくとも１．７×１０^５ＣＤ３４＋細胞／ｋｇという細胞用量の閾値を達成できず、このことは移植の成功率の低さとの関連が示されてきた。

幹細胞数を増加させる方法によれば、骨髄／末梢血幹細胞の採取に関連する時間及び不都合が一層低減され、幹細胞ドナーのプールが増加する。また、幹細胞数を増加させる方法は、臍帯血を成人患者にとっても有用なものとし、これにより自家移植の利用を拡大させる。

すなわち、本発明の方法及び組成物は、造血細胞の培養、増殖及び維持のための改善された系及びプロセスを提供する。さらに、本発明により、ＨＰＣ又はＨＳＣ試料から取得可能な後代の数を改善し、同時にこれらの細胞の再増殖能力及び多能性の維持又は増加させることが可能となる。

１．定義
本明細書において、造血幹細胞又は「ＨＳＣ」という用語は、自己再生能力と、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、巨核球産生血小板、血小板）、及び単球（例えば、単球、マクロファージ）を含むさらに成熟した血液細胞に分化する能力と、を有する未成熟血液細胞を指す。このような細胞はＣＤ３４＋細胞を含む場合も含まない場合もあることが当技術分野において知られている。ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する未成熟細胞である。ＣＤ３４＋細胞は、上記幹細胞特性を有する細胞の小集団を含むものと考えられる。

造血幹細胞が、多能性幹細胞、多分化能幹細胞（例えばリンパ幹細胞）、及び／又は特定の造血系列になることが課された幹細胞を含み得ることも、当分野において周知である。特定の造血系列になることが課された幹細胞は、Ｔ細胞系列、Ｂ細胞系列、樹状細胞系列、ランゲルハンス細胞系列、赤血球、巨核球、ミエロイド及び／又はマクロファージ細胞系列であり得る。また、ＨＳＣは、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）及び短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）を指す。ＬＴ−ＨＳＣ及びＳＴ−ＨＳＣは、それらの細胞表面マーカーの発現に応じて分化する。ＬＴ−ＨＳＣは、ＣＤ３４−、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏ、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋であり、ＳＴ−ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏ、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏである（「ｌｏ」は低発現を表す）。さらに、ＳＴ−ＨＳＣは休止が少なく（すなわち、より活性であり）、ＬＴ−ＨＳＣより増殖性が大きい。しかしながら、ＬＴ−ＨＳＣは非限定的な自己再生性を有し（すなわち、成人期にわたって存在し）、他方、ＳＴ−ＨＳＣは自己再生性が限定されている（すなわち、限定された期間しか存在しない）。

これらのＨＳＣはいずれも、本明細書に記載の方法のいずれかで使用し得る。ＳＴ−ＨＳＣは、増殖性が高く、ＨＰＳとその後代の数を迅速に増加させることから有用であり得る。同様に、そのような細胞は、ＣＤ１３３＋細胞（これは、「血液産物（ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）」中に存在する場合もある。また、上記「前駆細胞」特性を有する細胞の小集団を含むことも知られている。）を含む場合と含まない場合があることは当技術分野において知られている。さらに、ＨＳＣは、血液産物から得られたものであってもよい。

本発明において、増殖したＨＳＣは、初期幹細胞又はＨＳＣの多能性を少なくともいくらか保持するものである。多能性には、幹細胞活性又は性質、例えば、他の血液細胞型に分化する能力又は分化を伴わずに増殖する能力を含む。

本明細書でいう「血液産物」としては、造血源の細胞を含む身体又は身体の器官から得られる産物が挙げられる。そのような造血源としては、分画されていない骨髄、臍帯、末梢血、肝臓、胸腺、リンパ及び脾臓が挙げられる。上記未精製の又は分画されていない血液産物のすべては、いくつかの方法で、造血幹細胞特性を有する細胞に富化させ得る。例えば、より成熟した分化した細胞が、それらの細胞が発現する細胞表面分子を利用して選択される。血液産物は、ＣＤ３４＋細胞の選択によって分画されたものであってもよい。ＣＤ３４＋細胞は自己再生及び多分化の可能な細胞の小集団を含む。そのような選択は、例えば、市販の磁気抗ＣＤ３４ビーズを用いて達成される。分画されていない血液産物は、ドナー又は凍結保存貯蔵物から直接得られるものであってもよい。特定の幹細胞マーカーを用いてＨＳＣが単離できることは当業者に既知である。

本発明によれば、上記未精製の又は分画されていない血液産物のすべてが、いくつかの方法で、造血前駆細胞又は「ＨＰＣ」特性を有する細胞に富化させ得ると考えられる。

本明細書において、「ＨＰＣ」という用語は造血前駆細胞を指す。造血前駆細胞は、循環血には稀にしか存在せず、種々の特殊な細胞型に分化し、血液細胞型を生じることができる細胞である。造血前駆細胞は種々の成熟段階の血液に存在すると一般に理解されている。

非限定的な例では、血液産物からより分化した後代を除去することができる。より成熟した分化した細胞は、保有及び発現している細胞表面分子に対して選択することができる。特定のリガンド又は受容体を利用することもでき、さらなる操作の前にＨＰＣを富化することもできる。

本発明において、「周囲」という用語は、本発明の培養領域を完全に包囲又は包含している領域を指すものとする。本明細書において、「周囲」という用語は、当分野の最小の技術知識しか有しない者にも理解され、当業者に知られたものとする。

本明細書において、「酸素の周囲濃度」という用語は、異なる環境媒体における又は周囲環境における単位体積当たりの環境的に利用可能な酸素の量を意味するものとされ、当業者によって理解される用語と考えられる。

本明細書において、「間質細胞」という用語は、線維芽細胞及び間葉細胞を含み、他の細胞及び要素を含み又は含まず、造血前駆細胞の前に又は実質的に同時に播種することができ、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣのその後の接着又は成長に好ましい条件を確立し得るものとする。線維芽細胞は、生検を介して任意の組織又は器官より得ることができ、胎児の線維芽細胞も含み得る。これらの線維芽細胞及び間葉細胞には、例えば、本明細書に記載の造血成長因子の１つをコードする外来性ＤＮＡを形質移入してもよい。

本発明によれば、「間質細胞馴化培地」という用語は、上記間質細胞がインキュベートされている培地を指すものとする。本発明の方法において、インキュベーションは、間質細胞が培地に因子を分泌するのに十分な期間行われる。そのような「間質細胞馴化培地」は、ＨＰＣの培養に添加して、ＨＰＣの増殖及び／又は分化を促進するために使用することができる。したがって、細胞が前記薬剤のいずれも伴わずに培養されるとき、細胞は、造血前駆細胞を含め、血清、通常の栄養培地、又は単離、未分画若しくは分画後の血液産物に存在し得るものを除いてそのような薬剤の添加を伴わずに培養された細胞であることを意味する。

本発明において「接種間質細胞」又は「間質細胞接種培地」という場合、細胞培養チャンバーは、ＨＰＣの生存、増殖又は分化を促進するための接種物として導入された間質細胞を、単離された血液産物に天然に含有される間質細胞を除いて含んでいないことを意味する。

本明細書において、「対象」とは、例えば、骨髄ドナー、又は枯渇した若しくは限定された血液細胞レベルを有する若しくはそのリスクを有する個体を意味する。対象は、骨髄採取前の骨髄ドナーであっても、骨髄採取後の骨髄ドナーであってもよい。対象は、骨髄移植のレシピエントであってもよい。本明細書に記載の方法は、高齢の対象、又は免疫を枯渇させる処置（化学療法など）に予め曝露された対象など、骨髄保存が限定された対象に特に有用である。対象は、対照の血液細胞レベルと比較して血液細胞レベルが低下しているか、或いは血液細胞レベルの低下を発症するリスクがあってもよい。本明細書において、「対照血液細胞レベル」という用語は、対象に血液細胞レベルを変化させる事象が生じる前又はそれが実質的に存在しない場合の対象における血液細胞の平均レベルを指す。対象における血液細胞レベルを変化させる事象としては、例えば、貧血、外傷、化学療法、骨髄移植及び放射線療法が挙げられる。例えば、対象は、貧血、又は例えば外傷に起因する失血を有する。

本発明において、「造血幹細胞の採取」、「造血前駆細胞の採取」、「ＨＳＣの採取」又は「ＨＰＣの採取」という用語は細胞の取出し又は分離を指すものとし、また、当業者が知っている技術であるとする。一例において、「採取」は、いくつかの方法、例えば、酵素的、非酵素的、遠心分離による、電気的、若しくは大きさに基づく方法、好ましくは、培養培地（例えば、細胞がインキュベートされた培地）若しくは緩衝溶液を用いて細胞を流すことにより達成し得る。細胞は、収集、分離し、さらに、より大きなＨＳＣ又はＨＰＣ集団及び分化した後代を得るために増殖してもよい。

本発明において、「制御曲線（ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｕｒｖｅ）」という用語は、同一の条件下で培養された異なる体積の血液産物の成長特性の測定（一定の時間間隔で細胞を採取・計数することができる。）を通じて作成される、統計学的及び数学的に意味のある曲線を指すものとする。これらの「制御曲線」は、本発明において、後に細胞数を見積もるための一つの方法として使用される場合もある。

本発明の方法によれば、任意の適切な増殖容器、フラスコ、又は適切なチューブ、例えば、１２、２４又は９６ウェルプレート、１２．５ｃｍ２ Ｔフラスコ、又はガス透過バッグを、本発明の任意の培養方法で使用し得ると考えられる。

本発明において、「造血成長因子」という用語は、造血細胞の生存、増殖又は分化に影響する少なくとも１つの因子を指すものとする。これらの成長因子は精製又は組換え方法によって得ることができ、また、誘導又は合成することができる。本発明の方法及び組成物に関連して特に関心のある成長因子は造血成長因子である。

本発明において、「フィコリン」という用語は、主にフィコリン−１（Ｍ−フィコリン）、−２、及び−３を含むフィコリンファミリーに属する複数の種々のタンパク質を指すものとする。これらはすべて、毒素の自然免疫認識に寄与するパターン認識分泌レクチンである。フィコリンは、１つのフィブリノーゲン様ドメインと１つのコラーゲン様ドメインを有し、ジスルフィド結合ホモオリゴマーとして循環する。リガンド結合の後、フィコリンは、ＭＡＳＰセリンプロテアーゼと会合してレクチン補体カスケードを引き起こす。ヒトにおけるフィコリン−１はＦＣＮ１遺伝子（配列番号１）でコードされ、フィコリン−２はＦＣＮ２遺伝子（配列番号３）でコードされ、フィコリン−３はＦＣＮ３遺伝子（配列番号５）でコードされる。ＦＣＮ１、ＦＣＮ２及びＦＣＮ３によって翻訳されるタンパク質産物は、それぞれ配列番号２、配列番号４及び配列番号６によって表される。

フィコリンは、構造的に、アンジオポエチン様タンパク質に関連するタンパク質であり、類似のドメイン構造を有し、特に１つのフィブリノーゲン様ドメインを有する。しかしながら、アミノ酸レベルでのフィコリン及びアンジオポエチン様タンパク質のホモロジー解析において、約２０〜２５％のホモロジーレベルしかないことが分かった。フィコリンファミリーのタンパク質は、リーダーペプチド、短いＮ末端セグメント、続くコラーゲン様領域、及びＣ末端フィブリノーゲン様ドメインの存在によって特徴づけられる。またコラーゲン様及びフィブリノーゲン様ドメインは、他のタンパク質、例えば、補体タンパク質Ｃ１ｑ、コレクチンとして知られるＣ型レクチン、及びテネイシンにも別に見出せる。しかしながら、これらのタンパク質はすべて異なる標的を認識し、機能的に異なっている。

本発明によるすべての培養方法において、他に示される場合を除き、使用される培地は、細胞の培養に従前から適当とされている培地であり得る。当技術分野で知られ、細胞培養に使用することができる培養培地の例としては、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ＩＳＣＯＶＥＳが挙げられる。典型的に、これらの培地には、ヒト又は動物の血漿又は血清が添加されている。そのような血漿又は血清には少量の造血成長因子を含めることができる。本発明の好ましい条件において、利用される培地は血清を添加せずに使用される。

２．フィコリンを伴ったＨＳＣ及び／又はＨＰＣの培養
適切な供給源（例えば、臍帯血又は骨髄）由来のＨＰＣ又はＨＳＣ集団の増殖能力は医療に実質的な利点を与え、高用量の細胞が必要とされる造血又は腫瘍学的疾患のための治療、移植手術、又は他の療法を成功裡に実施する可能性を増大させる。

本発明において、特定の薬剤（例えばフィコリン）の単独で又は組合せでの使用が、ＨＳＣ及びＨＰＣ集団の増殖を増大し得ることが見出された。フィコリンは、アンジオポエチン様タンパク質に構造的に関連するタンパク質であり、類似のドメイン構造、特に１つのフィブリノーゲン様ドメインを有するタンパク質である。これらは従前、免疫機能の調節因子として認識されていたが、造血幹又は造血前駆細胞に対する効果についての検討は行われてこなかった。

これらの薬剤は、造血細胞の自己再生及び増殖の増大をもたらすことが分かった。本発明者らによって見出された（実施例参照）ように、コロニー形成細胞の最も原始的な種類であるＣＦＵ−ＧＥＭＭの維持がフィコリンの存在下で達成され得るが、不在下では達成されないことが分かり、このことから、薬剤フィコリンがおそらく原始的ＨＳＣ集団を選択的に保存する活性を有していることが示唆される。

したがって、本発明の一態様において、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣの成長に適切な培養補助剤であって、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せの１つ又は複数からなる補助剤が提供される。

本発明において、フィコリンの断片及び機能的等価物としては、フィブリノーゲン様ドメインを含む断片（フィコリン１の場合、例えばアミノ酸１１５−３２５）、又は非限定的な例として、レクチン結合活性を含むより小さい断片（フィコリン１の場合、アミノ酸２００−３００）を含む断片が挙げられることが理解される。

一実施形態において、培養又は増殖のための造血細胞集団は、例えば、適切な対象から得られた骨髄試料から、又は先に樹立した培養物から、又は臍帯血から得られた骨髄試料から採取し得る。ＨＳＣは、分画されていない骨髄、臍帯、末梢血、肝臓、胸腺、リンパ及び脾臓を含む群から選択される血液産物から得ることもできる。

さらなる実施形態において、本発明の方法又は組成物の使用及び適用により得られた造血細胞集団は、移植レシピエントにおける血液及び免疫細胞を回復させる能力の増大に基づく、改善された治療能力を含むＨＳＣ及び／又はＨＰＣを含み得る。さらに別の実施形態において、本発明の方法に従って培養された細胞集団は、他の組織の細胞（例えば、脳、筋肉、肝臓の細胞）を生成するために分化する能力を保持し得ると考えられる。

分化されていない血液産物はドナー又は凍結保存品から直接得ることができるが、それらは、本発明の方法で使用される造血細胞源の供給の際にそのような血液産物が得ることができるという非限定的な例にすぎないものとする。本発明において、造血細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ又はマウスなどの任意の適切な動物に由来するものとする。好ましい実施形態において造血細胞はヒト細胞である。

本発明の実施形態において、本発明で使用されるＨＳＣ及び／又はＨＰＣの培養方法は、本明細書に記載の成長因子のいずれも利用することができ、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せの１つ又は複数を添加することができる。好ましい実施形態において、フィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３、その断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せは、培養培地の約５０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬを構成するように培養液に添加される。より好ましい実施形態において、培養系におけるフィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３、その断片若しくは機能的等価物、又はそれらの組合せの濃度は５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである。

３．低酸素（Ｏ_２）環境でのＨＰＣ及び／又はＨＳＣの培養
本発明において、本発明者らはまた、細胞培養を酸素の周囲濃度未満のレベルで行う場合に、クローン形成能に影響を与えないか影響が非常に制限されている状態で標的集団の純度の改善などの成長特性の増大がもたらし得る酸素の量を決定した。

ＨＰＣ及び／又はＨＳＣなどの細胞成長に対する低い酸素濃度の効果は、フィコリンなどの薬剤又はその機能的等価物の包含によってさらに減弱され、標的集団の純度が改善され、クローン形成能に与える効果が最小となる。

すなわち、本発明のさらなる態様において、ＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団のエクスビボでの生存或いはＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団の培養又は増殖を延長するための方法であって、ＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団を、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せの存在下、標準周囲酸素濃度と比較して限定された酸素濃度環境で培養することを含む方法が提供される。

造血細胞の培養は、好ましくは、そのような細胞の数及び／又はそのような細胞のコロニー形成能力を増大させる状態下で生じる。使用する状態は、当分野で公知の状態の組合せを指す（例えば、温度、ＣＯ_２濃度、栄養培地など）。しかしながら、本発明者らは、特に培養環境の酸素濃度が造血前駆細胞の増殖に重要であることを見出した。

本発明の一実施形態では、本発明のＨＳＣ及び／又はＨＰＣの集団を低酸素環境で培養して、自己再生の可能性を増大させ、分化の可能性を減少させることができ、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せなどの薬剤の存在下でそうすることができる。

さらなる実施形態において、ＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団のエクスビボでの生存或いはＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団の培養又は増殖を延長する能力を改変するための方法であって、改変は培養中の酸素濃度の適切な選択を通じてなされ、培養系には、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せなどの薬剤が添加される、方法が提供される。

別の実施形態において、培養系における酸素濃度は、雰囲気中に存在する酸素の周囲濃度レベル未満で構成される。より好ましい実施形態において、酸素濃度は培養雰囲気の約２０％未満、より好ましくは約１％〜約１２％である。特に好ましい実施形態において、酸素は培養雰囲気の約１０％を構成する。

さらなる実施形態において、本発明の細胞は、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物などの薬剤の存在下、酸素濃度が環境中の酸素の周囲レベル未満である環境で培養され、ここで、細胞は約１％〜約１２％の酸素濃度下で培養される。

別の実施形態において、本発明の細胞は、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物などの１つ又は複数の薬剤の存在下、少なくとも０．５％、又は少なくとも１．０％、又は少なくとも１．５％、又は少なくとも２．０％、又は少なくとも２．５％、又は少なくとも３．０％、又は少なくとも３．５％、又は少なくとも４．０％、又は少なくとも４．５％、又は少なくとも５．０％、又は少なくとも５．５％、又は少なくとも６．０％、又は少なくとも６．５％、又は少なくとも７．０％、又は少なくとも７．５％、又は少なくとも８．０％、又は少なくとも８．５％、又は少なくとも９．０％、又は少なくとも９．５％、又は少なくとも１０．０％、又は少なくとも１０．５％、又は少なくとも１１．０％、又は少なくとも１１．５％、又は少なくとも１２．０％、又は少なくとも１２．５％、又は少なくとも１３．０％、又は少なくとも１３．５％、又は少なくとも１４．０％、又は少なくとも１４．５％、又は少なくとも１５．０％、又は少なくとも１５．５％、又は少なくとも１６．０％、又は少なくとも１６．５％、又は少なくとも１７．０％、又は少なくとも１７．５％、又は少なくとも１８．０％、又は少なくとも１８．５％、又は少なくとも１９．０％、又は少なくとも１９．５％、又は少なくとも２０．０％の酸素濃度の環境で培養される。

好ましい実施形態において、５〜１０％の酸素濃度が、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せの１つ又は複数などの薬剤の存在下での臍帯血ＨＳＣ及び／又はＨＰＣの培養に使用され得る。特に好ましい実施形態において、約５％の酸素濃度がＨＳＣ及び／又はＨＰＣの培養に使用され得る。

本発明の方法によれば、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣの集団を、本発明の方法に従って本発明の組成物を用いて低酸素下で培養及び増殖するために必要な時間は、当業者によって決定し得るものである。この時間は、培養の間に播種される当初の細胞数に応じて変化することが理解され得る。非限定的な例では、培地の脱色が集密度の指標として使用され得る。

さらに、本発明の実施形態の適用において、異なる体積の血液産物を同一条件下で培養して「制御曲線」を作成し、後に細胞数を推定するために使用する場合があると考えられる。当業者は、本発明の改変された酸素濃度条件及び方法を用いて適当な培養時間を決定するための技術を十分に備えていると考えられる。しかしながら、当業者によって予期され得るように、種々の因子により、細胞の培養の際の測定又は期間が影響を受ける場合がある。培養での初期播種密度などの検討が培養時間に影響を与える場合がある。例えば、多くの細胞が初期に播種された場合、培養のための最適時間は、初期に播種された細胞数がより少ない場合と比較して短くなり得る。

しかしながら、細胞数の変化のモニタリング（例えば、光学密度の決定、又は直接計数による）、培地のｐＨ変化のモニタリング、又は成長率遅延の解析（例えば、細胞の倍加時間の算出による。）などの技術の適用は、すべて適切な培養時間を決定するために有効で適切な手段となり得るものとする。

本発明のさらなる実施形態において、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せは、培養条件が周囲レベル未満の酸素濃度、より好ましくは、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、又は約５％未満であることを含むＨＰＣ及び／又はＨＳＣの成長に適した培養培地に添加して使用される。

好ましい実施形態において、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せは、酸素濃度が約５％の培養培地に添加して使用される。特に好ましい実施形態において、フィコリン−１又はその断片若しくは機能的等価物は酸素濃度約５％の培養培地に添加して使用される。

４．改変培養条件を用いる、フィコリンを伴ったＨＳＣ及び／又はＨＰＣの培養
インビボにおけるＨＳＣ及び／又はＨＰＣなどの造血細胞集団の増殖は、これらの細胞が通常見出される骨髄環境内の、複数の因子の複合化した影響と関係している。この領域は「造血ニッチ」と称するのが一般的である。

最も原始的で多能性の幹細胞は、通常、骨髄の柵状織空間内の骨内膜表面に直ぐ隣接して存在する。したがって、このニッチは、幹細胞と隣接する間質細胞（骨芽細胞を含む。）との細胞性相互作用、細胞外マトリックス成分との相互作用、異なる細胞型間の３次元相互関係、並びに骨髄腔内の成長因子及び他の可溶性シグナル分子の拡散から成り立っている。

これに応じて、本発明のさらなる態様においては、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せなどの薬剤の存在下、さらに本明細書に記載の成長因子の存在下でＨＳＣ及び／又はＨＰＣを培養して、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣ細胞の再生及び多能性細胞の増加など細胞の培養にさらなる効果を与え得る方法が提供される。

本発明の方法の利用において、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣの富化集団を取り、造血細胞の維持を促進するか又は増殖及び／又は分化を促進する薬剤及び／又は成長因子により刺激して、インビトロでより成熟した血液細胞を得ることも可能である。そのように増殖した血液細胞の集団を、インビボで、例えば患者の造血細胞集団の補充において適用することができ、又は実験的に使用することもできる。そのような分化した細胞としては、上述したもの、並びに、Ｔ細胞、血漿細胞、赤血球、巨核球、好塩基球、多形核白血球、単球、マクロファージ、好酸球、及び血小板が挙げられる。

本発明の方法及び組成物に関連して、特定の関心がもたれる成長因子は造血成長因子である。これらの成長因子は、精製、組換え手法により得ることができ、又は誘導若しくは合成することができる。

本発明の実施形態において、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣ集団を、従来の成長培地において、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せの存在下で、インターロイキン３、６及び１１（Ｉ）、幹細胞因子（Ｓ）、トロンボポエチン（Ｔ）、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子及びＦＬＴ−３リガンド（Ｆ）を含む群から選択される成長因子を添加して、培養及び増殖させる方法が提供される。

本発明者らによって明らかにされ、実施例で議論されるように、トロンボポエチン単独では、細胞生存率が６０％にすぎず、好ましい移植基準を下回り、研究のための細胞培養物の維持にも不適切である。成長因子の組合せＴＳは、培地に添加された場合に増殖細胞の生存率の増加を示した。さらに、ＴＳは、最も原始的なＨＳＣ（ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻⁻）の割合を培養前に観察されたよりも高いレベルに増加させ、増殖倍数を劇的に増加させた。

したがって、本発明のさらなる実施形態において、成長因子ＴＳは、ＨＰＣ及び／又はＨＳＣ並びにフィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物を含む培養培地に供給されて、増殖させた培養物の生存率を増加させる。

さらなる実施形態において、ＨＰＣ及び／又はＨＳＣの集団は成長因子組合せと共に培養され、ここで、培養培地には、トロンボポエチン（Ｔ）、幹細胞因子（Ｓ）、ＦＬＴ−３リガンド（Ｆ）及びインターロイキン−６（Ｉ）が含まれ得る。本発明のさらなる実施形態では、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せが成長因子組合せＴＳＦＩに加えて供給される。

本発明のさらに別の実施形態において、各成長因子の濃度は約５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬであり得る。より好ましい実施形態において、本発明の方法及び組成物の適用において、Ｔは約５０ｎｇ／ｍＬ、Ｓは約５０ｎｇ／ｍＬ、Ｆは約８０ｎｇ／ｍＬ、 は約１００ｎｇ／ｍＬで供給される。

また、本発明者らによって明らかにされたように、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆ）の組合せＴＳへの追加は、純度及び最も標的とする集団の増殖倍数に与えた追加的効果は最小であったが、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭクローン形成能の有意な低下が明らかになった。すなわち、さらなる実施形態において、上記細胞の培養のためのＨＳＣ及び／又はＨＰＣの存在下での成長因子ＦとＴＳとの組合せが提供される。

本発明の方法の適用において、インターロイキン−６（Ｉ）の添加により、ＴＳＦＩの場合にＴＳ又はＴＳＦと比較して標的集団の全体的な純度及びクローン形成能の低下が観察されたが、この組合せは、生存細胞の増殖倍数の劇的な増加、並びにＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋及びＣＤ１３３^＋の臨床的に予測される集団及びより原始的なＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻⁻集団の対応する増加も示した。

ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻⁻増殖の増加と合わせて、本発明者らは、インターロイキン−６と他の成長因子との組合せが、臍帯血ＨＳＣの成り行きにも影響を与えることを明らかにした。組合せＴＳＦＩは、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ及び全芽球／コロニー形成単位の増殖倍数を増加させ、短期再増殖能力が高まることを示唆した。対照的に、成長因子組合せＴＳ及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ）（すなわちＴＳＧ）は、同様の生存細胞の増殖倍数を示したが、分化細胞の比率がより高くなった。他の幹及び前駆集団の増殖を犠牲にして顆粒球へ分化するこのシフトは、最も原始的なＨＳＣを消耗させ、移植後の利点が少ない結果となり得る。

本発明の方法及び組成物の利用を通じて、ＨＳＣ（例えばＨＰＣ）の培養を６、７又は８週間行うことが可能であり、この期間に造血前駆細胞を採取して、造血細胞の維持、増殖及び／又は分化を促進する造血成長因子を含有する培地条件にさらに曝すことが可能であると考えられる。

したがって、さらなる実施形態では、成長因子ＴＳＦＩを、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣを培養するための培地に供給して、上記細胞の培養が可能な期間を延長する。好ましくは、細胞は、６週間、より好ましくは７週間、さらにより好ましくは８週間培養することができる。本発明のさらなる実施形態では、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せなどの薬剤がＴＳＦＩの成長因子組合せに加えて供給される。

５．フィコリン及び低酸素を伴う選択された培養培地条件下でのＨＳＣ及び／又はＨＰＣの培養
本発明のさらなる態様において、低酸素環境下、並びに成長因子、及びフィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せなどの薬剤の存在下、並びに周囲レベルと比較して低減された酸素濃度の存在下でのＨＳＣ及び／又はＨＰＣ培養のための方法及び組成物が提供される。

一実施形態において、成長因子組合せＴＳＦＩは、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せのいずれかの存在下、及び酸素濃度が周囲の酸素濃度未満である環境中、培養培地中に上記濃度及び組合せのいずれかで供給される。好ましい実施形態において、酸素濃度は２０％未満である。より好ましい実施形態において、成長因子組合せＴＳＦＩは５％〜１０％の酸素レベルの下で供給され、これによりすべての標的集団の増殖倍数増大がもたらされる。特に好ましい実施形態において、成長因子組合せＴＳＦＩは１０％の酸素レベルの下で供給され、これによりすべての標的ＨＳＣ／ＨＰＣ集団の増殖倍数がもたらされる。

本発明の方法及び組成物の適用を通じて、５％及び１０％の酸素レベルでの成長因子組合せＴＳＦＩによってすべての標的集団の増殖倍数が増大し、この条件が、臍帯血由来の移植可能な細胞量の増加のために最も好ましいことが示された。

また、上述の方法及び組成物の使用において、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣが成長因子組合せ（例えば、ＴＳ±Ｆ）の存在下で培養された場合には、これらの細胞の自己再生の可能性が増大し、それ故分化の可能性が減少するという効果があることも本発明者らによって明らかにされた。

本発明のさらなる実施形態において、本発明の造血細胞は、成長因子組合せＴＳ±Ｆの存在下及び周囲酸素レベルの存在下で培養して純度を最大化させることができる。より好ましい実施形態において、酸素は、成長因子組合せＴＳ±Ｆの存在下の培養雰囲気の約２０％を構成する。さらに好ましい実施形態において、成長因子組合せＴＳ±Ｆは約２０％の酸素レベルで供給され、これにより、純度を最大化させながら増殖させ、原始的ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＨＳＣ集団の純度を増加させることができる。

本発明のさらなる態様では、フィコリンなどの薬剤及び最適化された成長因子ＴＳＦＩと組み合わされた低酸素環境の下で培養を行って、自己再生の可能性を増大させ、分化の可能性を減少させることができる、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣの培養方法が提供される。一実施形態において、培養系の酸素は、成長因子ＴＳＦＩ存在下の培養雰囲気の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％及び１５％を構成する。別の実施形態において、酸素濃度は、成長因子ＴＳＦＩ存在下の培養雰囲気の約１０％を構成する。さらに別の実施形態において、酸素濃度は、成長因子ＴＳＦＩ存在下の培養雰囲気の約１０％を構成する。特に好ましい実施形態において、酸素濃度は約５％を構成する。

別の実施形態では、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物がＴＳＦＩの成長因子組合せに加えて供給され、ここで、酸素濃度は周囲レベル未満、より好ましくは約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、又は約５％未満である。

好ましい実施形態では、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せが成長因子ＴＳＦＩの組合せに加えて供給され、ここで、酸素濃度は約５％である。

特に好ましい実施形態では、フィコリン−１又はその断片若しくは機能的等価物が成長因子ＴＳＦＩの組合せに加えて供給され、ここで、酸素濃度は約５％である。

６．選択された培地を伴うＨＳＣ及び／又はＨＰＣの培養のための組成物
先に議論したように、本発明の方法及び組成物に関連して特に注目すべき成長因子は造血成長因子である。すなわち、本発明のさらなる態様は、本発明の方法において使用するための、ＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団のエクスビボでの生存或いは通常の成長培地でのＨＳＣ及び／又はＨＰＣ集団の培養又は増殖を延長するための培養組成物を提供することを対象とする。

本発明の実施形態において、フィコリン−１、フィコリン−２若しくはフィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せを含み得る組成物が提供される。好ましい実施形態においてフィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３、その断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せは、培養培地の５０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬを構成するように培養系に添加される。好ましい実施形態において、培養系におけるフィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３、その断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せの濃度は約５０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬである。より好ましい実施形態において、培養系におけるフィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３、その断片、若しくは機能的等価物又は組合せの濃度は約５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである。

特に好ましい実施形態において、培養系におけるフィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３、その断片若しくは機能的等価物又はそれらの組合せの濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ、又は約５１ｎｇ／ｍＬ、又は約５２ｎｇ／ｍＬ、又は約５３ｎｇ／ｍＬ、又は約５４ｎｇ／ｍＬ、又は約５５ｎｇ／ｍＬ、又は約５６ｎｇ／ｍＬ、又は約５７ｎｇ／ｍＬ、又は約５８ｎｇ／ｍＬ、又は約５９ｎｇ／ｍＬ、又は約６０ｎｇ／ｍＬ、又は約６１ｎｇ／ｍＬ、又は約６２ｎｇ／ｍＬ、又は約６３ｎｇ／ｍＬ、又は約６４ｎｇ／ｍＬ、又は約６５ｎｇ／ｍＬ、又は約６６ｎｇ／ｍＬ、又は約６７ｎｇ／ｍＬ、又は約６８ｎｇ／ｍＬ、又は約６９ｎｇ／ｍＬ、又は約７０ｎｇ／ｍＬ、又は約７１ｎｇ／ｍＬ、又は約７２ｎｇ／ｍＬ、又は約７３ｎｇ／ｍＬ、又は約７４ｎｇ／ｍＬ、又は約７５ｎｇ／ｍＬ、又は約７６ｎｇ／ｍＬ、又は約７７ｎｇ／ｍＬ、又は約７８ｎｇ／ｍＬ、又は約７９ｎｇ／ｍＬ、又は約８０ｎｇ／ｍＬ、又は約８１ｎｇ／ｍＬ、又は約８２ｎｇ／ｍＬ、又は約８３ｎｇ／ｍＬ、又は約８４ｎｇ／ｍＬ、又は約８５ｎｇ／ｍＬ、又は約８６ｎｇ／ｍＬ、又は約８７ｎｇ／ｍＬ、又は約８８ｎｇ／ｍＬ、又は約８９ｎｇ／ｍＬ、又は約９０ｎｇ／ｍＬ、又は約９１ｎｇ／ｍＬ、又は約９２ｎｇ／ｍＬ、又は約９３ｎｇ／ｍＬ、又は約９４ｎｇ／ｍＬ、又は約９５ｎｇ／ｍＬ、又は約９６ｎｇ／ｍＬ、又は約９７ｎｇ／ｍＬ、又は約９８ｎｇ／ｍＬ、又は約９９ｎｇ／ｍＬ、又は約１００ｎｇ／ｍＬで供給される。

さらに別の実施形態において、インターロイキン３、６及び１１（Ｉ）、幹細胞因子（Ｓ）、トロンボポエチン（Ｔ）、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子及びＦＬＴ−３リガンド（Ｆ）からなる群から選択される成長因子を追加的に含めることができる。

本発明の別の実施形態において、各成長因子は５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で供給される。より好ましい実施形態において、Ｔは約５０ｎｇ／ｍＬ、Ｓは約５０ｎｇ／ｍＬ、Ｆは約８０ｎｇ／ｍＬ、Ｉは約１００ｎｇ／ｍＬで供給される。さらなる実施形態では、成長因子の組合せがＨＰＣ及び／又はＨＳＣと共に培養され、ここで、培養培地には、トロンボポエチン（Ｔ）、幹細胞因子（Ｓ）、ＦＬＴ−３リガンド（Ｆ）及びインターロイキン−６（Ｉ）が含まれる。

７．選択された培地組成を伴うＨＳＣ／ＨＰＣの培養方法
本発明のさらなる態様において、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣをインビトロ培養して造血起源の分化細胞を製造するための方法が提供され、当該方法では、第１の培養ステップにおいて、第１の量の造血前駆細胞を、培養造血前駆細胞の数を前記第１の量に対して増加させる条件下の環境及び期間で増殖して造血前駆細胞の数を増加させ、これにより第２の量の造血前駆細胞を生ずる。培養造血前駆細胞の数を増加させるために必要な時間は、当分野の専門家に既知の測定法、例えば培養の細胞数、光学密度又はｐＨの測定によって、又は細胞の倍加時間を算出することによって決定することができる。

第２の培養ステップでは、培養された第２の量の造血細胞（例えば造血前駆細胞）の少なくとも一部を、造血細胞の維持、増殖及び／又は分化を促進する上記造血成長因子、播種間質細胞、及び間質細胞馴化培地からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む環境で培養して、造血起源の分化細胞を得る。

本発明の方法の適用において、培養は、複数の第２の培養ステップであって、複数の培養ステップの各々が第２の量の造血細胞（例えばＨＰＣ）の一部を培養することを含む、第２の培養ステップをさらに含むことができる。

本発明のさらなる態様において、造血前駆細胞は、延長された一定の期間に連続して培養され、培養された細胞のアリコートが、追って又は間欠的に、離れた箇所で採取される。本発明の実施形態において、細胞は、本明細書で検討した成長因子及び他の薬剤を含有する培地に懸濁され、培地の撹拌及び遠心分離により細胞を簡単に採取することができる。したがって、本発明の実施形態では、造血前駆細胞を増殖させ、同時に、分化細胞のより大きな集団を発生させる処置のために増殖した細胞の一部分を採取することができる。

本発明は、成長因子の種類の最適化、造血自己再生の最大化のための濃度、他の新規及び既知因子の添加、並びに培養条件及び培養系の最適化を含む、造血ニッチの多くの種々の態様をまとめたものと考えられる。これらの態様がまとまって、骨髄などの組織及び器官を移植後に再増殖し得るＨＳＣ数を増加させるための新規及び有効な系を表す。

本発明の方法を用いて提供される単離された細胞集団は、天然に存在する細胞集団と比較して富化された細胞集団を有する。典型的には、細胞集団は、生物学的源から選択的に富化されたＨＳＣ又はＨＰＣ細胞集団である。細胞集団は、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣのＣＤ３４＋ＣＤ３８−又はＣＤ１３３＋ＣＤ３８−細胞が富化された集団を含み得る。

８．移植又は治療のための本発明の方法に従って培養されたＨＳＣ及び／又はＨＰＣの使用
本発明のさらなる態様において、本発明の方法に従って培養される造血細胞は対象の骨髄移植に利用される。

本発明の方法に従って培養された造血細胞の可能性のある適用には、疾患、例えば、白血病、リンパ腫、及び他の生命を脅かす疾患の治療として現在使用されている自家及び同種骨髄移植を補足又はこれに代替することが包含され得る。

本発明のさらなる態様において、造血幹細胞に基づく治療が必要な個体の治療方法であって、造血幹細胞を個体又はドナーから除去することと、本明細書で検討する一定量の成長因子組合せと、上述のフィコリンタンパク質などの、造血幹細胞の増殖促進に有効なタンパク質を含有する培養培地で細胞を培養することと、個体に培養細胞を移植することと、を含む方法も提供される。

本発明の方法によって製造されたＨＳＣは、化学療法、放射線療法又は骨髄移植の前、同時又は後に対象に投与され得る。対象は、骨髄損失又は枯渇した骨髄によって特徴づけられる先天性、遺伝性又は後天性の症候と関連する枯渇した骨髄を有してもよい。したがって、対象は、造血を必要とする対象であり得る。対象は骨髄ドナーであってもよく、また、枯渇した骨髄を有する又はそのリスクのある対象であってもよい。

本発明の方法及び条件を利用することによって、ＨＰＣの培養期間を増加させ、ＨＰＣの増殖数及び／又はコロニー形成単位の能力を刺激することが可能である。一実施形態では、一旦増殖したら、細胞は、例えば、患者の造血前駆細胞集団を補足又は補充するために身体に戻すことができる。これは、個体が化学療法を受けた期間の後である場合に有利であり得る。さらに、サラセミア、鎌形細胞貧血、先天性角化異常症、Ｓｈｗａｃｈｍａｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ症候群、及びＤｉａｍｏｎｄ−Ｂｌａｃｋｆａ貧血などのＨＰＣ数が減少している一定の遺伝的病態があり、これらの病態に、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣ数を増殖させる本発明の方法が有用及び適用可能であり得る。

以下、本発明を、非限定的実施例を参照してより詳細に説明する。

実施例１：
ＣＤ３４^＋細胞富化：
臍帯血は、Ｂａｒｗｏｎ Ｈｅａｌｔｈ，Ｇｅｅｌｏｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ及びＳｔ．Ｊｏｈｎ ｏｆ Ｇｏｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ジーロング，オーストラリア）での満期分娩から、バーロンヘルスヒト研究倫理委員会（９７／１４及びＳＪＯＧ １３９）及びＤｅａｋｉｎ大学ヒト研究倫理委員会（ＥＣ ７２−２００９）の承認下、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得て採取した。

採取から２４時間以内に、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心分離を行い、次いで、直接抗体標識磁気ビーズキット及び二重カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いるＣＤ３４^＋細胞富化を行って、単核細胞を得た。細胞のアリコートをフローサイトメトリー分析に使用し、残りをリカバリー凍結培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で凍結保存した。

ＨＳＣに対する培養条件の効果を決定するため、臍帯血ユニットに、少なくとも≧８０％のＣＤ３４^＋純度及び生存率を有するＣＤ３４^＋の富化を行って、増殖について試験した。培養された造血細胞集団の変化は、３つの方法：１）表面マーカーのフローサイトメトリーによる表現型的な方法、２）ＣＦＵアッセイによる機能的な方法、及び３）リアルタイムＰＣＲによるゲノム的な方法で評価した（Ｆｉｇｕｒｅ４）。培養後の標的集団の純度又はクローン形成能、標的集団の増殖倍数、及び相対的遺伝子発現をエンドポイントとして使用した（Ｆｉｇｕｒｅ５）。

エクスビボ増殖：
凍結保存細胞を３７℃で解凍し、１０倍体積のＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に滴下して移し、４００ｒｃｆで１０分間、室温で遠心分離して、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁して、トリパンブルー染色（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて生存細胞を手動で計数した。

ＣＤ３４^＋富化細胞を、１０μｇ／ｍｌのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（組換えヒトフィブロネクチン断片）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｘ）で被覆した組織培養ウェル（Ｉｎｔｅｒｐａｔｈ）で培養し、１ｍｌのＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地の１．１ｃｍ^２当たり０．５×１０^４個の生存細胞で播種した。培地には、ヒト組換え成長因子（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）：トロンボポエチン（Ｔ）（５０ｎｇ／ｍｌ）±幹細胞因子（Ｓ）（５０ｎｇ／ｍｌ）±Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆ）（８０ｎｇ／ｍｌ）±インターロイキン−６（Ｉ）（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｔ、ＴＳ、ＴＳＦ、ＴＳＦＩ）を添加した（トロンボポエチン＋幹細胞因子＋顆粒球コロニー刺激因子（ＴＳＧ）（各々１００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ製造業者推奨）と比較した）。細胞は、末梢血（１０％、約７５ｍｍＨｇ）、臍帯血（５％、約３８ｍｍＨｇ）及び骨髄（２．５％、約１９ｍｍＨｇ）に生理学的に関連する酸素レベル（ＧａｌａｘｙＲ^＋インキュベーター，ＨＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、並びに比較対象の周囲酸素レベル（２０％、約１５０ｍｍＨｇ）（Ｈｅｒａｅｕｓインキュベーター，ＫＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の下で培養し、全部で２０の異なる培養条件とした。

単一ステップ増殖については、細胞を８日間培養した後に採取し、連続増殖については、１．１ｃｍ^２当たり２×１０^４個、次いで３×１０^４個の生存細胞をそれぞれ１及び２週間培養後、細胞を再播種した。細胞をピペットで採取し、Ｄ−ＰＢＳで洗浄し、次いでトリパンブルー染色を用いて生存細胞を計数した。

富化ＣＤ３４^＋細胞を、成長因子Ｔ、ＴＳ、ＴＳＦ、ＴＳＦＩ（ＴＳＧを比較対象とした（ＦＤＡ承認ＨＳＣ増殖培地Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩの製造業者の推奨）。）を段階的に添加して培養し、すべての組合せで、細胞を、生理学的に関連する酸素レベル２．５％、５％及び１０％、並びに周囲酸素レベル（２０％）で培養した。

標的集団の純度は、フローサイトメトリーを用いて表現型的に決定した。この試験において、７ＡＡＤ生存率に関する培養前の平均値は８５±５％であり、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−−の純度は、それぞれ８１±５％、６１±８％、及び２．８±０．１％であった（データは示さず）。培養後集団について、酸素群にわたる生存率は、トロンボポエチン（Ｔ）単独の場合（６０±６％）、すべての他の成長因子組合せの場合（＞８１±３％、ｐ≦０．０１）と比較してかなり低かった（Ｆｉｇｕｒｅ１）。ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋の純度は２４±２％であり、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−−細胞の純度は２．２±０．４％であった。しかしながら、Ｔ単独条件での不十分な細胞もさらなる分析に利用できた。幹細胞因子（Ｓ）の添加によりＣＤ４５＋ＣＤ３４＋純度に変化はなかったが、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−−の割合は増加し（４．８±０．６％、ｐ≦０．０１）、培養前のレベルより高くなった。Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆ）の添加による純度の有意な差異は観察されなかった。インターロイキン−６（Ｉ）の添加はＣＤ１３３＋純度に影響を与えなかった（１２±１％）が、ＴＳ又はＴＳＦと比較してＣＤ４５＋ＣＤ３４＋及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−−細胞の純度低減をもたらした。すべての標的集団の純度はＴＳＧの場合が最も少なかった（ｐ≦０．０１）。興味深いことに、酸素効果が観察され、２０％酸素の場合にすべての標的集団にわたって純度が最大となった（ｐ≦０．０１）（Ｆｉｇｕｒｅ１）。

増殖倍数の解析では、５％及び１０％酸素下で生存細胞数が増加し、周囲（２０％）酸素下で培養した場合に増殖が最も少なくなった。ＣＦＵ−ＧＭの増殖倍数は５％酸素下でも増大し、全芽球／コロニー形成単位の増殖は５％及び１０％酸素下で増大した。さらに、この試験の２．５％酸素下で観察された増殖倍数が中間レベルであることは、インビボ及びインビトロの両方のデータで一貫していた。

フローサイトメトリーによる表現型分析：
標的細胞純度は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による培養前及び培養後に決定し、ＨＳＣ、ＨＰＣ及び多分化能細胞（ＣＤ１３３−ＰＥ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に関してはＣＤ４５−ＦＩＴＣ＋ＣＤ３４−ＰＥ＋７ＡＡＤ、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ＋ＣＤ１３３−ＰＥ＋７ＡＡＤ、及びＣＤ３８−ＦＩＴＣ＋ＣＤ３４−ＰＥ＋７ＡＡＤを、抗原感作細胞系列に関してはＣＤ６１−ＦＩＴＣ＋ＣＤ３４−ＰＥ＋７ＡＡＤ、ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ＋ＣＤ１４−ＰＥ＋７ＡＡＤ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ＋ＣＤ１９＋７ＡＡＤ（ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；他はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した（Ｆｉｇｕｒｅ４）。生存ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋集団は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ改変ＩＳＨＡＧＥプロトコールを用いて決定し、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ゲートは、公開されている推奨に従って決定した。増殖実験のために使用したＣＤ３４^＋富化試料は、８０％を超える７ＡＡＤ生存率及びＣＤ３４^＋純度を有していた。

コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイの機能的分析：
培養前及び培養後細胞を、製造業者の指示に従って、組換えサイトカイン（Ｈ４４３４；ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した「完全」メチルセルロース細胞に播種し、１４日間インキュベートし、芽球形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、コロニー形成単位−顆粒球／赤血球／単球／マクロファージ細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、及び全芽球／コロニー形成単位を数え上げた（Ｆｉｇｕｒｅ４）。

クローン形成能は、１０００細胞当たりのコロニー形成単位数によって決定した。ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭに対する培養前の値は７１±５及び７４±５であり、ＣＦＵ−ＧＥＭＭは１３±２であり、全芽球／コロニー形成単位は１０００細胞当たり１５８±５であった（データは示さず）。培養後評価により、ＴＳにおいてＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ及び全芽球／コロニー形成単位（１０００細胞当たり４４±５、３１±３、４．８±０．５、及び８０±６コロニー）が最大数になることが示された。ＴＳＦではＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ及び全芽球／コロニー形成単位のクローン形成能が減少し、ＴＳＦＩではＢＦＵ−Ｅ及び全芽球／コロニー形成単位のクローン形成能がさらに減少した。ＴＳＧを用いた培養では、ＢＦＵ−Ｅ及び全芽球／コロニー形成単位に対する値はＴＳＦＩと同等となったが、ＣＦＵ−ＧＥＭＭの数はさらに低い値となった（ｐ≦０．０１）（Ｆｉｇｕｒｅ１）。

すべての集団にわたって、最大の培養後純度及びクローン形成能がＴＳ±Ｆで得られた。特に興味深いことに、ＴＳの場合にＣＤ３４＋ＣＤ３８−−細胞の純度が増加し、培養前のレベルより高くなった。表現型的にも機能的にも標的集団はＴＳＧの存在下で最小純度となった。さらに、酸素効果が観察され、周囲レベルの場合に標的集団純度は増加したが、クローン形成能は増加しなかった。

ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びリアルタイムＰＣＲ：
培養前及び培養後試料をトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で保存した後、ＲＮＡスピン・ミニ（ｓｐｉｎ ｍｉｎｉ）ＲＮＡ単離キット（Ｉｌｌｕｓｔｒａ）を用いてＲＮＡを単離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。逆転写を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ファーストストランド合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でランダムヘキサマーを用いて行った。リアルタイムＰＣＲは、７５００ＦＡＳＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。サイバーグリーンＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＨｏｘＢ４及びＮｆ−ｙαに対応するプライマー対［ＨｏｘＢ４（フォワード：５’−ＣＣＴＧＧＡＴＧＣＧＣＡＡＡＧＴＴＣＡ−３’（配列番号７）；リバース：５’−ＧＣＴＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ−３’（配列番号８））；Ｎｆ−ｙα（フォワード：５’−ＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＧ−３’（配列番号９）；リバース：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＧＧＣＡＴＴＣＡＣＧ−３’（配列番号１０））］（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ）に使用した。Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＣＤ３４最適化前遺伝子発現アッセイ（Ｈｓ００１５６３７３＿ｍ１；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に使用し、また、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン（フォワード：５’−ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＣＴ−３’（配列番号１１）；リバース：５’−ＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１２）；プローブ：ｆａｍ−ＡＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＧＴＡＣＴＣ−ｔａｍｒａ（配列番号１３））及びＧＡＰＤＨ（フォワード：５’−ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ−３’（配列番号１４）；リバース：５’−ＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧ−３’（配列番号１５）；プローブ：ｆａｍ−ＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧ−ｔａｍｒａ（配列番号１６））（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ）に使用した。

各時点で、遺伝子発現レベルを両方のハウスキーピング遺伝子の平均に対して相対的に定量した（Ｆｉｇｕｒｅ５）。連続増殖の間の遺伝子発現を１０％酸素下のＴＳＦＩの場合に対して相対的に決定した。結果は平均±標準誤差で表す。テューキー比較を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを、Ｍｉｎｉｔａｂソフトウェアプログラム（バージョン１５）を用い、有意水準ｐ≦０．０５として行った。

純度及び増殖倍数の決定：
細胞の評価は、単一ステップ増殖については培養前及び培養後に、連続増殖については週毎に行った。培養前及び培養後の標的集団の純度及びコロニー形成単位クローン形成能を用いて、細胞集団の比率の全体的な変化を決定した（Ｆｉｇｕｒｅ５）。

増殖倍数は培養後の標的細胞数の増加を反映していた。各時点で、生存細胞数に特定標的集団の純度又はクローン形成能を掛け、これにより各時点での標的細胞数を算出する。これらの数を培養前及び培養後で比較し、標的細胞集団の増殖倍数を決定した。累積的増殖倍数は、連続する週にわたる標的集団数の増殖倍数を示す。

結果は平均±標準誤差で表す。一般的な線形モデル統計分析による二元配置ＡＮＯＶＡを、テューキーのペアワイズ比較を用い、有意水準をｐ≦０．０５として行った。

ＨＳＣ、ＨＰＣ及び多分化能細胞の臨床的に有効な増殖倍数増大：
主要な臨床的関心は、移植可能な細胞用量の増加を表す細胞集団の増殖倍数である。トロンボポエチン（Ｔ）単独では、臨床的に有効な増殖を確実にするには不十分であり、生存細胞数は２倍増（２．０±０．３）にすぎず、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞数に変化はなく、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−−細胞数は２倍増（２．６±０．８）にすぎなかった（Ｆｉｇｕｒｅ２）。ＣＤ１３３＋細胞の分析、又はＣＦＵアッセイに十分な細胞数はなかった。幹細胞因子（Ｓ）の添加により、生存細胞の増殖は２５±４倍に増大し、対応して全体の標的集団も増加した。増大が最小となる場合は、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆ）の添加で観察された。しかしながら、インターロイキン−６（Ｉ）を培養培地に含めることにより、生存細胞の増殖倍数（９９±７倍）及びすべての標的集団の増殖倍数が大きく増大した（ｐ≦０．０１）（Ｆｉｇｕｒｅ２）。具体的には、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−−細胞数は、それぞれ２１±３、１９±２、及び７８±１０倍増殖した。ＴＳＧでは、生存細胞について同様の増殖倍数が生じたが、標的ＨＳＣ及びＨＰＣ集団についてはそれが生じなかった。このことは、分化（主に顆粒球系列へ分化）の程度が高いことを示唆した（データは示さず）。適度の酸素効果が生存細胞の増殖倍数について観察され、５％及び１０％酸素では全体的に増大したが、２０％酸素では低下した（ｐ≦０．０４）。

多分化能細胞の増殖倍数は、ＣＦＵアッセイを用いて機能的に決定した。成長因子組合せ又は酸素レベルはＢＦＵ−Ｅの増殖倍数に影響を与えなかった（１８±１．２倍）（Ｆｉｇｕｒｅ２）。しかしながら、ＴＳＦＩは、すべての成長因子組合せと比較してＣＦＵ−ＧＭ及び全芽球／コロニー形成単位の増殖を大きく増大させ（２７±３及び２２±３倍）、ＣＦＵ−ＧＥＭＭの増殖（１７±３）もＴＳＧ（７±１、ｐ≦０．０１）に対して増大した。さらに、５％酸素ではＣＦＵ−ＧＭの増殖倍数が増大し（ｐ≦０．０２）、５％及び１０％酸素下の培養では全芽球／コロニー形成単位の増殖が増大したが、２０％酸素では、これらのコロニータイプのいずれにおいても増殖倍数が低下した（ｐ≦０．０１）。純度データとは対照的に、増殖倍数の表現型的及び機能型的分析の結果では、ＴＳＦＩがＨＳＣ、ＨＰＣ及び多分化能細胞の増殖に最適であり、最適な酸素レベルは５％及び１０％であることが示された。

複数の臍帯血ユニットにわたって確認された一貫した増殖の増大：
最適条件の臨床的有効性を決定するために、１０個の独立した臍帯血ユニットを各々、５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩで培養して、増殖倍数を評価した。すべての集団の平均値は、Ｆｉｇｕｒｅ１及び２に示されるデータによるものと一致し、生存細胞の増殖倍数は８７±１３であり、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−−細胞の増殖倍数はそれぞれ１９±３、１７±５、及び７３±１５であった。クローン形成集団（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、全芽球／コロニー形成単位）の平均増殖は２５±５〜３６±６であった（表１）。標的集団にわたって値の幅は見られたものの、５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩという最適条件はすべての試料で全集団の増殖をもたらし、複数の臍帯血ユニットにわたる確固たる効果が実証された（表１）。

表１に、５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩでの臍帯血エクスビボ増殖の有効性を示す。最適条件（５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩ）の臨床的有効性を複数の臍帯血ユニットについて決定した。標的細胞集団の増殖倍数は表現型的及び機能的に評価した。成長因子組合せは、トロンボポエチン（５０ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（８０ｎｇ／ｍｌ）、及びインターロイキン−６（１００ｎｇ／ｍｌ）で構成した。Ｎ＝１０の独立した臍帯血ユニット、各々３連で実施。

ＨＳＣ及び前駆細胞の累積的な増殖倍数増大を伴う連続増殖：
増殖条件によっては、ＨＳＣの枯渇が生じ、同時に長期再増殖能力の低減が生じる場合がある。累積的な増殖倍数を調べることを通じて、連続増殖によりその低減を間接的に評価する。５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩという最適条件を２０％酸素下のＴＳＧの場合と比較した。

フローサイトメトリーによる分析によって、２０％酸素下のＴＳＧでは３週間の培養後に全生存細胞数が最大となるが、同時にＣＤ４５＋ＣＤ３４＋の増殖は低下することが示された（ｐ≦０．０１）（Ｆｉｇｕｒｅ３）。対照的に、５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩでは、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞の増殖倍数の累積的な増大が示された（ｐ≦０．０１）。好中球及び巨核球前駆体の増殖に関して、２０％酸素下のＴＳＧでは主として顆粒球の分化が生じ、５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩでは、巨核球細胞（ＣＤ６１＋）の増殖増大及び顆粒球細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４−）の連続的増大が生じた（Ｎ＝１の臍帯血、３連、データは示さず）。単一ステップ又は連続増殖のいずれの時点でも、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）又はＴ細胞（ＣＤ３＋）は検出されず、増殖細胞の低い免疫原性が維持されていることが確認された（データは示さず。Ｎ＝４の臍帯血、各々３連）。

３週間の連続増殖にわたる機能的分析により、２０％酸素下のＴＳＧでは、ＢＦＵ−Ｅの累積的増殖倍数の低下（３週目で初期増殖レベル未満に低下）が生じ、同時にＣＦＵ−ＧＥＭが完全に消耗された。対照的に、累積的な増殖倍数増大が、５％酸素下のＴＳＦＩ（ＣＦＵ−ＧＭ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ）及び１０％酸素下のＴＳＦＩ（全芽球及びコロニー形成単位、ｐ≦０．０２）で示された。注目すべきことに、１０％酸素下のＴＳＦＩでは、５％ＴＳＦＩ及び２０％ＴＳＧの両方と比較してＣＦＵ−ＧＭ及び全芽球／コロニー形成単位の増殖の増大が顕著であった（ｐ≦０．０１）（Ｆｉｇｕｒｅ３）。

単一ステップ及び連続増殖の知見から、造血幹及び前駆マーカーＣＤ３４、並びにＨＳＣ自己再生関連遺伝子ＨｏｘＢ４及びＮｆ−ｙαに対する相対的遺伝子発現レベルは１０％酸素下のＴＳＦＩの場合に最も高くなり、５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩの場合は２０％酸素下のＴＳＧより高く（ｐ≦０．０１）、培養期間を通じて、存在するＣＤ３４＋細胞及び自己再生ＨＳＣの割合が大きいことが示唆された（Ｆｉｇｕｒｅ３）。要約すると、すべての標的集団及び相対的遺伝子発現レベルの分析から、１０％酸素下のＴＳＦＩの場合にＨＳＣ、ＨＰＣ及び多分化能細胞の累積増殖倍数及び割合が最大となり、ＨＳＣ及びＨＰＣの消耗の可能性が低減することが示唆される。

実施例２：
長期培養：
ＣＤ３４＋造血前駆細胞はヒト臍帯血に由来するものであった。これを、磁気抗ヒトＣＤ３４＋ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて単離した。すべての培養条件において、１〜２×１０^４細胞を、実施例１と同様の成長因子及び他の添加剤を含むＳｔｅｍｌｉｎｅ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に添加した。培養は各培養条件につき３連で実施した。したがって、各培養条件で３つの培養ウェルを使用し、各培地に１ｍｌ当たり１〜２×１０^４ＣＤ３４^＋細胞を播種した。すべての実験は、少なくとも３種の異なる臍帯血試料について独立に行った。細胞を、低酸素インキュベーター中、２％、５％、１０％又は２０％（雰囲気中）酸素分圧下で培養した。酸素分圧は培養期間を通じて定期的に監視した。

８日間の培養後、すべての細胞をすべての培養ウェルから採取し、計数し、表面抗原を染色した。表面表現型決定のための抗体として抗−ＣＤ３４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗−ＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、抗−ＣＤ３８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗−ＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を使用して、前駆細胞の分布を評価した。細胞生存率は７ＡＡＤの染色により評価した。細胞のフローサイトメトリー分析は、マルチパラメータＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー分析法を用い、実施例１に記載の方法に従って行った。細胞は、大きさ（前方及び側方散乱）及び生存率（７ＡＡＤ−）に従ってゲートした。適切な対照には、陽性及び陰性象限を形成する対応のアイソタイプ抗体、並びにコンペンセーションを実現する適切な単色染色が含まれる。各試料について、少なくとも１００００個のリストモードイベントを収集した。

コロニー形成アッセイ：
ＨＰＣがミエロイド及び赤血球コロニーを産生する能力を維持しているかどうかを決定するために、メチルセルロースアッセイを次のように実施した。サイトカイン（ＩＬ−３ ２０ｎｇ／ｍｌ；ＧＭＣＳＦ ３０ｎｇ／ｍｌ；エリスロポエチン ３ＩＵ／ｍｌ；幹細胞因子 ５０ｎｇ／ｍｌ；すべてＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，バンクーバー）と０．５ｍｌのＤＭＥＭ（２％ ＦＣＳ、１０ＩＶ／ｍｌ ペニシリン、１０ｕｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン）とを含む３．０ｍｌのメチルセルロース培地に細胞を１×１０^４／ｍｌで添加した。この混合物の１ｍｌを、シリンジを用いてスコア化したペトリ皿に加え、泡を鈍い針で除いた。各条件について３連のアッセイを行った。次いで、ペトリ皿を、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内に１０〜１４日間置いた。１０〜１４日後、コロニーの数を手動の計数によって決定した。陽性コロニーを、４０以上の細胞の蓄積に基づいてスコア化した。赤血球コロニーは、１４〜２１日後、ゴールドブラウンの色素（ヘモグロビンを示す。）に基づいてスコア化した。ミエロイドコロニーは主として透明な外観により同定した。ミエロイド細胞、赤血球細胞及び巨核球前駆体を含有するコロニーを混合コロニーとした。

実施例３：
培養条件の最適化：
１０個の異なる臍帯血試料由来の細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン、８０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６、５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び１００ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦからなる成長因子の種々の組合せの存在下、２％、５％、１０％又は２０％酸素の存在下で８日間培養した（Ｆｉｇｕｒｅ１）。試験したすべての試料のうち、５％又は１０％Ｏ_２下のトロンボポエチン、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ及びインターロイキン−６（ＴＦＳＩ）の組合せにおいてＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血細胞の増殖が最大となり、平均して３０倍の増加（培養前の値と比較）となった（Ｆｉｇｕｒｅ６）。このことは、コロニーアッセイにおいてさらに明らかとなった（Ｆｉｇｕｒｅ７）。

臍帯血ユニット間の細胞変動は増殖能力に影響を与え得ることが示された。上述したエクスビボ増殖の最適化条件を、１０個の独立した臍帯血ユニットを用いて試験して、一貫性を確認した。５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩという条件で増大した細胞において、すべての臍帯血試料のすべての標的集団が増殖した。平均の蓄積臍帯血ユニットは、＜４０ｋｇ体重のレシピエントへの移植に十分な細胞しか含有していない（Ｋｏｇｌｅｒ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８）ので、臨床適用のための好ましい最小目標値は＞３の増殖倍数値である。最適化された条件においては、１０個の試料のうち９個でこの値が達成され得、残りの臍帯血ユニットは、表現型アッセイでは適度の増殖（３．５〜２２倍）を示し、機能的アッセイでは１．４〜２．９倍の増殖倍数を示すことが実証された。高い増殖値が一貫して達成されることにより、一部の臍帯血体積を増殖させるプロトコールが可能になり、同じ臍帯血ユニットからの操作されていない及び増殖された細胞の両方の移植が可能になる。これにより、再構成の遅延を最小にしつつ、また、ＧｖＨＤは増加させずに、長期生着の可能性が最大化される。

最適培養条件を用いた長期再増殖能力を評価し、その評価から、５％及び１０％酸素下のＴＳＦＩという最適化条件では、すべての標的細胞及びコロニー集団において、２０％酸素下のＴＳＧ（トロンボポエチン（Ｔ）＋幹細胞因子（Ｓ）＋顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ））の場合と比較して顕著に高い累積増殖倍数が得られることが決定された。さらに、１０％酸素下のＴＳＦＩの場合、ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋細胞、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ及び全芽球／コロニー形成単位の増大した継続的な増殖が示され、造血幹細胞及び前駆細胞の維持及び増殖が長期的に高まることが明らかになった。対照的に、２０％酸素下のＴＳＧでは分化及びＣＦＵ−ＧＥＭＭの消耗が生じ、自己再生ＨＳＣの減少が示された。上述の最適化した培養条件を使用する場合には、臨床的に関連する遺伝子ＣＤ３４^＋及び自己再生関連遺伝子ＨｏｘＢ４及びＮｆ−ｙα（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｚｈｕ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｔｅｉｎ Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，２００４）の相対的発現レベルは１０％酸素下のＴＳＦＩの場合で最も高く、連続増殖を通じて２０％ＴＳＧよりも５％及び１０％ＴＳＦＩの場合の方が高いことが分かった。

実施例４：
フィコリンの効果：
実施例３で最良であった方法（５％又は１０％Ｏ_２でのＴＦＳＩ）を採用し、フィコリン−１、フィコリン−２、又はフィコリン−３を、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は２００ｎｇ／ｍｌのいずれかで、ＴＦＳＩ成長因子の存在下、培養培地に添加して、効果を試験した。すべてのフィコリンに関して、２００ｎｇ／ｍｌの添加はいずれの実験でも顕著な有効性を示さなかった（データは示さず）。フィコリン−１は、全細胞数並びにＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の一貫した増加を５０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌの両方の濃度で誘導し、１０％Ｏ_２で最も顕著であった（Ｆｉｇｕｒｅ８）。増殖の増大はコロニー形成単位の増加にも反映されていた（Ｆｉｇｕｒｅ９）。５％Ｏ_２では表現型的増殖に対するフィコリン−１の効果はあまり顕著でなかった（Ｆｉｇｕｒｅ１０）が、この培養条件はコロニー形成単位の増殖で最も有効であり、５％Ｏ_２での１００ｎｇ／ｍｌの添加により、全コロニーがＴＦＳＩ単独と比較して３倍を超えて増加した（Ｆｉｇｕｒｅ１１）。

表現型に対するフィコリン−２の効果は１０％Ｏ_２で最小であった（Ｆｉｇｕｒｅ６）が、５％Ｏ_２でより顕著となった（Ｆｉｇｕｒｅ１０）。今回も、表現型により測定される増殖は、両方の酸素濃度においてコロニー形成細胞による増殖の程度より低い評価となった（Ｆｉｇｕｒｅ９、Ｆｉｇｕｒｅ１１）。この不一致は、フィコリン−３を使用した場合にさらに顕著となり、表現型的に定義されたＨＳＣではいずれの酸素濃度においても増殖の証拠は示されなかった（Ｆｉｇｕｒｅ８、Ｆｉｇｕｒｅ１０）が、コロニー形成細胞では、特に１００ｎｇ／ｍｌにおいて明確な増殖が示された（Ｆｉｇｕｒｅ９、Ｆｉｇｕｒｅ１１）。

すべての実験において特に注目すべきことは、コロニー形成細胞の最も原始的な種類であるＣＦＵ−ＧＥＭＭがフィコリンの存在下では維持されるものの、不存在下では維持されない（Ｆｉｇｕｒｅ９、Ｆｉｇｕｒｅ１１）ことであり、このことから、この薬剤が原始的ＨＳＣ集団を選択的に保存することが示唆される。

本明細書に記載の本発明の趣旨を逸脱することなく種々の修飾及び／又は改変がなされ得ることは理解されよう。

Claims (35)

1. ＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団のエクスビボでの生存或いはＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団の培養又は増殖を延長する方法であって、ＨＰＣ及び／又はＨＳＣ集団を、フィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物のうちの少なくとも１つの存在下で培養するステップを含む方法。
2. ＨＰＣ及び／又はＨＳＣの再生能力及び／又は多能性が維持又は増加される、請求項１に記載の方法。
3. ＨＳＣ及び／又はＨＰＣは、酸素濃度が通常の周囲酸素濃度未満の環境でさらに培養される、請求項１又は２に記載の方法。
4. ＨＳＣ及び／又はＨＰＣは、約５０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度のフィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３及びその断片若しくは機能的等価物のうちの少なくとも１つの存在下で培養される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＨＳＣ及び／又はＨＰＣは、フィコリン−１又はその断片若しくは機能的等価物の存在下で培養される、請求項４に記載の方法。
6. 酸素濃度は約２０％未満である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 酸素濃度は約１２％未満である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 酸素濃度は約５〜１０％である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 酸素濃度は約５％である、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. ＨＳＣ及び／又はＨＰＣは、インターロイキン３、６及び１１、幹細胞因子、幹細胞リガンド、ＦＬＴ−３リガンド、及びトロンボポエチンを含む群から選択される成長因子の存在下で培養される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ＨＳＣ及び／又はＨＰＣは、成長因子のトロンボポエチン、幹細胞因子、Ｆｌｔ−３リガンド、及びインターロイキン６の存在下で培養される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 成長因子は約５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で供給される、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. トロンボポエチンは約５０ｎｇ／ｍＬ、幹細胞因子は約５０ｎｇ／ｍＬ、Ｆｌｔ−３リガンドは約８０ｎｇ／ｍＬ、インターロイキン６は約１００ｎｇ／ｍＬで供給される、請求項１１に記載の方法。
14. ＨＰＣは、ＨＰＣ数を初期のＨＰＣ数に対して増加させて第２の量のＨＰＣを生じさせるように培養される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 第２の量のＨＰＣは単離され、別の培養培地でさらに培養される、請求項１４に記載の方法。
16. 別の培養培地は、インターロイキン３、６及び１１、幹細胞因子、幹細胞リガンド、ＦＬＴ−３リガンド、及びトロンボポエチンを含む群から選択される成長因子を含み、成長因子は、ＨＰＣの維持、増殖及び／又は分化を促進して造血起源の分化細胞を産生する、請求項１５に記載の方法。
17. 培地は、接種間質細胞を含み、及び／又は間質細胞馴化培地である、請求項１６に記載の方法。
18. ＨＰＣは、ＨＰＣ及び／又はＨＳＣの増殖及び／又は分化前に６〜８週間培養される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ＨＳＣは、分画されていない骨髄、臍帯、末梢血、肝臓、胸腺、リンパ及び脾臓を含む群から選択される血液産物から得られたものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 培養ＨＳＣ及び／又はＨＰＣのインビトロでの生存を延長するための培地であって、インターロイキン３、６及び１１、幹細胞因子、幹細胞リガンド、ＦＬＴ−３リガンド、及びトロンボポエチンを含む群から選択される造血成長因子と、ＨＳＣ若しくはＨＰＣの自己再生を増強し、及び／又はＨＳＣ若しくはＨＰＣの分化を阻害する少なくとも１種の薬剤と、を含む培地。
21. 薬剤は、フィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３及びその断片若しくは機能的等価物から選択される、請求項２０に記載の培地。
22. フィコリン−１、フィコリン−２、フィコリン−３又はその断片若しくは機能的等価物は約５０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２１に記載の培地。
23. 少なくとも１種の薬剤はフィコリン−１又はその断片若しくは機能的等価物である、請求項２２に記載の培地。
24. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法に従って培養された、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣに由来する細胞の集団。
25. 請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の培地を用いて培養された、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣに由来する細胞の集団。
26. 請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の培養培地を用い、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法に従って培養された、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣに由来する細胞の集団。
27. 細胞は、増殖したＨＳＣ及び／又はＨＰＣ細胞である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のＨＳＣ及び／又はＨＰＣに由来する細胞の集団。
28. 細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のＨＳＣ及び／又はＨＰＣに由来する細胞の集団。
29. 細胞は、必要とする対象における臨床的造血幹細胞移植又は造血機能増強のために処方可能である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の細胞の集団。
30. 対象はヒトである、請求項２９に記載の細胞の集団。
31. 造血機能の欠如に関連する状態の治療方法であって、治療が必要な対象に治療有効量の請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の細胞の集団を投与するステップを含む方法。
32. 対象は哺乳動物である、請求項３１に記載の方法。
33. 哺乳動物はヒトである、請求項３２に記載の方法。
34. 実施例及び／又は図面のいずれかを参照して実質的に本明細書に記載されている、請求項１に記載の方法。
35. 実施例及び／又は図面のいずれかを参照して実質的に本明細書に記載されている、請求項２０に記載の培地。

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