CN108624550A - 一种cho细胞无血清培养基的添加物及制得的培养基 - Google Patents

一种cho细胞无血清培养基的添加物及制得的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种CHO细胞无血清培养基的添加物，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种或几种的混合物；本发明还公开一种由所述的CHO细胞无血清培养基的添加物制得的无血清培养基。本发明对无血清培养基中的重要添加物维生素进行研究，调控细胞生长代谢和产物表达，并针对不同细胞系及不同产品，调整培养基中营养成分及各个营养成分含量，从而提高细胞的存活率以及增殖等生理活动，调节细胞生长状态，进而提高产品产量，节约成本，获得较大经济效益。

Description

一种CHO细胞无血清培养基的添加物及制得的培养基
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种CHO细胞无血清培养基的添加物及其制得的培养基。
背景技术
CHO细胞，即中国仓鼠卵巢细胞( Chinese hamster ovary) ，具有不死性，可以传代百代以上，目前在生物工程上被广泛作为外源基因的宿主，生产蛋白药物如抗体，蛋白类药等。蛋白类药物t-PA在心梗等疾病的治疗方面具有重要的价值，其发酵方式正是利用CHO细胞通过无血清培养基培养获得。t-PA临床效果显著，随着市场需求不断增加，其潜在价值也日益增长。但是由于 t-PA 临床使用剂量较大和重组CHO细胞表达该蛋白能力低的矛盾限制了其的运用，因此如何通过动物细胞培养技术提高 t-PA 产量一直是业界关注的热点。
目前，体外培养重组 CHO 细胞过程中仍然需要在培养基中加入血清，用于提供细胞生长所需的部分营养物质、激素以及生长因子。但由于其价格昂贵、极易感染病毒或支原体，最重要的是其成分复杂，不利于细胞产品分离与纯化，故在其灌流培养过程中使用无血清培养基。无血清培养基成分复杂，其配方显示，除了葡萄糖、氨基酸等主要营养物质，其中还有维生素、无机盐、微量元素及血清替代物。无血清培养基作为继天然培养基、合成培养基之后的第三大培养基，该培养基优点有如下优点。第一，其中虽然不含动物血清，但能够保证细胞在的增殖。分化。第二，其组成成分清楚、制备过程简单，并且受到广泛生物学领域科研工作者的认可。最重要的是无血清培养基在目前研究中已有明确报道表明，在细胞生成、增殖、分化及基因表达调控，蛋白翻译与修饰基过程中有着重要作用。尽管如此，通过长期试验，有报道发现普通的无血清培养基能支持细胞长期传代，但未必能支持较高的细胞密度和产物表达，因此，为获得支持重组 CHO 细胞高密度培养和高效表达t-PA的无血清培养就必须对其中的关键成分进行优化。因此通过无血清培养基的优化设计成为解决t-PA表达量较低，成本大的主要手段之一。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种CHO细胞无血清培养基的添加物及制得的培养基。通过对培养基添加物的成分改进，有效支持重组 CHO 细胞高密度培养和高效表达t-PA，从而解决t-PA表达量低，成本大的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种CHO细胞无血清培养基的添加物，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种或几种的混合物；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
优选地，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
优选地，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H中的任意一种或几种的混合物；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l。
进一步优选地，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H中的任意一种；其中维生素B1的浓度为4ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l，维生素C的浓度为20ug/l，维生素H的浓度为15ug/l。
优选地，所述添加物为盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种或几种的混合物；其中盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
进一步优选地，所述添加物为盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种；其中盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l。
一种由上述CHO细胞无血清培养基的添加物制得的无血清培养基。
本发明中所述培养基的基础培养基为CHO-S-SFM Ⅱ。
本发明对无血清培养基中的重要添加物维生素进行研究，调控细胞生长代谢和产物表达，并针对不同细胞系及不同产品，调整培养基中营养成分及各个营养成分含量，从而提高细胞的存活率以及增殖等生理活动，调节细胞生长状态，进而提高产品的产量并节约成本，获得较大经济效益。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
一种CHO细胞无血清培养基的添加物，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种或几种的混合物；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
优选地，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
优选地，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H中的任意一种或几种的混合物；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l。
进一步优选地，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H中的任意一种；其中维生素B1的浓度为4ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l，维生素C的浓度为20ug/l，维生素H的浓度为15ug/l。
优选地，所述添加物为盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种或几种的混合物；其中盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
进一步优选地，所述添加物为盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种；其中盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l。
一种由所述CHO细胞无血清培养基的添加物制得的无血清培养基。
所述培养基的基础培养基为CHO-S-SFM Ⅱ。
为更好地说明本发明的有益效果，下面给出具体实施例及对应测试数据加以验证，本发明以表达t-PA的CHO 细胞为研究对象，以48 孔板高通量筛选为手段，以灌流用培养基CHO-S-SFM Ⅱ为基础，通过检测细胞密度，细胞活性以及表达t-PA 蛋白含量的方式筛选最优培养基的维生素类添加物及其应用浓度。
本发明所用的培养的材料为：
细胞株：表达t-PA 重组 CHO 细胞。
基础培养基：培养基为灌流用培养基 CHO-S-SFM Ⅱ，培养基均由0.1 um微孔膜过滤除菌.
添加物：所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种或几种的混合物；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
其他物质：为本领域的常用辅助物质如无机盐、微量元素及血清替代物，可根据实际需要进行选用，本发明不再详细赘述。
本发明细胞培养系统及培养方法为：
以5×105 cells mL-1 的活细胞密度接种于 48 孔板中，培养体积为 600 µL，培养条件为 37oC、5% CO2、饱和空气，转速为220rpm min-1。
生物反应罐培养：将细胞以(3-4)×108cells mL-1 的密度接种于5 L 生物反应罐中，PH控制为7.2，DO(溶解氧浓度)控制为55%空气饱和度，温度为37oC，通气量为0.01vvm。
本发明选用台盼蓝染色法，用血球计数板计数，测定细胞的存活率及细胞密度，并采用试剂盒法测定t-PA蛋白含量表达。
实施例1
以培养细胞中的培养基分组。无添加的无血清培养基为对照组，实验组为添加各浓度的维生素B1，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。
结果如表1-3显示，对照组中未额外添加维生素B1，在正常条件下进行培养，实验组为在培养基中额外在无血清培养基中添加维生素B1相比对照组将对细胞活动有不同影响，其中结果显示额外添加 4ug/l-6ug/l的维生素B1可以通过提高细胞密度，提升细胞活性从而对本产品产量有一定提升。
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.49 0.71 1.46 1.86 2.31 1.99
2ug/l 0.48 0.74 1.39 1.76 2.33 2.04
4ug/l 0.51 0.75 1.66 1.9 2.49 2.44
6ug/l 0.52 0.96 1.88 2.03 2.59 2.31
8ug/l 0.51 0.91 1.79 2.22 2.64 2.37
表1：维生素B1对细胞密度的影响情况
表2：维生素B1对细胞活性的影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 93.6 92.3 87.6 85.4 79.4 77.4
2ug/l 92.2 93.8 88.4 84.8 81.5 77.9
4ug/l 94.3 97.2 97.3 86.9 95.5 93.8
6ug/l 91.3 95.3 96.5 94.2 90.9 91.7
8ug/l 93.9 90.1 89.2 86.8 79.6 88.2
表3：维生素B1对t-PA表达的影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 21.7 26.8 36.3 44.1 47.5 46.5
2ug/l 20.6 25.1 36.2 43.2 47.9 46.2
4ug/l 25.3 29.4 43.9 56.7 59.9 58.6
6ug/l 24.1 26 40.7 50.8 56.8 53.2
8ug/l 22.2 28.2 37.6 47.3 48.8 47.5
实施例2
通过在48孔板中培养表达 t-PA 重组 CHO 细胞，以培养细胞中的培养基分组。无添加无血清培养基为对照组，实验组为添加各浓度的维生素B2，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。
结果如表4-6显示，对照组中未额外添加维生素B2，在正常条件下进行培养，实验组为在培养基中额外在无血清培养基中添加维生素B2相比对照组将对细胞活动有不同影响，在无血清培养基中添加维生素B2 6ug/l-8ug/l可以通过提高细胞密度，提升细胞活性从而对本产品产量有一定提升。
表4 维生素B2对细胞密度影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.5 0.72 1.48 1.88 2.41 2
2ug/l 0.49 0.74 1.39 1.79 2.35 2.08
4ug/l 0.51 0.77 1.41 1.76 2.28 1.98
6ug/l 0.52 0.9 1.92 2.03 2.58 2.38
8ug/l 0.51 0.81 1.82 2.2 2.61 2.4
表5 维生素B2对细胞活性影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 93.2 91.8 88.8 85.3 79.9 77.6
2ug/l 89.8 89.6 89.2 85.4 80 78.3
4ug/l 90.2 89.7 87 84.7 79.8 77.3
6ug/l 91.2 89.9 90.1 89.2 86.7 85.2
8ug/l 90.8 91.2 89.9 87.8 85.8 85.3
表6 维生素B2对t-PA表达影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 21.8 26.3 36.8 44.5 47.9 46.2
2ug/l 20.3 24.9 35.4 43.1 47.1 45.2
4ug/l 20.8 27.2 35.6 43.9 47 45.4
6ug/l 24.6 27.8 41.1 54.3 56.5 53.8
8ug/l 24.1 27.1 38.7 51.8 52.4 52.4
实施例3
通过在48孔板中培养表达 t-PA 重组 CHO 细胞，以培养细胞中的培养基分组。无添加无血清培养基为对照组，实验组为添加各浓度的维生素B12，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。
结果如表7-9显示，对照组中未额外添加维生素B12，在正常条件下进行培养，实验组为在培养基中额外在无血清培养基中添加维生素B12相比对照组将对细胞活动有不同影响，在无血清培养基中添加维生素B12 2ug/l-6ug/l可以通过提高细胞密度，提升细胞活性从而对产品产量有较好提升。
表7 维生素B12对细胞密度影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.49 0.77 1.92 1.88 2.39 2
2ug/l 0.62 0.77 1.62 2.08 2.42 2.13
4ug/l 0.67 0.83 1.68 2.13 2.51 2.14
6ug/l 0.59 0.68 1.58 1.95 2.43 2.09
8ug/l 0.49 0.69 1.42 1.78 2.29 1.97
表8 维生素B12对细胞活性影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 93.9 92.1 88.4 85.3 79.9 78.2
2ug/l 93.1 90.6 89.6 88.3 86.9 84.4
4ug/l 92.9 89.8 90.5 89.2 87.2 83.1
6ug/l 93.3 90.2 90.2 88.7 86.1 84.2
8ug/l 94.5 90.8 89.3 94.6 79.7 74.3
表9 维生素B12对t-PA表达影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 23.3 29.5 39.4 46.7 50.2 48.2
2ug/l 28.6 34.1 41.9 50.9 59.7 52.1
4ug/l 29.6 34.6 42.3 49.7 55.3 50.8
6ug/l 24.3 30.5 41.5 49.1 52.7 50.3
8ug/l 24.4 29.9 39.8 44.5 49.7 44.8
实施例4
通过在48孔板中培养表达 t-PA 重组 CHO 细胞，以培养细胞中的培养基分组。无添加无血清培养基为对照组，实验组为添加各浓度的维生素C，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。
结果如表10-12显示，对照组中未额外添加维生素C，在正常条件下进行培养，实验组为在培养基中额外在无血清培养基中添加维生素C相比对照组将对细胞活动有不同影响，在无血清培养基中添加维生素C 20ug/l-25ug/l可以通过提高细胞密度，提升细胞活性从而对产品产量有较好提升。
表10 维生素C对细胞密度影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.49 0.71 1.46 1.86 2.31 1.99
15ug/l 0.51 0.69 1.39 1.82 2.26 2.02
20ug/l 0.67 0.83 1.61 2.07 2.41 2.12
25ug/l 0.62 0.89 1.66 1.97 2.32 2.17
30ug/l 0.5 0.67 1.39 1.88 2.29 1.98
表11 维生素C对细胞活性影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 93.6 92.3 87.6 85.4 79.4 77.4
15ug/l 92.8 90.8 88.4 85.5 79.2 78
20ug/l 93.4 90.1 97.3 89.8 87.2 84.5
25ug/l 93.6 90.3 96.5 89.6 86.8 85.1
30ug/l 93.5 90.8 89.2 92.2 79.2 76.3
表12 维生素C对t-PA表达影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 21.7 29.1 38.8 45.2 51.2 47.3
15ug/l 22.2 30.3 40.1 43.6 49.6 47.6
20ug/l 29.9 34.7 42.3 49.8 55.7 52.8
25ug/l 28.7 33.8 41.7 50.6 59.4 52
30ug/l 23.1 29.9 39.6 43.5 49.38 46.8
实施例5
通过在48孔板中培养表达 t-PA 重组 CHO 细胞，以培养细胞中的培养基分组。无添加无血清培养基为对照组，实验组为添加各浓度的维生素H，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。
结果如表13-15显示，对照组中未额外添加维生素H，在正常条件下进行培养，实验组为在培养基中额外在无血清培养基中添加维生素H相比对照组将对细胞活动有不同影响，在无血清培养基中添加维生素H 15ug/l-20ug/l可以通过提高细胞密度，提升细胞活性从而对产品产量有较好提升。
表13 维生素H对细胞密度影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.5 0.69 1.48 1.82 2.35 1.99
10ug/l 0.51 0.67 1.36 1.81 2.26 2.01
15ug/l 0.72 0.79 1.61 2.09 2.41 2.13
20ug/l 0.66 0.81 1.63 1.98 2.36 2.19
25ug/l 0.49 0.66 1.32 1.8 2.31 1.97
表14 维生素H对细胞活性影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 93.9 91.9 88.9 85.2 79.8 77.9
10ug/l 93.1 90.6 87.6 85.3 79.7 78.2
15ug/l 93.4 90.3 90 89.8 87.8 83.3
20ug/l 93.5 90.5 90.4 89.6 87.5 83.5
25ug/l 93.5 90.9 89.7 82.2 79.6 74.8
表15 维生素H对t-PA表达影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 22.3 29.1 38.8 45.8 50.2 46.8
10ug/l 23.4 30.3 40.1 44.8 49.8 46.9
15ug/l 29.8 34.4 42.7 49.7 56.2 52.9
20ug/l 28.3 34 41.6 50.2 59.2 52.4
25ug/l 24.2 29.9 39.7 44.6 49.7 46.1
实施例6
通过在48孔板中培养表达 t-PA 重组 CHO 细胞，以培养细胞中的培养基分组。无添加无血清培养基为对照组，实验组为添加各浓度的盐酸吡哆醇，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。
结果如表16-18显示，对照组中未额外添加盐酸吡哆醇，在正常条件下进行培养，实验组为在培养基中额外在无血清培养基中添加盐酸吡哆醇相比对照组将对细胞活动有不同影响，在无血清培养基中添加盐酸吡哆醇2mg/l-4mg/l可以通过提高细胞密度，提升细胞活性从而对产品产量有较好提升。
表16 盐酸吡哆醇对细胞密度影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.5 0.72 1.47 1.88 2.38 2
1mg/l 0.51 0.71 1.4 1.86 2.31 2.01
2mg/l 0.69 0.85 1.62 2.11 2.48 2.22
4mg/l 0.65 0.8 1.61 1.89 2.3 2.06
5mg/l 0.49 0.65 1.35 1.79 2.33 1.96
表17 盐酸吡哆醇对细胞活性影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 93.7 91.2 88.8 85.1 79.9 77.1
1mg/l 92.1 90 89.2 85.9 79.7 78.2
2mg/l 94.1 91.3 89.3 89.6 87.2 82.9
4mg/l 94.2 90.4 89.9 89.6 87.3 81.4
5mg/l 91.1 90.2 87.2 83.5 80.5 78.8
表18 盐酸吡哆醇对t-PA表达影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 21.6 27.1 38.1 44.2 47.6 47.1
1mg/l 20.9 26.1 35.3 44.5 48.1 47.2
2mg/l 29.1 35.1 43.3 49.7 53.2 50
4mg/l 29 34.8 42.6 48.8 51.7 50.1
5mg/l 22.6 26.9 34.8 44.8 48 46.8
实施例7
通过在48孔板中培养表达 t-PA 重组 CHO 细胞，以培养细胞中的培养基分组。无添加无血清培养基为对照组，实验组为添加各浓度的盐酸吡哆醛，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。
结果如表19-21显示，对照组中未额外添加盐酸吡哆醛，在正常条件下进行培养，实验组为在培养基中额外在无血清培养基中添加盐酸吡哆醛相比对照组将对细胞活动有不同影响，在无血清培养基中添加盐酸吡哆醛 0.2mg/l-0.3mg/l可以通过提高细胞密度，提升细胞活性从而对产品产量有较好提升。
表19 盐酸吡哆醛对细胞密度影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.51 0.72 1.46 1.79 2.31 2.01
0.1mg/l 0.53 0.69 1.41 1.78 2.28 2.03
0.2mg/l 0.67 0.87 1.62 2.09 2.48 2.19
0.3mg/l 0.65 0.84 1.61 1.88 2.22 2.06
0.4mg/l 0.5 0.67 1.39 1.76 2.24 1.96
表20 盐酸吡哆醛对细胞活性影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 93.2 91.1 88.2 85.2 79.8 77.1
0.1mg/l 92.5 89.9 89.1 86.8 79.7 77.5
0.2mg/l 93.6 92.2 89.4 89.2 87.6 82.6
0.3mg/l 94.1 90.8 89.9 89.1 87.7 81.4
0.4mg/l 90.7 90.5 87.4 84.2 80.6 78.2
表21 盐酸吡哆醛对t-PA表达影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 21.8 26.5 37.7 44.3 47.6 46.2
0.1mg/l 20.9 25.2 36.9 44.8 48.2 46.3
0.2mg/l 29.2 34.8 43.2 49.6 52.3 50.1
0.3mg/l 29.1 33.6 42.2 48.7 51.5 50.2
0.4mg/l 22.4 26.9 35.3 45.2 48.1 45.7
实施例8
通过在48孔板中培养表达 t-PA 重组 CHO 细胞，以培养细胞中的培养基分组。无添加无血清培养基为对照组，实验组为添加各浓度的肌醇，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。
结果如表22-24显示，对照组中未额外添加肌醇，在正常条件下进行培养，实验组为在培养基中额外在无血清培养基中添加肌醇相比对照组将对细胞活动有不同影响，在无血清培养基中添加肌醇 0.7mg/l-0.8mg/l可以通过提高细胞密度，提升细胞活性从而对产品产量有较好提升。
表22 肌醇对细胞密度影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.5 0.73 1.47 1.81 2.32 2
0.6mg/l 0.49 0.74 1.39 1.81 2.26 2.03
0.7mg/l 0.68 0.88 1.63 2.09 2.48 2.17
0.8mg/l 0.66 0.84 1.61 1.92 2.21 2.05
0.9mg/l 0.48 0.71 1.33 1.78 2.26 1.98
表23 肌醇对细胞活性影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 93.4 91.2 88.9 85.2 79.9 77.3
0.6mg/l 92.2 89.9 89 86.2 79.8 77.8
0.7mg/l 93.7 91.3 89.3 89.7 87.4 83.3
0.8mg/l 94 90.3 89.9 89.6 87.6 82.7
0.9mg/l 91.3 90.1 87.2 83.8 80.4 78.1
表24 肌醇对t-PA表达影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 22.2 27.2 37.6 44.5 47.5 47.3
0.6mg/l 21.3 26.3 36.1 44.8 47.7 47.4
0.7mg/l 28.8 34.4 43.3 49.7 53.4 49.9
0.8mg/l 28.8 34.1 42.8 48.3 52.6 50.2
0.9mg/l 23.1 27.1 35.8 45.1 47.6 47
实施例9
通过在48孔板中培养表达 t-PA 重组 CHO 细胞，以培养细胞中的培养基分组。无添加无血清培养基为对照组，实验组为添加各浓度的叶酸，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。
结果如表25-27显示，在无血清培养基中添加叶酸 1.0mg/l-1.1mg/l对本产品产量有提升。对照组中未额外添加叶酸，在正常条件下进行培养，实验组为在培养基中额外在无血清培养基中添加叶酸相比对照组将对细胞活动有不同影响，在无血清培养基中添加叶酸 1.0mg/l-1.1mg/l可以通过提高细胞密度，提升细胞活性从而对产品产量有较好提升。
表25 叶酸对细胞密度影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.51 0.73 1.47 1.82 2.33 1.99
0.9mg/l 0.54 0.7 1.43 1.77 2.21 2.11
1.0mg/l 0.69 0.8 1.62 2.09 2.45 2.22
1.1mg/l 0.63 0.78 1.59 1.89 2.2 2.15
1.2mg/l 0.53 0.67 1.39 1.74 2.23 1.99
表26 叶酸对细胞活性影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 93.1 90.9 88.8 84.9 79.9 76.4
0.9mg/l 92.1 89.9 89.2 85.4 79.8 77.8
1.0mg/l 93.3 91.2 89.9 89.8 87.6 82.9
1.1mg/l 93.4 90.3 90.1 89.8 87.3 81.8
1.2mg/l 90.9 90.2 86.9 83.9 80.2 78.9
表27 叶酸对t-PA表达影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 21.2 25.8 36.9 43.4 47.2 46.8
0.9mg/l 20.9 25.1 35.6 43.5 47.8 47.2
1.0mg/l 28.9 34.1 43.2 59.2 51.5 49.9
1.1mg/l 29 33.2 42.1 58.8 51.1 50.1
1.2mg/l 22.4 25.6 36.1 44.1 48.9 46.2
实施例10
通过在48孔板中培养表达 t-PA 重组 CHO 细胞，以培养细胞中的培养基分组。无添加无血清培养基为对照组，实验组1-4为添加维生素混合添加物，每日更换培养基，记录从传代后第一天至第六天的细胞密度，细胞活性，t-PA表达量。 实验组1-4的配方如下：
混合1：维生素B1的浓度为4ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l，维生素C的浓度为20ug/l，维生素H的浓度为15ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l。
混合2：维生素B1的浓度为5ug/l，维生素B2的浓度为7ug/l，维生素B12的浓度为4ug/l，维生素C的浓度为20ug/l，维生素H的浓度为15ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为3mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l。
混合3：额外添加维生素B1的浓度为5ug/l，维生素B2的浓度为7ug/l，维生素B12的浓度为4ug/l，维生素C的浓度为25ug/l，维生素H的浓度为20ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为3mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.3mg/l，肌醇浓度的为0.8mg/l，叶酸的浓度为1.1mg/l。
组合四：额外添加维生素B1的浓度为6ug/l，维生素B2的浓度为8ug/l，维生素B12的浓度为6ug/l，维生素C的浓度为25ug/l，维生素H的浓度为20ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.3mg/l，肌醇浓度的为0.8mg/l，叶酸的浓度为1.1mg/l。
结果如表28-30显示，在无血清培养基中添加各组混合配方维生素对本产品产量有提升。对照组中未额外添加维生素，在正常条件下进行培养，实验组相比对照组将对细胞活动有不同影响，在无血清培养基中添加本发明提供的维生素混合物可以提高细胞密度，提升细胞活性，从而对产品产量有较好提升。
表28 混合配方对细胞密度影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 0.47 0.71 1.49 1.77 2.25 2.03
混合1 0.45 0.77 1.56 1.91 2.41 2.23
混合2 0.48 0.69 1.59 1.99 2.29 2.18
混合3 0.43 0.73 1.52 1.87 2.35 2.19
混合4 0.43 0.75 1.62 1.95 2.49 2.07
表29 混合配方对细胞活性影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 91.8 90.2 86.6 84.8 80.1 76.5
混合1 92.4 91.5 88.8 87 83.9 80.5
混合2 93.6 91.9 89.1 88.6 84.1 83.3
混合3 92.9 92.2 90.5 86.4 82.3 81.5
混合4 90.7 90.1 88.2 85.5 82.5 81.6
表30 混合配方对t-PA表达影响情况
区分 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
对照组 19.5 25.7 34.4 42.8 46.9 48.1
混合1 18.9 29.1 38.4 46.7 50.5 51.8
混合2 19.3 28.3 39.5 48.2 51.2 52.6
混合3 18.7 27.9 40.1 48.8 50.3 51.1
混合4 18.9 29.3 35.5 45.9 49.9 51.6
本发明通过表达t-PA的CHO无血清培养基优化，改进向培养基中添加的维生素的种类及对应的浓度，目的蛋白产量显著上升，蛋白活性也没有受到影响，各项指标检测合格。
可以理解的，以上所述仅为本发明的优选的实施方式，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明构思所作的等效变换，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种CHO细胞无血清培养基的添加物，其特征在于：所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种或几种的混合物；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
2.如权利要求1所述CHO细胞无血清培养基的添加物，其特征在于：所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l，盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
3.如权利要求1所述CHO细胞无血清培养基的添加物，其特征在于：所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H中的任意一种或几种的混合物；其中维生素B1的浓度为4ug/l-6ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l-8ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l-6ug/l，维生素C的浓度为20ug/l-25ug/l，维生素H的浓度为15ug/l-20ug/l。
4.如权利要求3所述用于CHO细胞无血清培养基的添加物，其特征在于：所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H中的任意一种；其中维生素B1的浓度为4ug/l，维生素B2的浓度为6ug/l，维生素B12的浓度为2ug/l，维生素C的浓度为20ug/l，维生素H的浓度为15ug/l。
5.如权利要求1所述CHO细胞无血清培养基的添加物，其特征在于：所述添加物为盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种或几种的混合物；其中盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l-4mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l-0.3mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l-0.8mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l-1.1mg/l。
6.如权利要求5所述CHO细胞无血清培养基的添加物，其特征在于：所述添加物为盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种；其中盐酸吡哆醇的浓度为2mg/l，盐酸吡哆醛的浓度为0.2mg/l，肌醇浓度的为0.7mg/l，叶酸的浓度为1.0mg/l。
7.一种由权利要求1至6任意一项所述的CHO细胞无血清培养基的添加物制得的无血清培养基。
8.如权利要求7所述的无血清培养基，其特征在于：所述培养基的基础培养基为CHO-S-SFM Ⅱ。
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