CN114317436A - 一种重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法 - Google Patents

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周钢桥
吴丽颖
李建
何云凌
曹炎
陈迎
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Abstract

本发明公开了一种重新激活人γ‑珠蛋白基因表达的方法。所述方法为提供人造血干/祖细胞培养的低氧环境或者模拟低氧环境的药物。本发明通过将人造血干/祖细胞培养于低氧条件下以重新激活γ‑珠蛋白基因(HBG)表达，促进红系细胞胎儿型血红蛋白(HbF)的生成。本发明中所述方法可应用于体外诱导红系分化、制备高表达HbF的成熟红细胞，为血红蛋白病患者提供一个潜在的优质血液替代来源。

Description

一种重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法
技术领域
本发明属于基因表达技术领域，具体涉及一种重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法。
背景技术
血红蛋白病(如β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血病)是一种全球分布广泛、影响人数众多(全球约有1.5亿人携带血红蛋白病基因)且严重危害生命健康的常见遗传病。血红蛋白病尚无根治方法，目前采用的治疗方法是定期输血及异基因造血干细胞移植。但输血治疗费用高，且血制品供需不平衡、血液相容性差及病原微生物污染等问题增加了输血治疗的难度；而异基因造血干细胞移植仅适用于部分配型成功的患者，且还面临着植入失败、感染和移植物抗宿主病等风险。已有研究明确表明，提高HbF的表达水平能够显著缓解血红蛋白病患者的症状。随着基因编辑技术的出现，血红蛋白病的基因治疗成为科学家不断探索的目标，作为血红蛋白病的基因治疗方法(控制外源性珠蛋白基因在宿主细胞内正确有效的表达、靶向基因位点解除HBG转录抑制以促进HbF的表达)，虽然能够在一定程度上缓解患者的症状，但该方法面临易脱靶、安全性及有效性等问题，其广泛应用受限。因而，在上述两种治疗方式之外找到更安全、经济、有效的替代手段将会极大改善血红蛋白病等血液病患者的治疗困境。
近年来，干细胞技术的发展使得体外诱导包括人脐带血、骨髓和外周血等来源的造血干/祖细胞分化为红细胞的方法逐渐被建立起来。脐带血等来源的造血干/祖细胞具有极强的自我更新和多向分化潜能，能在特定培养条件下遵循体内红系细胞发育规律，经历造血祖细胞-红系祖细胞-红系前体细胞(原红细胞至晚红细胞)等多个发育阶段，逐级定向分化形成红细胞，这使得体外大量制备红细胞，以此提供一个潜在的优质血液替代来源用于临床治疗成为可能。造血干/祖细胞自我更新、增殖和多向分化潜能的维持需要一定的微环境，在干细胞研究领域称之为干细胞微环境或者“stem cell niche”，包括支持干细胞的细胞组分和非细胞组分。对于HSPCs来说，低氧也是其所处的一种微环境。发明人研究发现，低氧微环境对造血干/祖细胞的自我更新及多向分化潜能等具有重要调控作用，这为在体外模拟造血干/祖细胞生存的低氧微环境，优化在体外诱导造血干/祖细胞红系分化提供了理论依据和技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可重新激活人γ-珠蛋白基因(HBG)表达的方法。
一种重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法，所述方法为提供人造血干/祖细胞培养的低氧环境或者模拟低氧环境的药物。
所述低氧方法能激活HBG表达，促进胎儿型血红蛋白HbF生成，低氧所诱导的红细胞制品能够用于治疗或改善血红蛋白病相关血液病所引发的贫血症状。
所述血液病主要包括：β-地中海贫血、镰刀型细胞贫血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、紫癜及溶血症等。
所述低氧环境为氧含量3±2％。
所述模拟低氧环境的药物为FG-4592、COCl2、去铁胺中的一种或几种。
所述模拟低氧环境的药物还含有一种或多种药学上可接受的辅料或载体。
所述辅料或载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或几种。
所述模拟低氧环境的药物制成的剂型选自片剂、胶囊剂、泡腾片、颗粒剂、散剂、分散片、口服液、丸剂或注射剂。
所述造血干/祖细胞来源于脐带血、骨髓或外周血。
本发明所提供低氧条件或化学药物，可以仅以低氧作为一种干预条件，也可以低氧与模拟低氧的化学药物组合使用，还可以将两种或多种其他化学药物联用来促进体外红系分化。
本发明的有益效果：本发明通过将人造血干/祖细胞培养于低氧条件下以重新激活γ-珠蛋白基因(HBG)表达，促进红系细胞胎儿型血红蛋白(HbF)的生成。本发明中所述方法可应用于体外诱导红系分化、制备高表达HbF的成熟红细胞，为血红蛋白病患者提供一个潜在的优质血液替代来源。
附图说明
图1采用qPCR方法检测所诱导红系细胞的HBG转录水平及比例。
图2是采用流式细胞术方法检测所诱导红系细胞的HbF+细胞比例。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher公司，产品型号：3131，序列号：300158130；对比例中所用的二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher公司，产品型号：3111，序列号：300205034。
下述实施例中所用的扩增培养基(EM)包含：StemSpan SFEM培养基(货号：09650)及50ng/ml rhSCF(货号：300-07)，100ng/ml rhTPO(货号：300-18)，100ng/ml rhFlt3-Ligand(货号：300-19)，50ng/ml rhIL-3(货号：200-03)和100ng/ml rhIL-6(货号：200-06)。StemSpan SFEM培养基购自加拿大STEMCELL Technologies公司，上述细胞因子均购自美国PeproTech公司。
下述实施例中所用的红系分化培养基(EDM)包含：IMDM培养基(货号：16529)及3U/ml rhEPO(PeproTech,100-64)，2mM L-Glutamine(货号：G7513)，330μg/ml human holo-Transferrin(货号：T4132)，10μg/ml human insulin(货号：I9278)，2U/ml heparin(货号：07980)，5％inactivated human serum(货号：H3667)，100ng/ml rhSCF，5ng/ml rhIL-3and1μM dexamethasone(货号：D4902)。IMDM培养基、L-Glutamine、human holo-Transferrin、human insulin，human serum和dexamethasone购自美国Sigma Aldrich公司，rhEPO购自美国PeproTech公司，heparin购自加拿大STEMCELL Technologies公司。
实施例1：重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法
1.低氧浓度
(1)将实施例中所用二氧化碳培养箱O2浓度设置为3％；
(2)造血干/祖细胞的处理：造血干/祖细胞复苏后在常氧条件下扩增7天，随后分别在常氧条件和低氧条件下向红系细胞诱导分化7天；
(3)对照组(对比例)：对照组所用二氧化碳培养箱默认设置氧浓度(即为大气氧浓度，约20％)。
2.造血干/祖细胞的培养
(1)复苏冻存在-80℃的人脐带血来源的造血干/祖细胞(HSPCs)，将细胞分种在培养孔中，加入适量预热的扩增培养基(EM)，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养7天；第2天换新鲜培养液，之后隔天换液。
(2)在复苏后第8天，将扩增后的HSPCs接种在新的培养皿中，加入红系分化培养基(EDM)后分别于常氧(normoxia，20％O2，对比例)和低氧(hypoxia，3％O2，实施例)条件下继续培养7天，接种密度为3×105个细胞/ml，每3天更换一次培养基。
(3)诱导分化7天后，按照常规方法收取细胞，通过qPCR和流式细胞术分别检测HBG和HbF的表达情况。
实施例2：qPCR实验
按照常规方法在不同时间点收集并裂解所获取细胞，提取RNA后进行qPCR分析，检测红系标志分子γ-globin(胎儿型血红蛋白)及β-globin(成人型血红蛋白)的mRNA，即HBG和HBB的表达变化。ACTB作为内参。
实验所用引物序列如表1所示：
表1
Figure BDA0003447577430000051
如图1所示，经诱导分化后，与常氧对照组相比，低氧显著促进了HBG在mRNA水平上的表达(图1左)。同时，HBG表达比例也明显增加(图1右)。
实施例3：流式细胞术
按照常规方法在诱导分化后收集细胞，经固定、破膜后，在APC-anti-HbF抗体中孵育30min(常温、摇床、避光)后上机检测HbF表达情况。APC-anti-HbF抗体(货号：MHFH05)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
结果显示，低氧实验组的HbF+细胞比例明显高于常氧组(图2)，低氧能够显著激活HBG的表达，促进胎儿型血红蛋白(HbF)的生成。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法，其特征在于，所述方法为提供人造血干/祖细胞培养的低氧环境或者模拟低氧环境的药物。
2.根据权利要求1所述重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法，其特征在于，所述低氧方法能激活HBG表达，促进胎儿型血红蛋白HbF生成，低氧所诱导的红细胞制品能够用于治疗或改善血红蛋白病等血液病所引发的贫血症状。
3.根据权利要求1所述重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法，其特征在于，所述低氧环境为氧含量3±2％。
4.根据权利要求1所述重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法，其特征在于，所述模拟低氧环境的药物为FG-4592、COCl2、去铁胺中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法，其特征在于，所述模拟低氧环境的药物还含有一种或多种药学上可接受的辅料或载体。
6.根据权利要求1所述重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法，其特征在于，所述辅料或载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法，其特征在于，所述模拟低氧环境的药物制成的剂型选自片剂、胶囊剂、泡腾片、颗粒剂、散剂、分散片、口服液、丸剂或注射剂。
8.根据权利要求1所述重新激活人γ-珠蛋白基因表达的方法，其特征在于，所述造血干/祖细胞来源于脐带血、骨髓或外周血。
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