CN101508975A - 一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控造血干/祖细胞体外扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控脐血造血干/祖细胞(He)体外扩增的方法，属于生物技术与组织TSPCS程领域。其特征是将人源成骨细胞使用明胶－海藻酸钠－壳聚糖(GAC)微囊包埋作为基质饲养层细胞，在5％的低氧环境中与脐血HSPCs进行共培养，收获HSPCs。本发明使用GAC微囊将人源成骨细胞与脐血HSPCs隔离开，避免了细胞污染和免疫排斥反应。而微囊的孔道又可使微囊内部成骨细胞分泌的造血生长因子扩散到HSPCs聚集处，起到刺激造血干/祖细胞扩增的作用。而微囊材料本身又对生长因子的扩散起到缓释作用，使得微囊表面生长因子浓度梯度增大，这对于生长因子的长期作用很有帮助。并且，微囊化的成骨细胞形成了3D环境，与贴壁培养的成骨细胞共培养模式相比，一方面可以使培养体系中包含更多的成骨细胞，另一方面也使其具有更大的HSPCs－OBs作用面积。此外，在5％的低氧环境中，共培养体系可以更好的模拟人体骨髓的造血微环境杗iche，成骨细胞对造血干/祖细胞的干细胞特性维持和数量扩增作用都更为显著。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与组织工程领域，涉及到一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控脐血造血干/祖细胞(Hematopoieticstem/progenitorcells，HSPCS)体外扩增的方法。
背景技术
数量稀少的造血干/祖细胞是体内各种成熟血细胞的唯一来源，它主要存在于脐带血、骨髓和外周血中(Weissman，Cell，2000，100(1)：157-168)。脐带血是目前临床上造血干/祖细胞的重要来源，其富含更早期的造血干/祖细胞、免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34+CD38-与CD34+CD33-的比例较高(Tanavdeetal.，ExperimentalHematology，2002，30(7)：816-823)等一系列优点，使得与脐带血有关的造血干/祖细胞的研究成为热点。
然而，单份脐带血只有50-100毫升，所含的造血干/祖细胞数量有限，直接用于细胞移植时最多仅够30公斤以下体重的儿童使用，不足以用于成人重建其骨髓的造血功能(McNienceetal.，ExperimentalHematology.2001，29(1)，3-11)。近年来不断发展的造血细胞体外扩增技术，希望能在短时间内扩增细胞，满足临床移植的需要。但研究发现，体外扩增造血干/祖细胞在添加大量的细胞因子后常使其发生过度的分化，难以维持造血干/祖细胞的性能，输入体内后的移植效果不能令人满意。因此，寻找更加合理的体外扩增手段，使造血细胞在体外大量扩增的同时，又能保持其干/祖细胞的特性，是研究中要解决的关键问题。
自Schofield(1978)首次提出干细胞增殖、发育存在于微环境的假说，随后大量研究均充分证明了干细胞生态位区的存在(Wattetal.，Science，2000，287(5457)：1427-1430；Spradlingetal.，Nature，2001，414：98-104)。长期以来，造血微环境被认为是由网状细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血窦内皮细胞、脂肪细胞及细胞外基质等构成。成骨细胞仅为骨髓造血提供支架结构，起保护作用。近年来相关研究证实(Lemischkaetal.，Nature，2003，425(6960)：778-779；Arai，ClinCalcium，2005，15(7)：73-79)，成骨细胞是组成成人骨髓内造血微环境重要的细胞成分之一，是构建造血生态位区至关重要的支撑成分，并对位居其中的造血干/祖细胞的发育、增殖、分化及成熟等生理活动发挥着关键性的调控作用。
Calvi(Calvietal.，Nature，2003，425(6960)：841-846)和Zhang(Zhangetal.，Nature，2003，425(6960)：836-841)等发表在Nature的研究进一步明确了在造血生态位区中，成骨细胞对维持和扩增长期造血干细胞(LT-HSCs)起到了关键性的调节作用。Calvi等研究副甲状激素(PTH)受体的信号传导途径时发现，甲状激素受体的过度表达可促进成骨细胞的增生，导致骨髓中造血干/祖细胞数目的增多，该研究还证明了成骨细胞内Jagged-1受体表达的增强可以促使造血干/祖细胞内Notch-1信号的传导加强，从而引起长期造血干细胞数目的增多。Zhang等还进一步证实了位于骨内表面纺锤形N-cadherin+CD45-成骨细胞(SNO)与长期造血干细胞相互接触粘附主要是通过表达于二者表面的N-cadherin与？catenin形成的复合结构来实现的。
以上有关成骨细胞与造血干细胞关系的研究均是在体内进行的。目前以成骨细胞为基质层细胞支持造血干祖细胞体外扩增的研究还非常少，仅有华西医学院黄晓兵等(Huangetal.，ChinJHematol，2006，27(12)：795-800)将骨髓MSC诱导的类成骨细胞进行造血支持研究，但是对CD34+细胞的扩增并不理想，经过两周的培养，CD34+细胞含量下降至初始浓度的34％-63％。
低氧浓度也是骨髓造血niche区域的特征之一，因此在造血干/祖细胞体外培养过程中，低氧环境也起到非常重要的作用。Smith(Smithetal.，BrJHaematol，1986，63(1)：29-33)和Koller(Kolleretal.，Blood，1992，80(2)：403-409)等应用3％-7％的低氧环境进行造血细胞的体外培养，发现这些中度的低氧环境均能增加各系祖细胞的产率，且不影响它们的分化与成熟。这可能是因为其氧浓度接近于体内造血环境的氧含量，比在常氧条件下的培养体系能减少氧自由基的形成或增加细胞因子的生成。孙冰等(Sunetal.，ActaPhysiologicaSinica，2000，52(2)：143-146)进行了低氧和常氧条件下单核细胞和CD34+细胞的半固体和液体培养，计细胞总数和集落产率，发现体外低氧环境能显著增加CD34+造血干/祖细胞形成红系祖细胞的产率，且使其对细胞因子的依赖性降低，并对早期红系祖细胞的维持有增强作用。体内造血过程是一个非常复杂而周密的调节系统，低氧所致造血细胞增殖、分化和凋亡的改变是由一系列细胞内信号转导、各种生物化学反应及相关基因表达改变的综合结果。
基于目前对成骨细胞与造血生态位区关系的最新认识，从工程学角度设计出一种模拟人体骨髓微环境(体内造血生态结构)的培养系统，即采用微囊化成骨细胞在低氧条件下与脐血造血干/祖细胞共培养的方法，在实现造血干/祖细胞有效扩增的同时，又尽可能的保持其干/祖细胞特性，具有非常重要的临床应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控造血干/祖细胞体外扩增的方法。
本发明的技术方案包括以下步骤：
1.人源成骨细胞的培养：采用健康儿童源髂骨松质骨，保持无菌，放于盛有PBS缓冲液的培养皿中，用眼科剪去除髂骨上的血块和软组织，至无肉眼可见的软组织和血块附着。更换PBS液，剪碎髂骨至约1mm3，用PBS液反复冲洗，吸去PBS液。将髂骨组织块移至离心管中，加入适量0.25％胰酶消化液，在37℃恒温水浴中搅拌消化15min，加10％新生牛血清DMEM培养液适量，终止消化。离心(1000rpm，5min)后，弃上清。用1mg/ml的II型胶原酶消化，在37℃恒温水浴中搅拌消化90min，加10％新生牛血清DMEM培养液适量，终止消化。离心(1000rpm，5min)后，弃上清。加10％新生牛血清DMEM培养液适量调节细胞浓度为1×105cells/ml浓度接种于T-flasks，置于5％CO237℃恒温培养箱中培养。待细胞生长至壁面85％融合后，传代两次，即可使用。
2.成骨细胞包囊：取第3-6代成骨细胞进行共培养实验。用0.25％胰蛋白酶消化2-3min后用含血清的DMEM培养基终止消化，离心(1000rpm，10min)，去除上清液，加入明胶溶液(2.0％w/v)重悬，调整细胞密度为2×106cells/ml，在37℃培养箱中孵育30min。按海藻酸钠:明胶＝3:1的比例加入海藻酸钠溶液(2.0％w/v)，混合均匀，加入到注射器中，此时细胞密度为5×105cells/ml，明胶溶液终浓度为0.5％(w/v)，海藻酸钠终浓度为1.5％(w/v)。连接高压静电发生器，电压6kY，使用5号针头，调整注射器泵，流速约40ml/h，滴加1ml到30mlCaCl2(100ml/l)溶液中，室温下磁力搅拌反应10min，用PBS冲洗三次。然后将胶珠加到壳聚糖溶液(0.5％w/v)中，覆膜反应10min，用PBS冲洗三次，再用IMEM冲洗一次。将微囊加到6孔板中，并添加3mlIMEM，然后将孔板置于培养箱中孵育24h，以使成骨细胞适应这种环境。分别制备两批微囊，放在常氧培养箱(37℃、5％CO2、20％O2)和低氧培养箱(37℃、5％CO2、5％O2)中。
3.造血干/祖细胞的分离：脐带血采自健康足月分娩产妇，并经产妇及其家人知情同意。将采集到的含抗凝剂的脐带血缓慢叠加到Ficoll淋巴分离液上，两者体积比为2:1。然后，进行密度梯度离心(2500rpm，25min)，吸取中间白膜层。将吸取到的细胞用含有10％胎牛血清的D-Hank’s平衡盐溶液离心洗涤两次(1000rpm，5min)，之后调整密度接种到培养瓶中备用。在接种到6孔板共培养以前，单个核细胞在培养瓶中过夜，以适应体外生长条件。
4.成骨细胞与造血干/祖细胞共培养：调整脐血单个核细胞密度为2×105cells/ml，接种于装有成骨细胞微囊的6孔板中，每孔添加3ml。培养基采用IMEM培养基并补充较低剂量的生长因子组合，包括2.4ng/mlIL-3、10ng/mlFL、20ng/mlSCF、2.0ng/mlGM-SCF和3.2ng/mlTPO。每24h，从6孔板中取出约0.2ml样品，以计总有核细胞密度，检测培养液pH值，葡萄糖和乳酸浓度，在0h和168h时，进行集落形成能力检测。
5.收获造血干/祖细胞：使用PBS清洗成骨细胞微囊，使之和脐血单个核细胞分离。后离心，收获总有核细胞。
本发明的效果和益处是：
5％的低氧环境接近于体内骨髓腔中造血干细胞壁龛的实际氧含量，成骨细胞对HSPCs的干细胞特性维持和数量扩增作用都更为显著；在此种氧含量中，成骨细胞分泌生长因子含量升高，有利于达到HSPCs扩增的适宜浓度；并且，较低的氧含量可减少氧自由基对生长因子的氧化损伤，使得造血生长因子可以长期存在于共培养体系中，对HSPCs进行长期的支持和调控；
所构建的包埋有成骨细胞的3D低氧环境接近骨髓腔内壁面微环境，可使脐血HSPCs以对称分裂的方式进行扩增，同时抑制其分化，从而使得CD34+细胞的含量上升；
使用GAC微囊将人源成骨细胞与脐血HSPCs隔离开，避免了细胞污染和免疫排斥反应；而微囊的孔道又可以使微囊内部成骨细胞分泌的造血生长因子扩散到微囊表面的HSPCs聚集处，从而形成为数众多的niche，起到刺激造血干/祖细胞扩增的作用；
GAC微囊材料对生长因子的扩散起到缓释作用，使得微囊表面生长因子浓度梯度增大，这对于生长因子的长期作用很有帮助；
微囊化的成骨细胞形成了3D环境，与贴壁培养的成骨细胞共培养模式相比，一方面可以使培养体系中包含更多的成骨细胞，另一方面也使其具有更大的HSPCs-OBs作用面积；
利用本发明一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控HSPCs体外扩增的方法，对GAC微囊包埋的人源成骨细胞与脐血HSPCs在5％的低氧条件下进行了三维共培养。结果表明：HSPCs在此种共培养体系中生长良好，总有核细胞、CD34+细胞和CFU-Cs的扩增倍数分别可以达到49.0±4.6、87.6±8.3和9.8±0.8倍。
附图说明
图1(A)是微囊化成骨细胞与脐血HSPCs共培养一天后细胞近距离相互作用的情况图。图中：红色箭头为成骨细胞，黄色箭头显示为HSPCs。
图1(B)是微囊化成骨细胞与脐血HSPCs共培养2天后细胞近距离相互作用的情况图。图中：红色箭头为成骨细胞，黄色箭头显示为HSPCs。
图2是造血总细胞的生长曲线图。图中共培养的两组造血细胞扩增较快，而非共培养的两组造血细胞生长缓慢；在低氧共培养条件下，在第7天的时候，细胞密度达到(24.8±2.4)×105cells/mL。
图3是脐血总有核细胞扩增倍数示意图(**P<0.01)。
图中：a’组脐血总有核细胞扩增最大，达到了49.0±4.6-fold；
a组脐血总有核细胞扩增为17.7±1.2-fold；
b’组脐血总有核细胞扩增为3.3±0.5-fold；
b组脐血总有核细胞扩增为1.9±0.2-fold。
说明共培养条件对造血细胞生长的促进是主要的，而在低氧条件下，人成骨细胞对造血生长的刺激更为显著。
图4是CD34+细胞扩增倍数示意图(**P<0.01)。
a’组CD34+细胞扩增最为显著，达到87.6±8.3-fold；
a组为14.9±1.0-fold；
b’组为2.2±0.3-fold
b组CD34+细胞总量则有所下降，仅为初始值的40％。
图5是四组造血细胞集落培养后的扩增倍数示意图(**P<0.01)。CFU-Cs是上述三种集落的综合，反应了干/祖细胞的整体扩增能力。
a’组CFU-Cs集落扩增了9.8±0.8-fold；
a组扩增了6.9±0.7-fold；
b’组扩增了3.5±0.4-fold；
b组扩增了2.6±0.2-fold。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图详细说明本发明的具体实施例。
实施例1常氧条件下微囊化成骨细胞与脐血HSPCs的共培养
成骨细胞包埋密度为8×105cells/mL，每孔添加1mL，每组平行三孔，一共2组。一组用来与造血细胞进行共培养，另一组作为对照不加造血细胞。微珠的直径为0.5mm。常氧环境中与成骨细胞共培养组记为a，脐血单个核细胞单独培养记为b。调整新鲜分离的脐血总有核细胞密度为2×105cells/mL，接种于装有人源成骨细胞微珠的6孔板中，每孔添加2mL，每组平行3孔。培养基采用无血清IMDM，添加少量生长因子，包括2.4ng/mLIL-3，20ng/mLSCF、10ng/mLFL、2.0ng/mLGM-SCF和3.2ng/mLTPO。共培养7天，每天取样前轻轻吹散细胞，使人成骨细胞分泌的信号因子和造血生长因子等分散均匀，每孔取0.2mL细胞悬液进行各种检测，取样后补加相同体积的新鲜培养液。当细胞密度超过2×106cells/mL后进行半量换液。每天取样计细胞数，检测总有核细胞细胞数量变化，同时做CD34+细胞含量检测。
实验结果：a组UCB-MNCs扩增倍数为17.7±1.2-fold，b组仅为1.9±0.2-fold；a组CD34+细胞扩增倍数为14.9±1.0-fold，b组几乎无扩增；而CD34+含量则从共培养前的1.9％分别下降为1.6％(a组)和0.4％(b组)。
此实施例说明：微囊化的人源成骨细胞对造血干/祖细胞具有显著的促进作用，但在常氧条件下容易导致总有核细胞中CD34+细胞含量的显著下降。提示在低氧条件下，可能会取得较好的效果。
实施例2不同直径成骨细胞微胶珠与脐血HSPCs的共培养
调整脐带血单个核细胞密度为2×105cells/mL，接种于6孔板中，每孔添加3mL细胞悬液。然后向每孔加入1mL成骨细胞密度为5×105cells/mL的微胶珠。成骨细胞与脐血造血细胞数量比为5:6。置于低氧培养箱(5％O2，20％CO2，37℃)中培养。0.5mm微胶珠组记为A，2mm微珠组记为B。共培养基采用无血清IMDM，以实施例1的标准添加少量生长因子。共培养7天，每天取样前轻轻吹散细胞，使成骨细胞分泌的信号因子和造血生长因子等分散均匀，每孔取0.2mL细胞悬液进行各种检测，取样后补加相同体积的新鲜培养液。另外，进行造血细胞单独培养作为对照组，培养和检测方法与共培养组相同。
实验结果：A组中造血细胞共扩增了18.7±1.6倍，B组细胞扩增了12.7±0.8倍，对照组中细胞扩增了4.2±1.1倍。A组显著优于B和对照组。
此实施例说明：与0.5mm载成骨细胞微囊共培养的脐血细胞生长更加旺盛，CFU-Cs和CD34+结果也表明了0.5mm的微囊更适合用来共培养。小的直径可以使两种细胞之间的距离更加接近，这对细胞间绒毛相互接触、表面蛋白相互作用更有帮助，而这种作用对于造血干/祖细胞扩增和性质的维持很有必要。
实施例3优化条件下微囊化成骨细胞与脐血HSPCs的共培养
成骨细胞包埋密度为8×105cells/mL，每孔添加1mL，每组平行三孔，一共2组。一组用来与造血细胞进行共培养，另一组作为对照不加造血细胞。微珠的直径为0.5mm。低氧环境中与人成骨细胞共培养组记为a’，脐血单个核细胞单独培养记为b’。调整新鲜分离的脐带血总有核细胞密度为2×105cells/mL，接种于装有人源成骨细胞微珠的6孔板中，每孔添加2mL，每组平行3孔。培养基采用无血清IMDM，以实施例1的标准添加少量生长因子。共培养7天，每天取样前轻轻吹散细胞，使人成骨细胞分泌的信号因子和造血生长因子等分散均匀，每孔取0.2mL细胞悬液进行各种检测，取样后补加相同体积的新鲜培养液。当细胞密度超过2×106cells/mL后进行半量换液。每天取样计细胞数，检测总有核细胞细胞数量变化，同时做CD34+细胞含量检测。
实验结果：a’组UCB-MNCs扩增倍数为49.0±0.6-fold，b’组仅为3.3±0.5-fold；a’组CD34+细胞扩增倍数为87.6±8.3-fold，b’组为2.2±0.3-fold；而CD34+含量则从共培养前的1.9％分别上升为3.4％(a’)和下降为1.3％(b’)。
此实施例说明：5％的低氧条件下微囊化的人源成骨细胞对造血干/祖细胞具有更加显著的促进作用。GAC微囊将人源成骨细胞与脐血HSPCs隔离开，避免了细胞污染和免疫排斥反应。微囊孔道又可使成骨细胞分泌的造血生长因子扩散到HSPCs聚集处，起到刺激造血干/祖细胞扩增的作用。微囊材料对生长因子的扩散起缓释作用，使得微囊表面生长因子浓度梯度增大，这对于生长因子的长期作用很有帮助。并且，微囊化的成骨细胞形成了3D环境，与贴壁培养的成骨细胞共培养模式相比，一方面可以使培养体系中包含更多的成骨细胞，另一方面也使其具有更大的HSPCs-OBs作用面积。此外，在5％的低氧环境中，共培养体系可以更好的模拟人体骨髓的造血微环境杗iche，成骨细胞对造血干/祖细胞的干细胞特性维持和数量扩增作用都更为显著。
表1是培养前后CD34+细胞百分数变化。培养前，CD34+细胞含量为1.9％。a’组，CD34+细胞含量升为3.4％；其它三组都有所下降。说明没有人成骨细胞支持的常氧情况下，CD34+细胞在体外很难维持生长。相比之下，低氧环境对CD34+细胞则有较好的维持。
表1
| 实验分组 | 培养前CD34+细胞含量％ | 培养后CD34+细胞含量％ |
| a’ | 1.9％ | 3.4％ |
| b’ | 1.9％ | 1.3％ |
| a | 1.9％ | 1.6％ |
| b | 1.9％ | 0.4％ |
实施例4优化条件扩增后HSPCs的集落形成CFU-Cs能力检测
将扩增前的单个核细胞和扩增后的细胞分别以1×105cells/ml的密度接种于甲基纤维素半固体培养基(MethoCultTMGFH4435.StemCellTechnologies公司产品)中，内含30％FBS、10g/L牛血清白蛋白、10-4mol/L2-巯基乙醇、2mmol/LL谷氨酰胺、SCF50ng/ml、IL-320ng/ml、IL-620ng/ml、GM-CSF20ng/ml、G-CSF20ng/ml和EPO3U/ml，于37℃、5％CO2、饱和湿度下培养7d和14d后计数CFU-Cs。
实验结果：BFU-E比较，共培养的两组集落扩增较多，分别为9.4±0.8-fold(a’)和6.4±1.1-fold(a)；而非共培养两种扩增较少，分别为3.5±0.2-fold(b’)和2.5±0.3-fold(b’)；CFU-GM集落对比发现，a’和a组显著高于b’和b组，四组扩增结果分别为8.5±0.6-fold，7.7±0.9-fold，4.2±0.8-fold和3.6±0.3-fold；CFU-GEMM结果体现了培养后更原始造血细胞的扩增情况，而这四组结果差异很大，a’组扩增最多，达到13.3±1.7-fold，a组扩增了6.1±0.9-fold，b’和b组分别为2.1±0.2-fold和1.1±0.4-fold；CFU-Cs是上述三种集落的综合，反应了干/祖细胞的整体扩增能力，a’组CFU-Cs集落扩增9.8±0.8-fold，a组6.9±0.7-fold，b’组扩增了3.5±0.4-fold，b组为2.6±0.2-fold。
此实施例说明：5％的低氧条件下微囊化人源成骨细胞的支持和调控对造血BFU-E，CFU-GM，CFU-GEMM和CFU-Cs集落的扩增有明显的促进作用，这充分说明，5％的低氧条件和人成骨细胞的支持都对结果有显著影响，并且具有明显的协同作用。
尽管本发明是以微囊化人源成骨细胞在低氧环境中支持和调控脐血造血干/祖细胞为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，其他种类的滋养细胞、其他浓度的低氧环境以及实施例的其他变形，对于本领域技术人员都是可以预料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。
Claims (1)
- 【权利要求1】一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控造血干/祖细胞体外扩增的方法，其特征在于：(1)人源成骨细胞的培养：采用健康儿童源髂骨松质骨，保持无菌，放于盛有PBS缓冲液的培养皿中，用眼科剪剪去除髂骨上的血块和软组织，至无肉眼可见的软组织和血块附着；更换PBS液，剪碎髂骨至约1mm3，用PBS液冲洗，吸去PBS液；将髂骨组织块移至离心管中，加入适量0.25％胰酶消化液，在37℃恒温水浴中搅拌消化15min，加10％新生牛血清DMEM培养液适量，终止消化；1000rpm离心5min后，弃上清；用1mg/ml的II型胶原酶消化，在37℃恒温水浴中搅拌消化90min，加10％新生牛血清DMEM培养液适量，终止消化；1000rpm离心5min后，弃上清；加10％新生牛血清DMEM培养液适量调节细胞浓度为1×105cells/ml浓度接种于T-flasks，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养；待细胞生长至壁面85％融合后，传代两次，即可使用；(2)成骨细胞包囊：取第3-6代成骨细胞进行共培养实验；用0.25％胰蛋白酶消化2-3min后用含血清的DMEM培养基终止消化，1000rpm离心10min，去除上清液，加入2.0％(w/v)明胶溶液重悬，调整细胞密度为2×106cells/ml，在37℃培养箱中孵育30min；按海藻酸钠:明胶＝3:1的比例加入2.0％(w/v)海藻酸钠溶液，混合均匀，室温下磁力搅拌反应10min，用PBS冲洗三次；然后将胶珠加到0.5％(w/v)壳聚糖溶液中，覆膜反应10min，用PBS冲洗三次，再用IMEM冲洗一次；将微囊加到6孔板中，并添加3mlIMEM，然后将孔板置于培养箱中孵育24h；分别制备两批微囊，放在常氧培养箱和低氧培养箱中；(3)造血干/祖细胞的分离：脐带血采自健康足月分娩产妇；将采集到的含抗凝剂的脐带血缓慢叠加到Ficoll淋巴分离液上，两者体积比为2:1；然后，进行2500rpm25min密度梯度离心，吸取中间白膜层；将吸取到的细胞用含有10％胎牛血清的D-Hank’s平衡盐溶液1000rpm离心5min洗涤两次，之后调整密度接种到培养瓶中备用；在接种到6孔板共培养以前，单个核细胞在培养瓶中过夜；(4)成骨细胞与造血干/祖细胞共培养：调整脐血单个核细胞密度为2×105cells/ml，接种于装有成骨细胞微囊的6孔板中，每孔添加3ml；培养基采用IMEM培养基并补充较低剂量的生长因子组合，包括2.4ng/ml IL-3、10ng/ml FL、20ng/ml SCF、2.0ng/mlGM-SCF和3.2ng/mlTPO；每24h，从6孔板中取出约0.2ml样品，以计总有核细胞密度，检测培养液pH值，葡萄糖和乳酸浓度，在0h和168h时，进行集落形成能力检测；(5)收获造血干/祖细胞：使用PBS清洗成骨细胞微囊，使之和脐血单个核细胞分离；后离心，收获总有核细胞。
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| PB01 | Publication | ||
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