CN103789259A

CN103789259A - 自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法

Info

Publication number: CN103789259A
Application number: CN201410046205.3A
Authority: CN
Inventors: 孙博
Original assignee: JIANGSU LIFECEL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU LIFECEL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-02-10
Filing date: 2014-02-10
Publication date: 2014-05-14

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法。该方法包括如下步骤：步骤a：收集血液样品，步骤b：分离血液样品中单核细胞成分，步骤c：单核细胞在单核细胞孵育液中孵育30-60分钟，步骤d：利用CD34抗体富集分离单核细胞成分中的造血干细胞，并回收CD34表达阴性的细胞组分，步骤e：使用包含Notch-1的化学成分确定的造血干细胞扩增培养基培养造血干细胞，并使用添加了ROCK抑制剂的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞。本发明能够从一份血液样品中同时获得高活性、能扩增的造血干细胞和间充质干细胞，从而充分利用资源，促进行业发展。

Description

自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法。

背景技术

干细胞是指生物体内能够进行自我更新，并维持机体各组织细胞新陈代谢的一群细胞。同时，在生物体内各种组织受到内源或外源性的损害时，干细胞可以被激活执行分化功能，从而达到修复该组织的目的。间充质干细胞在适当的条件下，具有强大的增值能力和分化能力，能够修复多种组织损伤，包括骨骼，肌肉，神经等组织，因此，间充质干细胞在再生医学治疗领域引起了越来越多的重视。而造血干细胞是指生物体内能够进行自我更新，并维持机体血液组织细胞新陈代谢的一群细胞。在生物体血液组织受到内源或外源性的损害时，干细胞可以被激活执行分化功能，有层次的生成红细胞、白细胞和巨噬细胞等各种血液组织细胞，从而达到修复血液组织的目的。病人由于各种原因，实际上可能只是血液组织中某个组分丢失，比如艾滋病中CD4阳性细胞群丢失，所以成分输血更具有针对性，也有更好的治疗预期。

骨髓当中含有丰富的间充质干细胞和造血干细胞，因此得到了最为广泛和深入的研究。研究证实，骨髓间充质干细胞表达特定的表面抗原表型，比如，CD45-, CD34-, CD29+, CD90+, CD73+和CD105+。在体外和体内环境中可向骨骼，软骨，神经以及胰岛等细胞分化。另外，骨髓间充质干细胞具有免疫调节的功能，分泌多种免疫相关信号分子，从而在免疫性疾病治疗过程中发挥作用。但是，尽管骨髓间充质干细胞细胞较易分离和培养，但是，骨髓来源有限，难以满足临床大量的需求。即便是进行病人的自体移植，患者也必须承担额外的痛苦。在其他组织，比如肌肉，脂肪，脑以及脐带血等其它组织也能分离获得间充质干细胞。这些细胞有与骨髓间充质干细胞相似的抗原表型和分化能力。骨髓当中也含有丰富的造血干细胞，因此得到了最为广泛和深入的研究。几十年前，人们已经开始进行骨髓移植来治疗白血病。骨髓移植的实质是造血干细胞的移植。研究证实,骨髓造血干细胞表达特定的表面抗原表型，比如，CD133,CD34等。实验表明，给白血病实验实验小鼠模型仅仅移植一个造血干细胞，也可以完全重建血液组织。

脐带血是指早产或正常分娩婴儿脐带内的血液。已经证实，脐带血中含有活性很强的干细胞群，包括造血干细胞和间充质干细胞。脐带血中的间充质干细胞与骨髓干细胞相似，有着相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文献表明，脐带血干细胞有着更原始的干细胞特性和更低的免疫原性。同时，应用脐带血治疗糖尿病，神经损伤以及血管坏死等疾病也屡见报道。同时，已经证实，脐带血中含有活性很强的造血干细胞群。脐带血中的造血干细胞与骨髓造血干细胞相似，有着相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文献表明，脐带血造血干细胞有着更原始的干细胞特性和更低的免疫原性。

人体的外周血液中也含有一定数量的造血干细胞和间充质干细胞。尽管数量相对脐带血中干细胞的数量稀少，但是通过动员骨髓内的造血干细胞进入循环系统，也能够获得相当数量的干细胞应用于临床。另外，人体的外周血是可以随时采取进行处理的干细胞来源，所以人们仍然试图从外周血中获取间充质或造血干细胞来满足应用。

然而，在目前通用的技术条件下，一般都只能从一份血液或骨髓样品中提取单一种类的干细胞，或者是造血干细胞，或者是间充质干细胞。由于造血干细胞和间充质干细胞在特性和功能上的不同，导致其在临床使用时各有优势。如果从一份人的血液或骨髓样品中仅仅能提取一种干细胞，无疑是一种巨大的浪费。而如果能够从一份样品中同时提取并扩增两种干细胞，则不仅仅是节约了资源，降低了成分，还为临床同时配合使用两种干细胞，获得最好临床效果提供了可能。本发明能够从一份血液样品中同时获得高活性、能扩增的造血干细胞和间充质干细胞，从而充分利用血液样品资源，促进行业发展。

发明内容

本发明提供了一种能够从一份血液样品中同时获得高活性、能扩增的间充质干细胞和造血干细胞。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

步骤a：收集血液样品，

步骤b：分离血液样品中单核细胞成分，

步骤c：单核细胞在单核细胞孵育液中孵育30-60分钟，

步骤d：利用抗体富集分离单核细胞成分中的造血干细胞，并回收该抗体表达阴性的细胞组分，所述分离的方法，包括磁珠或流式细胞仪。

步骤e：使用包含Notch-1的化学成分确定的造血干细胞扩增培养基培养造血干细胞，并使用添加了ROCK抑制剂的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞。

本发明是从同一份人的血液样品中获取高活性、能扩增的造血干细胞和间充质干细胞等两类细胞。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品是指人的血液样品。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品是指新鲜采集或存贮的脐带血、周边血或骨髓。所述脐带血血液样品均经过肝素抗凝，甲基纤维素沉降红细胞，密度梯度离心获取单核细胞成分之后进行接种。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤c中，单核细胞孵育液是指包含了谷氨酰胺，抗坏血酸，维生素E，胰岛素的高糖DMEM。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤d中，所述抗体为造血干细胞表面特征性抗原的抗体或抗体组合。所述特征性抗原，指任何具有标志意义的造血干细胞表面抗原，包括CD34和CD133抗原。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤d中，所述抗体为CD133或者CD34。本方法同时回收了上述两种抗体表达的阴性和阳性两类细胞群。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤e中，包含Notch-1的化学成分确定的造血干细胞扩增培养基指IMDM培养基；添加成分为血小板生成素（Thrombopoietin TPO)，10-50ng/ml Noth-1,和10-50ng/ml Flk-2/Flt3 ligand（FL），和 1% 牛血清白蛋白（BSA）。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤e中，添加了ROCK抑制剂的间充质干细胞培养基指：α-MEM，Rho相关蛋白激酶抑制剂，1% Pen-Strep，50ng/ml b-FGF，10ng/ml EGF，10ng/ml TGF-β；其中，α-MEM为α-最小必需极限培养基；Pen-Strep为青霉素-链霉素，b-FGF为 b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，TGF-β为转化生长因子。

本发明的有益效果是，本发明使用了单核细胞孵育液孵育、造血干细胞表面抗原标记并进行分离、包含Notch-1成分确定的培养基对造血干细胞扩增、添加了ROCK抑制剂的间充质干细胞培养基对间充质干细胞进行扩增培养等步骤，从一份脐带血中同时获得高活性、能扩增的造血干细胞和间充质干细胞，实现了本发明。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是脐带血造血干细胞方式；

图2是第5代脐带血间充质干细胞生长形态。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明做进一步说明。

本发明涉及，从一份血液样品中同时获得高活性、能扩增的造血干细胞和间充质干细胞的方法。本发明提出，在从血液样本中获取单核细胞以后，将单核细胞在单核细胞孵育液中孵育30-60分钟，可以有效的降低后续分离步骤对细胞的损伤，从而保证最终获取的造血干细胞和间充质干细胞有最佳生物活性。本发明还提出使用含有Notch-1的培养基适合培养按照本发明获取的造血干细胞，而使用含有Rock抑制剂的间充质干细胞培养基对按照本发明获取的间充质干细胞进行扩增培养可取得最好培养效果。造血细胞在一些与免疫相关联的疾病比如艾滋病，肿瘤和自身免疫性疾病中有着重要的功能。而间充质干细胞可以用于治疗心梗、脑梗、老年痴呆、糖尿病并发症等常规方法难以治愈的疾病。间充质干细胞可以调节造血功能，调整机体的免疫机能，在对免疫性贫血等疾病的治疗方面有相辅相成的作用。然而，目前从一种血液样品中分离出两种干细胞的方法尚鲜有报道。

本发明使用了单核细胞孵育液孵育、造血干细胞表面抗原标记并进行分离、包含Notch-1成分确定的培养基对造血干细胞扩增、添加了ROCK抑制剂的间充质干细胞培养基对间充质干细胞进行扩增培养等步骤，从一份血液样品中同时获得高活性、能扩增的造血干细胞和间充质干细胞。本发明所述的从一份血液样品中分离、分化和扩增造血干细胞和间充质干细胞的主要步骤如下：

在无菌条件下获取血液样品，25-200ml，肝素抗凝。干细胞的分离纯化过程在获取样品后24小时内进行。

首先，使用同体积IMDM培养基稀释抗凝过的血液，与5g/L的甲基纤维素按4:1混合，静置30分钟，沉降红细胞。吸取上清，离心后，用PBS缓冲液制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2500rpm 离心20min，取界面层，加PBS缓冲液制成单核细胞悬液，离心洗涤。使用单核细胞孵育液孵育。单核细胞孵育液是指包含了谷氨酰胺，抗坏血酸，维生素E，胰岛素的高糖DMEM。

使用磁珠或流式细胞仪分离并回收造血干细胞和间充质干细胞。造血干细胞在以IMDM为基础的培养基中培养，该培养基中还含有血小板生成素(Thrombopoietin TPO)、Notch-1、Flk-2/Flt3 ligand (FL)和牛血清白蛋白（BSA）等添加成分。细胞在悬浮状态下生长，每7天加一倍的新鲜培养基，维持细胞密度在10⁶/ml以下。间充质干细胞则在间充质干细胞培养液中培养，该培养液由α-MEM，Rho相关蛋白激酶抑制剂，Pen-Strep，b-FGF，EGF，TGF-β组成，其中，α-MEM为α-最小必需极限培养基；Pen-Strep为青霉素-链霉素，b-FGF为b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，TGF-β为转化生长因子。

概括而言，为达到本发明所述目的，本发明首先分离血液样品中的单核细胞，孵育富集的单核细胞，分别收集单核细胞群中的间充质干细胞和造血干细胞，并分别使用特殊配置的培养基进行扩增培养。

实施例1：从一份脐带血中分离并培养造血干细胞和间充质干细胞

将在无菌条件下采集的脐带血以体积比1:1与细胞在α-MEM混合稀释，与5g/L的甲基纤维素按4:1混合，静置30分钟，沉降红细胞。吸取上清，离心后，用PBS缓冲液制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上，2500rpm 离心20min，取界面层，加PBS缓冲液制成单细胞悬液，离心洗涤。

因为淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque的比重为1.077g/ml，其比单核细胞重但比红细胞轻，因此可以将单核细胞与残留的红细胞分离。收集界面层即可收集到比较纯的单核细胞。

将获取的单核细胞用PBS缓冲液稀释，2000rpm，离心10min，去掉上清液，并加入新的PBS缓冲液打散，稀释。以同样的条件再洗涤一次，可见沉积于离心管底部的细胞。

在离心管中加入包含了谷氨酰胺，抗坏血酸，维生素E，胰岛素的高糖DMEM孵育液孵育60分钟，

使用CD34标记细胞并使用磁珠分离系统分离并富集CD34+细胞组分和CD34-细胞组分。

细胞清洗后，CD34+/CD4-细胞组分即造血干细胞细胞组分接种于普通24孔细胞培养板，培养条件为IMDM培养基, 20ng/ml 血小板生成素 (TPO), 50ng/ml Notch-1, 以及50 ng/ml Flk-2/Flt3 ligand (FL)并添加1%牛血清白蛋白。每7天添加一倍新鲜培养基。造血干细胞的生长方式如图1所示。CD34-细胞组分即间充质干细胞组分接种于普通6孔板，培养条件为α-MEM， Rho相关蛋白激酶抑制剂, 1% Pen-Strep，50ng/ml b-FGF, 10ng/ml EGF, 10ng/ml TGF-β并添加10%FBS。间充质干细胞的生长状态如图2所示。

本发明不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的要旨、构思和宗旨的情况下，可以对本发明所述混合物和方法或方法中各步骤的前后次序进行改动、添加和替换。此外，本发明提及的分离方法，包括但不限于磁珠以及流式细胞仪等分离方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。

Claims

1.一种自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法，其特征是，该方法包括以下步骤：

步骤a：收集血液样品，

步骤b：分离血液样品中单核细胞成分，

步骤c：单核细胞在单核细胞孵育液中孵育30-60分钟，

步骤d：利用抗体富集分离单核细胞成分中的造血干细胞，并回收该抗体表达阴性的细胞组分，

2.根据权利要求1所述的自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法，其特征是，所述血液样品是指人的血液样品。

3.根据权利要求1所述的自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法，其特征是，所述血液样品是指新鲜采集或存贮的脐带血、周边血或骨髓。

4.根据权利要求1所述的自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法，其特征是，所述步骤c中，单核细胞孵育液是指包含了谷氨酰胺，抗坏血酸，维生素E，胰岛素的高糖DMEM。

5.根据权利要求1所述的自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法，其特征是，所述步骤d中，所述抗体为造血干细胞表面特征性抗原的抗体或抗体组合。

6.根据权利要求1或5所述的自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法，其特征是，所述步骤d中，所述抗体为CD133或者CD34。

7.根据权利要求1所述的自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法，其特征是，所述步骤e中，包含Notch-1的化学成分确定的造血干细胞扩增培养基指IMDM培养基；添加成分为血小板生成素，10-50ng/ml Noth-1,和10-50ng/ml Flk-2/Flt3 ligand，和 1% 牛血清白蛋白。

8.根据权利要求1所述的自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法，其特征是，所述步骤e中，添加了ROCK抑制剂的间充质干细胞培养基指：α-MEM，Rho相关蛋白激酶抑制剂，1% Pen-Strep，50ng/ml b-FGF，10ng/ml EGF，10ng/ml TGF-β；其中，α-MEM为α-最小必需极限培养基；Pen-Strep为青霉素-链霉素，b-FGF为 b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，TGF-β为转化生长因子。