CN108456657B - 犬脐带间充质干细胞及其制备方法和冻存方法 - Google Patents

犬脐带间充质干细胞及其制备方法和冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及犬脐带间充质干细胞及其制备方法和冻存方法。具体的，所述方法包括以下步骤：消毒和清洗、消化处理、细胞培养、细胞传代、细胞冻存。本发明从犬脐带制备间充质干细胞的方法呈现优异的技术效果。所制得的间充质干细胞能够有益的治疗犬科动物的关节炎、骨折、肌肉损伤、韧带损伤、软骨损伤、关节损伤、认知功能障碍、免疫介导性疾病、干眼症、复发性葡萄膜炎、肝脏疾病、心脏病、肾脏疾病、糖尿病、胃肠道疾病、甲状腺疾病、皮肤病。

Description

犬脐带间充质干细胞及其制备方法和冻存方法
技术领域
本发明属于犬科动物疾病的干细胞治疗技术领域，涉及从犬的脐带中制备间充质干细胞的方法，以及这种间充质干细胞在治疗犬科动物疾病中的用途。本发明从犬脐带制备间充质干细胞的方法呈现优异的技术效果。所制得的间充质干细胞能够有益的治疗犬科动物的关节炎、骨折、肌肉损伤、韧带损伤、软骨损伤、关节损伤、认知功能障碍、免疫介导性疾病、干眼症、复发性葡萄膜炎、肝脏疾病、心脏病、肾脏疾病、糖尿病、胃肠道疾病、甲状腺疾病、皮肤病。进一步的，本发明还涉及对所述从犬的脐带制备的间充质干细胞进行冻存的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs或MSC)是存在于机体间质组织中的成体干细胞，可以从胎盘、脐带、骨髓、脂肪组织等多种来源获取。MSC具有很强的自我增殖能力和多向分化潜能。在可控条件下，它能在体内或体外分化成如神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和成骨细胞等多种类型的细胞。同时MSC还具有免疫兼容性，不会造成免疫排斥反应，可进行同种异体移植。另外MSC还不具有致瘤性，但可支持造血，并能分泌多种有益细胞因子和免疫因子，因此可安全地用于组织再生和修复治疗，在传统医疗手段束手无策的疑难杂症方面显示出了巨大的治疗潜能。在兽医领域，干细胞疗法能有效地提高动物的生活质量，帮助它们摆脱病痛的困扰。其中犬不仅是重要的伴侣动物，也可经训练成为搜救犬、导盲犬等工作犬，另外它也是新药评估以及临床前药物试验的重要动物模型。目前，在犬干细胞治疗方面，已经有诸多通过间充质干细胞注射成功治疗犬关节炎，骨折、肌肉、韧带或软骨/关节损伤的案例。其它诸如犬类认知功能障碍、免疫介导性疾病、干眼症、复发性葡萄膜炎、各类肝脏疾病、心脏病、肾脏疾病、糖尿病、胃肠道疾病、甲状腺问题、皮肤病等方面的治疗也正在评估中。
巨大的应用前景迫切需要建立高效的犬科动物间充质干细胞分离制备方法，以规模化地分离出高质量MSC。目前犬上常用的MSC来源为脂肪和骨髓，但从这两种来源获取干细胞的过程不可避免地会给供体动物带来创伤和痛苦，而尽管胎盘/脐带属于动物生产时的废弃物，但它们也是MSC丰富的来源之一，因此通过它们作为样本分离细胞可以更好地保护动物。
目前从犬的器官/组织，特别是从犬的脐带，分离制备间充质干细胞的方法有限，且有其局限性。尽管从人类相关组织、器官中分离干细胞已有众多方法报道，例如本申请人研发团队的中国发明专利公开号CN102660501 A(中国专利申请号201210159918.1)公开了一种分离和扩增脐带新鲜组织间充质干细胞的方法，然而，可能是由于物种差异的原因，本发明的发明人已经发现，上述专利文献的方法并不适合直接用于犬科动物。
因此，本领域迫切期待有新的方法来从犬的脐带分离制备间充质干细胞的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种从犬的脐带制备间充质干细胞的方法，已经出人意料地发现，使用本发明方法从犬的脐带制备间充质干细胞，呈现令人鼓舞的效果，本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了从犬的脐带制备间充质干细胞的方法和/或冻存方法，该方法包括以下步骤：
(1)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精，例如75％乙醇作为消毒液)对犬的脐带组织(例如，新鲜离体组织)表面进行消毒，将脐带剪开，平铺(例如，平铺于直径为5-20cm的培养平皿内，例如10cm的培养平皿)，通过缓冲液(例如PBS缓冲液，例如pH6.5的0.025M磷酸二氢钠缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上的红细胞；(本步骤通常是在生物安全柜内进行处理)
(2)消化处理：将步骤(1)得到的脐带组织(在另一个细胞培养平皿内)剪成组织块(例如，组织块的大小约为0.05-0.5立方厘米，优选约为0.05-0.2立方厘米，优选约0.1立方厘米的立方形块状)，将组织块放入消化酶溶液(例如其包含I型胶原酶、DMEM-F12，例如照如下方法配制：将0.1g的I型胶原酶加入100ml的DMEM-F12，然后用0.45μm过滤器过滤得到消化液)中，消化处理0.5-3小时(例如，37℃消化处理1-2小时，例如1.5小时)，过滤清除组织块(例如，是通过滤网进行的，所述滤网为50-150μm滤网，优选约100μm滤网)后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；(如未另外说明，本发明所用的间充质干细胞培养基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin和84重量份的DMEM-F12)
(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器(例如，以密度0.2-2×104/cm2加入培养容器中，优选以密度约1×104/cm2加入)，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天(例如2天)进行一次全换液；
(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40％-70％(例如60％)以后，利用消化酶(例如，在本发明中，如未特别说明，使用TrypLETM Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90％(例如80％)后，即得P1代脐带间充质干细胞；接着照上述培养方法进行必要的传代(例如，本发明所用的TrypLETMExpress，其组成为：氯化钾200.0mg/L、磷酸二氢钾200.0mg/L、氯化钠8000.0mg/L、七水磷酸氢二钠2160.0mg/L、EDTA 457.6mg/L、商品化量的rProtease；该TrypLETM Express可以商业途径购自赛默飞世尔公司，其相关技术信息例如参见http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.346.html)；任选的(5)冻存：将步骤(4)所得脐带间充质干细胞中添加细胞冻存液(例如以体积比1:1的量加入)于液氮中冷冻，备用。(例如，所述细胞冻存液包含DMEM-F12、二甲基亚砜和人血白蛋白。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白。
根据本发明第一方面的方法，步骤(1)中所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5.0-8.0，优选pH为5.5-76，优选pH为6.0-7.0。在一个实施方案中，所述PBS缓冲液中磷酸根的浓度为0.01-0.5M，优选0.02-0.1M。在本发明下文试验中，如未特别说明，所用PBS缓冲液是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH为6.5。需要说明的是，本发明人发现，在上述范围内的PBS缓冲液浓度和pH值对于本发明方法的效果影响不大。
根据本发明第一方面的方法，步骤(2)中所述消化酶溶液是将I型胶原酶加入DMEM-F12，通过过滤器过滤得到的，其消化酶为0.05g-0.5g，优选消化酶为0.08g-0.2g，优选消化酶为0.1g，其DMEM-F12为50-500ml，优选DMEM-F12为80-200ml，优选DMEM-F12为100ml，其过滤器为0.45μm过滤器。在一个实施方案中，所述消化酶溶液是将0.1g的I型胶原酶加入到100ml的DMEM-F12中，混匀，过滤(例如用0.45um过滤器过滤)得到的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，组织块的大小约为0.05-0.5立方厘米，优选约为0.05-0.2立方厘米，优选约0.1立方厘米的立方形块状。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，组织块大小在0.05-0.5立方厘米，优选0.05-0.2立方厘米，特别是大小约0.1立方厘米时是非常优选的。尽管预期组织碎块小有利于本发明方法的实现，然而本发明人在试验中发现在0.05立方厘米、0.1立方厘米、0.5立方厘米三种状态下，它们对消化酶的消化处理效果基本一致，而体积大于1立方厘米以后对消化酶的消化效果有显著不利影响，该不利影响可以通过延长消化时间在一定程度上弱化。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为0.5-3小时，优选1-2.5小时，优选1.5-2小时。本发明人发现在1-2.5小时的消化处理时间内，对组织块的消化处理效果是最佳的，既可保证组织块得到充分的消化处理，也能避免细胞被破坏。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，消化处理是在人体体温附近的温度范围内进行的，优选34-40℃，优选36-38℃，优选37℃。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，消化处理是在恒温摇床里进行的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，过滤清除组织块是通过滤网进行的，所述滤网为50-150μm滤网，优选约100μm滤网。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，终止消化的间充质干细胞培养基是按照2:1～1:2的比例加入，优选1:1的比例，所述比例为体积比。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，细胞清洗的具体步骤是离心5-15分钟，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，再离心5-15分钟，去除上清液，加入间充质干细胞培养基，抽取小量样本进行细胞计数。离心转速为800-2000rpm，优选1250rpm，离心时间为优选10分钟。
根据本发明第一方面的方法，其中所述间充质干细胞培养基中包含FBS、L-Glutamine(L-谷氨酸)、Gentamicin(庆大霉素)和DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有10-20％的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约15％的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有0.5-2％的L-Glutamine。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约1％的L-Glutamine。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约0.01-0.1％的Gentamicin。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约0.05％的Gentamicin。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有80-90％的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约84％的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约15重量份的FBS、约1重量份的L-Glutamine、约0.05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12。
根据本发明第一方面的方法，其中所述间充质干细胞培养基还增补有甘氨酸。例如，所述间充质干细胞培养基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin、84重量份的DMEM-F12、0.025％w/v甘氨酸。
根据本发明第一方面的方法，其中所述TrypLETM Express消化酶中还额外添加了1,2-丙二醇。例如，所述TrypLETM Express消化酶中还额外添加了0.05％w/v的1,2-丙二醇。已经出人意料的发现，间充质干细胞培养基中增补甘氨酸并且消化酶中增补丙二醇有助于提高间充质干细胞的收率。
根据本发明第一方面的方法，其中所述冻存液中还添加右旋糖苷-40，在一个实施方案中，所述冻存液中还包括0.2～0.5％w/v右旋糖苷-40，优选还包含0.25％w/v右旋糖苷-40。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白、0.2～0.5％w/v特别是0.25％w/v右旋糖苷-40。已经出人意料的发现，在冻存液中添加微量的右旋糖苷-40有助于提高冻存细胞复活时的存活率。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)所述培养箱中CO2浓度为3-7％，优选浓度为5％，培养箱温度控制在人体体温附近范围内，优选34-40℃，优选36-38℃，优选37℃。此种CO2浓度和温度通常亦是本领域常用的培养条件。
此外，在本发明的第一方面，提供了从犬脐带新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法。因此，本发明第二方面提供了一种犬脐带间充质干细胞。
根据本发明第二方面的犬脐带间充质干细胞，其是根据本发明第一方面任一实施方案所述方法获得的。
根据本发明第二方面的犬脐带间充质干细胞，其细胞纯度大于85％，例如大于90％。在一个实施方案中，所述脐带间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于85％，例如大于90％。
进一步的，本发明第三方面涉及本发明制得的犬脐带间充质干细胞在制备用于治疗和/或预防选自下列犬科动物疾病的制剂中的用途：关节炎、骨折、肌肉损伤、韧带损伤、软骨损伤、关节损伤、认知功能障碍、免疫介导性疾病、干眼症、复发性葡萄膜炎、肝脏疾病、心脏病、肾脏疾病、糖尿病、胃肠道疾病、甲状腺疾病、皮肤病。
下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。
在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。
在本发明中，术语“脐带间充质干细胞”是指来源于脐带的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“脐带间充质干细胞”可以与“脐带干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。
在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围。
在本发明中，术语“脐带”是指犬的脐带，特别是指产后4小时之内的脐带。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如哺乳动物例如人类或犬的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymalstem cells.J Orthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,etal.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。
本发明公开了一种从脐带中大量分离间充质干细胞的方法，并可利用这种方法保存脐带间充质干细胞并建立脐带干细胞库。本发明的发明人在总结以往分离培养间充质干细胞的基础上，利用组织消化酶消化脐带组织块，结合贴壁培养法，成功自脐带中分离得到大量间充质干细胞。本发明方法得到的间充质干细胞纯度高、数量多，具有与骨髓间充质干细胞相同的生物学特性，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞等分化。由于脐带中干细胞较成体干细胞幼稚，含量丰富，在临床上具有广泛的应用前景，我们运用常规的细胞冻存方法将间充质干细胞像脐血一样冻存起来，建立脐带干细胞库，为以后干细胞的深入研究和临床治疗奠定基础。
由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们把犬的脐带造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样脐带间充质干细胞作为一种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立脐带干细胞库，为日后的干细胞或应用治疗保存种子。
根据本发明的方法，其中间充质干细胞培养基配方能成功并有效的对脐带间充质干细胞进行体外扩增。根据本发明的方法，其中换液和组织清除时间的设定缩短了贴壁细胞达到指定融合率的时间。根据本发明的方法,消化酶的配方和脐带组织的消化时间和方法能成功并有效地把组织里的全细胞分离出来。
本发明操作简单，方便实用，能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。本发明成功自犬的脐带中分离获得大量纯度较高的间充质干细胞，并运用此法可以建立犬的脐带干细胞库来储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于脐带与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的犬科动物应用上将具有广泛的前景。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
实施例1、从犬的脐带制备间充质干细胞
(1)消毒和清洗：在生物安全柜内，用消毒液(75％乙醇)对犬的脐带组织(新鲜离体脐带组织)表面进行消毒，将脐带剪开，平铺(平铺于直径为10cm的培养平皿)，通过缓冲液(pH6.5的0.025M磷酸二氢钠缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上的红细胞；
(2)消化处理：在另一个细胞培养平皿内将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块(约0.1立方厘米的立方形块状)，将组织块放入消化酶溶液(配制方法：将0.1g的I型胶原酶加入100ml的DMEM-F12，然后用0.45μm过滤器过滤得到消化液)中，消化处理0.5-3小时(本例中，37℃消化处理1.5小时)，过滤清除组织块(本例，通过100μm滤网进行)后，加入间充质干细胞培养基(以体积比1:1的比例添加；本例中，间充质干细胞培养基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin和84重量份的DMEM-F12)以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗(本例中，1250rpm离心10分钟去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞后再1250rpm离心10分钟去除上清液，加入间充质干细胞培养基(抽取小量样本进行细胞计数))，最终获得细胞悬液；
(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器(本例中，以密度约1×104/cm2加入)，再将培养容器放进培养箱(CO2浓度为5％，温度37℃)中进行培养，培养至第2-7天(本例，一般培养至第4天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(本例，第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天(本例，2天)进行一次全换液；
(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40％-70％(本例，60％)以后，利用消化酶(本例，使用TrypLETM Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天(本例，每2天)换液一次，直至融合率达到70-90％(本例达80％)后，即得P1代脐带间充质干细胞；接着照上述培养方法进行必要的传代(本例中，传代至P15代，其中经3代传代后细胞纯度大于95％；本例，所用商品化产品TrypLETM Express其组成为：氯化钾200.0mg/L、磷酸二氢钾200.0mg/L、氯化钠8000.0mg/L、七水磷酸氢二钠2160.0mg/L、EDTA457.6mg/L、商品化量的rProtease；该TrypLETM Express可以通过商业途径购自赛默飞世尔公司，其相关技术信息参见http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.346.html)；
(5)冻存：将步骤(4)所得脐带间充质干细胞中添加细胞冻存液(1:1)，于液氮中冷冻，备用(本例，所用细胞冻存液包含65份DMEM-F12、10份二甲基亚砜、15份人血白蛋白)。在冻存前，将间充质干细胞的详细信息(包括犬龄、犬种、遗传信息、预防接种信息、病毒检测信息等)输入电脑数据库，建立数据档案备查。
实施例2、从犬的脐带制备间充质干细胞
(1)消毒和清洗：在生物安全柜内，用消毒液(75％乙醇)对犬的脐带组织(新鲜离体脐带组织)表面进行消毒，将脐带剪开，平铺(平铺于直径为10cm的培养平皿)，通过缓冲液(pH6.5的0.025M磷酸二氢钠缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上的红细胞；
(2)消化处理：在另一个细胞培养平皿内将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块(约0.1立方厘米的立方形块状)，将组织块放入消化酶溶液(配制方法：将0.1g的I型胶原酶加入100ml的DMEM-F12，然后用0.45μm过滤器过滤得到消化液)中，消化处理0.5-3小时(本例中，37℃消化处理1.5小时)，过滤清除组织块(本例，通过100μm滤网进行)后，加入间充质干细胞培养基(以体积比1:1的比例添加；本例中，间充质干细胞培养基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin、84重量份的DMEM-F12、0.025％w/v甘氨酸)以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗(本例中，1250rpm离心10分钟去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞后再1250rpm离心10分钟去除上清液，加入间充质干细胞培养基(抽取小量样本进行细胞计数))，最终获得细胞悬液；
(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器(本例中，以密度约1×104/cm2加入)，再将培养容器放进培养箱(CO2浓度为5％，温度37℃)中进行培养，培养至第2-7天(本例，一般培养至第4天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(本例，第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天(本例，2天)进行一次全换液；
(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40％-70％(本例，60％)以后，利用消化酶(本例，使用TrypLETM Express，该消化酶中还额外添加了0.05％w/v的1,2-丙二醇)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天(本例，每2天)换液一次，直至融合率达到70-90％(本例达80％)后，即得P1代脐带间充质干细胞；接着照上述培养方法进行必要的传代(本例中，传代至P15代，其中经3代传代后细胞纯度大于95％；本例，所用TrypLETM Express其组成为：氯化钾200.0mg/L、磷酸二氢钾200.0mg/L、氯化钠8000.0mg/L、七水磷酸氢二钠2160.0mg/L、EDTA 457.6mg/L、商品化量的rProtease；该TrypLETM Express可以通过商业途径购自赛默飞世尔公司，其相关技术信息参见http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.346.html)；
(5)冻存：将步骤(4)所得脐带间充质干细胞中添加细胞冻存液(1:1)，于液氮中冷冻，备用(本例，所用细胞冻存液包含65份DMEM-F12、10份二甲基亚砜、15份人血白蛋白)。在冻存前，将间充质干细胞的详细信息(包括犬龄、犬种、遗传信息、预防接种信息、病毒检测信息等)输入电脑数据库，建立数据档案备查。
在本实施例2中，从步骤(1)至步骤(4)所得P1代犬脐带间充质干细胞，其每克脐带组织的平均收率在4～9×107细胞范围内(经5次试验的平均结果，下同)；在本实施例2中，如果间充质干细胞培养基中不增补甘氨酸，则P1代犬脐带间充质干细胞的每克脐带组织的平均收率在2～4×105细胞范围；在本实施例2中，如果消化酶TrypLETM Express中不增补1,2-丙二醇，则P1代犬脐带间充质干细胞的每克脐带组织的平均收率在3～5×105细胞范围；这表明，仅在间充质干细胞培养基中增补甘氨酸、同时在消化酶TrypLETM Express中增补1,2-丙二醇时，才可以显著提高犬脐带间充质干细胞的收率。类似的，在实施例1中，从步骤(1)至步骤(4)所得P1代犬脐带间充质干细胞，经5次试验，其每克脐带组织的平均收率在3～7×105细胞范围内(以本发明实施例1同样的方法对人脐带组织进行处理时，每克脐带组织的平均收率可达到3～6×107细胞范围，大两个数量级，这可能是由于种属差异造成的)。本发明人在补充试验中发现，参照CN 102660501A实施例1的方法制备犬的脐带间充质干细胞时，P1代干细胞每克脐带组织的平均收率在3～6×105细胞范围内；参照CN 106702499A实施例1至实施例5方法中各种方案组合时，P1代干细胞每克脐带组织的平均收率均小于5×105细胞。
使本发明所得犬脐带间充质干细胞用常规冻存液(配方为：65份DMEM-F12、10份二甲基亚砜、15份人血白蛋白)冻存30天，然后用常规方法进行复苏，测定冻存前的细胞数和复苏后的细胞数，以复苏后细胞数除以冻存前的胞数再乘以100％所得百分数作为存活百分数。实施例1所得P1至P15代的经冻存-复苏过程的存活百分数在67～75％范围，例如实施例1之P3代犬脐带间充质干细胞的的存活百分数为72％；实施例2所得P1至P15代的经冻存-复苏过程的存活百分数在65～76％范围，例如实施例2之P5代犬脐带间充质干细胞的存活百分数为68％。
在一个补充的实例中，在实施例1步骤(5)中改用改良细胞冻存液(其中包含：65份DMEM-F12、10份二甲基亚砜、15份人血白蛋白、0.25％w/v右旋糖苷-40)，结果显示P1至P15代细胞经冻存-复苏过程的存活百分数在92～96％范围，例如P3代犬脐带间充质干细胞的存活百分数为93％。在一个补充的实例中，在实施例2步骤(5)中改用改良细胞冻存液(其中包含：65份DMEM-F12、10份二甲基亚砜、15份人血白蛋白、0.25％w/v右旋糖苷-40)，结果显示P1至P15代细胞经冻存-复苏过程的存活百分数在91～97％范围，例如P5代犬脐带间充质干细胞的存活百分数为94％。出人意料的发现，当在冻存液中添加微量右旋糖苷时能够显著的提高细胞冻存-复苏过程中造成的细胞存活。
实施例3、脐带MSC的生物学特性鉴定
对实施例1和实施例2所得犬脐带间充质干细胞进行以下试验，两种干细胞的试验结果无差异。
1、细胞生长及其形态学特点
通过实施例1和实施例2的分离培养，所得犬脐带间充质干细胞培养48小时后在显微镜下可明显见到梭形贴壁细胞，8天左右会形成涡轮状细胞克隆，消化传代后会形成70％左右融合的贴壁层。培养过程中，发现这种细胞形态相对均一，增殖速度快，贴壁速度快，易被胰酶消化，传代至3-15代，其形态及生长特点亦无明显改变。
2、流式细胞术鉴定MSC表面标志
分别取第1、3、5、10、15代细胞，流式细胞术检测细胞表面标志，动态观察培养过程中细胞表面标志的变化。细胞表型检测结果表明，细胞表态间充质干细胞特有的标志CD44、CD90、CD105，不表达CD11、CD19、CD34。
3、脐带MSC生长曲线的绘制及对数生长期倍增时间的测定
取对数生长期细胞，消化计数，以10％FBS的LG-DMEM培养基制成细胞悬液(2×104/ml)，24孔板中每孔接种0.5ml，37℃，5％CO2，饱和湿度下培养。每天取3复孔，台盼蓝染色后计数活细胞数，计算平均值，连续观察7天。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。以Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间，即Td＝Tlg2/Lg(Nt/No)，Td：倍增时间(h)，T：细胞由No增至Nt所用的时间(h)，N：细胞数。
通过每天细胞计数的结果绘制细胞生长曲线，计算倍增时间。由细胞生长曲线可以看出，细胞在第3-5天处于指数生长期。根据公式计算出第5代细胞在指数生长期的倍增时间在22-36小时范围内。
4、脐带MSC多向分化潜能的鉴定
(1)成骨诱导：3代以上MSC，按5×104/孔接种六孔板，放于37℃、5％CO2、饱和湿度下，MSC培养基中培养24h后，换用含10％经筛选FBS的DMEM-HG并加入地塞米松0.1μM、抗坏血酸磷酸盐50μM、β-磷酸甘油5mM，放于37℃、5％CO2、在饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2-4周。碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成，Von Kossa染色鉴定骨结节形成。在含10％经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松0.1μM、抗坏血酸磷酸盐50μM、β-磷酸甘油5mM培养1周，细胞形态发生明显的改变，由纺锤形的成纤维细胞样变为多角形，类似于神经元细胞样，细胞周边出现长丝状突出，并可向周围延伸。继续培养2周以上后，细胞基质中出现钙化斑，矿化物逐渐出现，并且开始形成多层小结结构，至培养4周后，可见明显钙化结节。2周时碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，达到92％以上，而未加以诱导的对照组则大部分为阴性，只有不到5％显示为弱阳性，表明细胞已向成骨细胞转化。von Kossa染色可将骨结节中沉积的钙染成黑色，诱导组可见大量的黑色骨结节，有明显的立体结构，而对照组在任何时间都没有阳性反应。
(2)成脂肪诱导：3代以上MSC，按5×104/孔接种于六孔板，放于37℃、5％CO2、饱和湿度下，在MSC培养基中培养24h后，换用含10％经筛选FBS的高糖DMEM，并加入地塞米松0.5μM、消炎痛25μM、IBMX 0.5mM、胰岛素2μg/ml，放于37℃，5％CO2，饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2周，油红染色鉴定脂滴形成。在含10％经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松0.5μM、消炎痛50μM、IBMX 0.5mM、胰岛素5μg/ml培养3天，细胞即发生形态改变，由纺锤形的成纤维细胞样逐渐收缩变短，90％以上细胞成为立方形或多角形；连续培养7天，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着培养时间的延长，脂滴逐渐增大并融合，至培养2周时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞。油红O染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色。
通过以上一系列数据指标的检测，显示出应用本发明方法分离得到的犬间充质干细胞，具有向成骨细胞、脂肪细胞等分化的能力，证实本发明方法获得的犬间充质干细胞具有干细胞特性。
本方法操作简便、稳定，由此制备得到的脐带间充质干细胞活性高、可用于犬常规手段难治性疾病的治疗。

Claims (16)

1.从犬的脐带制备间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(1)消毒和清洗：用消毒液对犬的脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过pH6.5的0.025M磷酸二氢钠缓冲液清洗脐带组织，以减少脐带组织上的红细胞；
(2)消化处理：将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液中，消化处理0.5-3小时，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；
(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液以密度0.2-2×104/cm2加入培养容器中，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天时将培养容器从培养箱中取出，补加3ml间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天进行一次全换液；
(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%-70%以后，利用添加了0.05%w/v的1,2-丙二醇的消化酶TrypLE™ Express将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天换液一次，直至融合率达到70-90%后，即得P1代脐带间充质干细胞；接着照步骤(3)和步骤(4)的方法传代至P15代；
(5)冻存：将步骤(4)所得脐带间充质干细胞中添加细胞冻存液于液氮中冷冻，备用；
其中：
所述间充质干细胞培养基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin、84重量份的DMEM-F12、0.025%w/v甘氨酸。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，用75%乙醇作为消毒液对犬的新鲜离体脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺于直径为5-20cm的培养平皿内，通过pH6.5的0.025M磷酸二氢钠缓冲液清洗脐带组织，以减少脐带组织上的红细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，将步骤(2)得到的细胞悬液以密度1×104/cm2加入培养容器中，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第3-6天时将培养容器从培养箱中取出，补加3ml间充质干细胞培养基，继续培养；在第9天时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每2天进行一次全换液。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，当培养容器中的贴壁细胞融合率达到60%以后，利用消化酶将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每2天换液一次，直至融合率达到80%后，即得P1代脐带间充质干细胞；接着照步骤(3)和步骤(4)的方法传代至P15代。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中，将步骤(4)所得脐带间充质干细胞中添加细胞冻存液以体积比1:1的量加入于液氮中冷冻，备用。
6.根据权利要求1的方法，步骤(2)中所述消化酶溶液是将0.08g-0.2g的I型胶原酶加入80-200ml的DMEM-F12中，通过过滤器过滤得到的。
7.根据权利要求1的方法，步骤(2)中所述消化酶溶液是将0.1g的I型胶原酶加入到100ml的DMEM-F12中，混匀，用0.45um过滤器过滤得到的。
8.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为0.5-3小时。
9.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为1-2.5小时。
10.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为1.5-2小时。
11.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，终止消化的间充质干细胞培养基是按照体积比1：1的比例加入。
12.根据权利要求1的方法，所述细胞冻存液包含65份的DMEM-F12、10份的二甲基亚砜、15份的人血白蛋白。
13.根据权利要求12的方法，其中所述细胞冻存液中还添加0.25%w/v右旋糖苷-40。
14.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)所述培养箱中CO2浓度为3-7%。
15.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)所述培养箱中CO2浓度为5%。
16.根据权利要求1的方法，培养箱温度控制在36-38℃范围内。
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