CN105200012A - 造血干细胞低氧培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种造血干细胞低氧培养方法，包括以下步骤：获取造血干细胞于培养基中进行体外培养；所述体外培养过程是在氧气体积百分比为0.5％～6％的细胞培养容器中进行的。通过为造血干细胞创造一个低氧的生长环境，以模拟造血干细胞在体内干细胞龛内的生长环境，并配合无血浆干细胞培养基培养造血干细胞，从而更有利于造血干细胞维持其活性，促进造血干细胞的生长和增殖，并提高造血干细胞的扩增率。

Description

造血干细胞低氧培养方法

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种造血干细胞低氧培养方法。

背景技术

造血干细胞(Hematopoieticstemcells，HSCs)具有自我更新和多向分化的潜能，在临床治疗中具有广泛应用。HSCs主要存在于骨髓中，骨髓中高度特异的造血微环境结构-干细胞龛(stemcellniche)是骨髓正常造血的特定场所，并且干细胞龛内的氧浓度非常低，目前，HSCs的体外扩增培养，通常是在高氧环境下进行的，将HSCs暴露在高氧浓度中，反应性氧自由基会堆积在线粒体内导致细胞的氧化损伤，对细胞的扩增潜能产生不利影响，从而无法高效地对HSCs进行体外扩增，这在一定程度上限制了HSCs的临床应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中体外高氧环境下培养造血干细胞存在细胞易氧化损伤，扩增潜能受限等缺陷，提供一种能够模拟体内干细胞龛内的低氧环境从而提高扩增率的造血干细胞低氧培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种造血干细胞低氧培养方法，包括以下步骤：

获取造血干细胞于培养基中进行体外培养；

所述体外培养过程是在氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中进行的。

在本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中，所述细胞培养容器中的氧气体积百分比为1％。

在本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中，获取造血干细胞的过程包括以下步骤：为采血人皮下注射5-15μg/kg粒细胞集落刺激因子，直到所述采血人每毫升外周血的造血干细胞CD34⁺细胞数大于20×10³后，采集所述采血人的血浆，去除血小板，收集外周血单个核细胞。

在本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中，获取造血干细胞的过程还包括以下步骤：取(0.5-2)×10⁹个所述外周血单个核细胞于无菌离心管中离心，第一次重悬细胞，过滤后离心，第二次重悬细胞，加入抗人CD34磁珠孵育，反复重悬并离心细胞，过滤，置于免疫磁珠纯化柱系统中纯化后获得造血干细胞CD34⁺细胞。

在本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中，所述造血干细胞CD34⁺细胞的纯度大于95％。

在本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中，获取造血干细胞过程中，重悬细胞采用的是含有人血清白蛋白的DPBS缓冲液。

在本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中，在第二次重悬细胞之后，加入抗人CD34磁珠之前，还包括加入阻断剂的步骤。

在本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中，将获得的造血干细胞CD34⁺细胞置于氧气体积百分比为0.5％～6％-的环境中进行培养的步骤包括以下步骤：

将造血干细胞CD34⁺细胞置于无血浆干细胞培养基中，调整细胞的终浓度为(1-10)×10⁴个/mL；再置于氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中培养。

在本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中，所述无血浆干细胞培养基中添加有0.005-0.020μg/ml的白细胞介素-3、0.005-0.020μg/ml的白细胞介素-6、0.005-0.020μg/ml的干细胞因子、0.015-0.030μg/ml的血小板生成素和0.015-0.030μg/ml的人FMS样酪氨酸激酶3配体。

在本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中，在氧气体积百分比为0.5％～6％-的环境中培养6-8天。

实施本发明提供的造血干细胞低氧培养方法，可以达到以下有益效果：通过为造血干细胞创造一个低氧的生长环境，以模拟造血干细胞在体内干细胞龛内的生长环境，并配合无血浆干细胞培养基培养造血干细胞，从而更有利于造血干细胞维持其活性，促进造血干细胞的生长和增殖，并提高造血干细胞的扩增率。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明提供的造血干细胞低氧培养方法中所采用的细胞培养容器的结构示意图。

具体实施方式

为解决现有技术中体外正常氧含量环境下培养造血干细胞存在细胞易损伤、扩增率低等缺陷，本发明的创新点在于提供一种造血干细胞的低氧培养方法，通过将造血干细胞置于低氧环境中进行体外培养，即氧气体积百分比为0.5～6％环境中，以模拟适宜造血干细胞生长的干细胞龛内的低氧环境，更有利于造血干细胞的生长和增殖，从而实现了提高造血干细胞扩增率的目的。

本发明提供的造血干细胞低氧培养方法，包括以下步骤：

先获取造血干细胞，以进行低氧环境中体外培养，具体的操作方法是先从人的外周血中获取到外周血单个核细胞，再纯化得到造血干细胞CD34⁺细胞，从而将造血干细胞CD34⁺细胞置于低氧环境中进行体外培养；其中，低氧环境中的氧气体积百分比为0.5～6％。

本发明提供的造血干细胞低氧培养方法具体的实施方式是：

造血干细胞可来源于外周血、脐带血以及骨髓等，由于外周血的来源较广，且采集较为方便，因此，本发明优选采用从人的外周血中获取造血干细胞。另外，为进一步提高造血干细胞的纯度，本发明优选采用免疫磁珠纯化柱系统分离纯化出外周血中的造血干细胞。

进一步地，获取造血干细胞的步骤为：

S11、采集外周血单个核细胞；

S12、对步骤S11中获取的外周血单个核细胞进行反复离心重悬后，加入免疫磁珠纯化柱系统中进行分离纯化；

步骤S11具体为：每日给予采血人皮下注射5-15μg/kg的G-CSF(粒细胞集落刺激因子)，以促进造血干细胞的增殖、分化和活化，并促进造血干细胞向血液中扩散，优选地，G-CSF的浓度为10μg/kg；直到采血人每毫升外周血的CD34⁺细胞数大于20×10³个后，使用血细胞分离机(购于美国Baxter,Dcerfield,IL公司，型号为Fenwalcs3000)采集人的血浆300ml，收集速度85ml/min，之后用血细胞分离机去除血小板，得到外周血单个核细胞，即造血干细胞单个核细胞。

步骤S12全程均为无菌操作，具体步骤为：

S121、收集步骤S11中获取的(0.5-2)×10⁹个外周血单个核细胞放入50ml无菌离心管中；

S122、以600g的离心加速度在4℃下离心细胞5min，完全弃去上清液；

S123、按300μl/10⁸细胞的比例，用含5％人血清白蛋白的DPBS缓冲液(购于Sigma公司)重新悬浮细胞，即300μl的DPBS缓冲液中加入10⁸个细胞；

S124、过滤除去细胞悬液中的小凝块；本发明中优选采用孔径为40nm的细胞尼龙滤网(购于美国BDBiosciences公司)进行过滤；

S125、在4℃以600g的离心加速度离心细胞5分钟，弃去上清液；

S126、按300μl/10⁸个细胞的比例，再次用含5％人血清白蛋白的DPBS缓冲液重新悬浮细胞，即300μl的DPBS缓冲液中加入10⁸个细胞；

S127、按100μl/10⁸细胞的比例加入FcR阻断剂(购于加拿大MiltenyiBiotec公司)(即100μl的FcR阻断剂中加入10⁸个细胞)，以阻断造血干细胞CD34⁺细胞的非特异性结合，从而避免影响造血干细胞CD34⁺细胞与磁珠上的抗体结合，以提高造血干细胞CD34⁺细胞的分离纯化度；

S128、按100μl/10⁸细胞的比例加入抗人CD34微磁珠，充分混匀后在4°C冰箱孵育30分钟；即在100μl的抗人CD34微磁珠中加入10⁸个细胞；

S129、按5-10ml/10⁸个细胞的比例，用含5％人血清白蛋白的DPBS缓冲液稀释细胞；即在5-10ml的DPBS缓冲液中加入10⁸个细胞；

S130、以600g的离心加速度在4℃离心细胞l0min，完全弃去上清液；

S131、按500μl/10⁸细胞的比例，用含5％人血清白蛋白的DPBS缓冲液再次重新悬浮细胞；即在500μl含5％人血清白蛋白的DPBS缓冲液中加入10⁸个细胞；

S132、用孔径为40μm的细胞尼龙滤网再次过滤细胞备用；

S133、准备MiniMACS免疫磁珠纯化柱系统(购于德国MiltenyiBiotecInc公司)，将MiniMACS免疫磁珠纯化柱系统中的MS柱置入磁铁分离器，并用500μl含5％人血清白蛋白的DPBS缓冲液冲洗MS柱一次；

S134、将步骤S132中获得的细胞悬液加至MiniMACS免疫磁珠纯化柱系统中，磁铁分离器上的MS柱，每次最多加入500μl；

S135、待细胞悬液全部流出后，取下MS柱，用活塞注射器加压冲洗，即获得分离纯化后的造血干细胞CD34⁺细胞；

S136、使用流式细胞仪测定造血干细胞CD34⁺细胞纯化效率，测定结果为：造血干细胞CD34⁺细胞纯度大于95％。

以上仅为本发明提供的其中一种造血干细胞的获取方式及分离纯化方式，可以理解的是，本领域技术人员在本发明的启示下采用的其他造血干细胞的获取方式及分离纯化方式同样适用于本发明。

本发明的创新点在于将造血干细胞置于氧气体积百分比为0.5％～6％的环境下进行培养。造血干细胞主要定居于骨髓的骨内膜区域-干细胞龛内，通过大量研究实验表明，氧气体积百分比在干细胞龛内血供较差的部位仅为1％，而在血窦附近的则有6％，因此，本发明将造血干细胞置于氧气体积百分比为0.5％～6％的环境下进行培养，以模拟干细胞龛内造血干细胞的生长环境，从而更有利于造血干细胞的生长和增殖。

本发明低氧体外培养的具体实施方式是：将上述获取到的纯度大于95％的造血干细胞CD34⁺细胞置于无血浆干细胞培养基中培养，并调整细胞的终浓度为(1-10)×10⁴个/ml，再置于氧气体积百分比为1％的环境中培养6-8天。在无血浆干细胞培养基中添加以下细胞因子：白细胞介素-3(interleukin3，IL-3)、白细胞介素-6(interleukin6，IL-6)、Flt-3L(人FMS样酪氨酸激酶3配体)、干细胞因子(stemcellfactor，SCF)和TPO(血小板生成素)。本发明采用无血浆干细胞培养基避免了血浆组分所带来的外源性污染及对细胞造成的毒性作用，由于无血浆干细胞培养基的成分相对明确，更有利于纯化细胞，并且能够延长细胞的G_I期或迫使细胞处于G₀期而较长时间的维持细胞高密度培养，从而尽可能的生产目的产物，并更好地保持干细胞的特性。

其中，IL-3称为肥大细胞生长因子，是一个具有多效性的细胞因子，能够刺激造血干细胞的增殖与分化；IL-3诱导的造血干细胞表面受体异二聚体化后，可结合许多信号转导蛋白，从而激发了一股下传的信号流，诱导表达与增殖有关的基因，参与干细胞的增殖调控；IL-3还可激活细胞外信号调节酶途径和c-jun氨基末端激酶途径，诱导干细胞的生长、增殖和存活；优选地，在无血浆干细胞培养基中加入的IL-3的浓度为0.005-0.020μg/ml。

IL-6是一类多功能细胞因子，其在生理状态下可诱导细胞的增殖、分化，能够保持造血干细胞的分裂及其特征；优选地，在无血浆干细胞培养基中加入的IL-6的浓度为0.005-0.020μg/ml。

Flt-3L作用于造血干细胞，通过在细胞表面的有TKR结合而发挥造血调控作用，对造血干细胞的体外扩增有明显的促进作用，能够阻止造血干细胞CD34⁺细胞在体外扩增时逐渐定向分化，同时，实验表明造血干细胞在无基质条件下扩增依赖Flt-3L的存在，具有部分替代基质细胞的作用；优选地，在无血浆干细胞培养基中加入的Flt-3L的浓度为0.015-0.030μg/ml。

SCF是一种通过锚定并表达于所有造血干细胞表面的酪氨酸受体c-Kit而发挥作用的因子，c-Kit表达缺陷将导致造血干细胞扩增数量减少，SCF与Flt-3L同属于酪氨酸激酶受体TKR家族，具有扩增原始造血干细胞的协同作用，通过与特异性TKR结合，向细胞内传递信号，启动早期造血干细胞的分裂和增殖，使细胞走出G0期，开始扩增，抑制凋亡；优选地，在无血浆干细胞培养基中加入的SCF的浓度为0.005-0.020μg/ml。

TPO与其他细胞因子组合使用可提高集落形成单位总数和造血干细胞CD34⁺细胞的扩增倍数，特别是在有Flt-3L细胞因子的组合中，TPO能够维持CD34⁺长期生长和扩增；优选地，在无血浆干细胞培养基中加入的TPO的浓度为0.015-0.030μg/ml。

当然可以理解的是，以上仅为本发明提供的优选实施例中所采用的培养基及细胞因子，本领域技术人员在本发明的技术启示下所采用的其他用于造血干细胞扩增培养或诱导培养的培养基及细胞因子同样适用于本发明。

因此，本发明提供的造血干细胞低氧培养方法，一方面为造血干细胞创造一个模拟干细胞龛内的生长环境，另一方面，利用添加有促进细胞增殖的细胞因子的无血浆干细胞培养基培养造血干细胞；通过两方面的结合共同促进造血干细胞的生长和增殖，从而实现提高造血干细胞的扩增率的目的。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

造血干细胞低氧条件下进行扩增培养的具体过程为：

S21、取纯化获得的造血干细胞CD34⁺细胞5×10⁴个；

S22、将以下细胞因子加入无血浆干细胞培养基(SCGM)(购于德国的CellGenix公司)：0.012μg/ml的IL-3、0.012μg/ml的IL-6、0.012μg/ml的SCF、0.025μg/ml的TPO和0.025μg/ml的Flt-3L；

S23、将造血干细胞CD34⁺细胞加入步骤S22中含有细胞因子的CellGro无血浆干细胞培养基中，调整细胞的终浓度为2×10⁴个/ml；

S24、使用具有气体通透性的干细胞培养袋或培养皿中进行培养；优选地，干细胞培养袋为VueLife细胞培养袋，购于德国的CellGenix公司；

S25、将步骤S24中装有造血干细胞CD34⁺细胞的VueLife细胞培养袋或培养皿放入37℃、5％CO₂、1％O₂的细胞培养容器中培养7天后，收集细胞，即为扩增后的造血干细胞CD34⁺细胞。

其中，步骤S25中的细胞培养容器包括容器本体1和与其相适配且密封连接的盖体2，以及用于支撑容器本体1的底座7；盖体2与所述容器本体1共同围成细胞培养空间；优选地，容器本体1和盖体2均由透明玻璃制成，便于观察细胞培养情况。打开盖体2能够将细胞培养袋或培养皿放入容纳空间内或者直接将造血干细胞及培养基置于该细胞培养容器内进行培养，省去细胞培养袋或培养皿。优选地，容器本体1内设有一分隔板6将容纳空间分为竖直方向上的两个不同的容纳室；位于分隔板6上方的容纳室用于放置一个或多个细胞培养袋或培养皿，便于大规模培养造血干细胞；优选地，分隔板6上开设有若干通孔，用于培养袋或培养皿的散热，分隔板6下方的容纳室用于提供散热空间，并可在该容纳室中放置若干干燥剂以维持细胞培养空间内的湿度。

进一步地，盖体2中部向细胞培养空间外凸出一管状开口8，并且开口8上配有相应的密封塞3，密封塞3与该开口8密封连接；优选地，密封塞3由橡胶材料制成。密封塞3上间隔设有与细胞培养空间相通的进气管4和排气管5，进气管4与排气管5均与密封塞3密封连接；进气管4用于持续通入94％N₂∶5％CO₂∶1％O₂的混合气体，以使细胞培养空间内的氧气的体积百分比维持1％。排气管5采用水封的方式，以防止外界气体进入细胞培养空间内；优选地，排气管5位于细胞培养空间外的一端设有一U形结构段51，U形结构段51内存有用于密封排气管的液态水，使得外界气体无法进入细胞培养空间内，以维持细胞培养空间内的低氧环境，并调节细胞培养空间内的气压。除此之外，排气管位于细胞培养空间外的末端端口处还设置一测氧仪(图未示)，用于监控细胞培养容器内的氧气浓度，并适时调节氧气浓度及输入氧气的速率，从而使细胞培养空气内的氧气体积百分比维持1％。优选地，排气管5由塑胶或玻璃等硬质材料制成，以保持U形结构段51的固定状态并使U形结构段51里的液体不流出为宜；进气管由橡胶材料制成。

当然，细胞培养容器也可以是现有技术中的培养箱，通过将培养箱抽真空后再注入94％N₂∶5％CO₂∶1％O₂的混合气体。

为进一步验证本发明提供的造血干细胞低氧培养方法的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。

检测对象

检测组1—本发明实施例1获得的细胞；

检测组2—与本发明实施例1不同之处在于，在氧气体积百分比为20％的条件下培养造血干细胞所收获的细胞；

对照组—与本发明实施例1的不同之处在于，在氧气体积百分比为21％的条件下培养造血干细胞所收获的细胞。

检测实验一、MTT(噻唑蓝)检测

活细胞的线粒体可以产生琥珀酸脱氢酶，该酶可以使MTT还原为不溶于水、却溶于DMSO(二甲基亚砜)的甲簪，死细胞则不能。分别对检测组1-2和对照组执行以下操作：分别抽取培养1-10天的等量的细胞悬浮液于96孔板中，测定光吸收(OD)值；测量时每孔加入20μL的5mg/mlMTT溶液，继续在培养箱中培养6小时后(其中，检测组1-2培养箱环境为37℃，5％CO₂、1％O₂，而对照组培养箱环境为37℃，5％CO₂培养箱)，小心吸弃孔内液体，每孔内加入150μL的DMSO(二甲基亚砜)。将96孔板放置在酶联免疫检测仪上震荡20分钟，采用双波长测定法，酶联免疫测定仪设定检测波长492nm，参比波长630nm，测定OD值，根据测得的OD值来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

表1

天数	OD值-对照组	OD值-检测组1	OD值-检测组2
				1	0.0321±0.0152	0.0454±0.0004	0.0401±0.0153
2	0.0737±0.0144	0.0970±0.0005	0.0787±0.0149
				3	0.0789±0.0241	0.1453±0.0055	0.0889±0.0248
4	0.1345±0.0156	0.2259±0.0021	0.1545±0.0155
				5	0.2215±0.0189	0.3849±0.0037	0.2315±0.0184
6	0.3111±0.0233	0.4744±0.0089	0.3211±0.0237
				7	0.4269±0.0296	0.5951±0.0025	0.4369±0.0299
8	0.7787±0.0127	0.7147±0.0056	0.7887±0.0121
				9	0.8446±0.0198	0.9279±0.0049	0.8646±0.0193

10

0.9722±0.0150

1.1379±0.0038

0.9812±0.0156

检测结果：OD值越大，代表溶液中甲簪的含量越高，同时也说明，促使MTT酶解为甲簪的琥珀酸脱氢酶越多，分泌琥珀酸脱氢酶的活细胞的数量较多。由表1中数据可知，本发明实施例1中，OD值均大于对照组，由此说明，通过本发明提供的造血干细胞低氧培养方法所获得的细胞活性较强，且细胞数量较多。

检测实验二、检测细胞周期

分别取检测组1和对照组培养第14天所获得的细胞，经流式细胞术分析G₀/G₁期、G₂/M期细胞百分比，分别各取3组标本进行检测分析。

表2：

检测结果：由表2可知，检测组1中，G₀/G₁期细胞百分比大于对照组，而G₂/M期细胞百分比小于对照组，由此可知，检测组1通过本发明提供的造血干细胞低氧培养方法所获得的活细胞数量多于对照组；而检测组G₀/G₁期细胞百分比远大于G₂/M期，由此说明，本发明提供的造血干细胞低氧培养方法能够延长造血干细胞的G₀/G₁期而较长时间的维持细胞高密度的培养，在相应诱导剂的刺激作用下，有利于造血干细胞转化成更多的目的产物。

综上所述，本发明提供的造血干细胞低氧培养方法，通过将造血干细胞置于氧气百分比为0.5％～6％的低氧环境下进行培养，不仅提高了造血干细胞的扩增率，增加了造血干细胞的数量及提高了其活性，而且延长了造血干细胞的G₀/G₁期而较长时间的维持细胞高密度的培养，提高了造血干细胞的自我更新能力，维持其干细胞特性，避免造血干细胞易氧化受损。

以上结合对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取造血干细胞于培养基中进行体外培养；

所述体外培养过程是在氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中进行的。

2.根据权利要求1所述的造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，所述细胞培养容器中的氧气体积百分比为1％。

3.根据权利要求1所述的造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，获取造血干细胞的过程包括以下步骤：为采血人皮下注射5-15μg/kg粒细胞集落刺激因子，直到所述采血人每毫升外周血的造血干细胞CD34⁺细胞数大于20×10³后，采集所述采血人的血浆，去除血小板，收集外周血单个核细胞。

4.根据权利要求3所述的造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，获取造血干细胞的过程还包括以下步骤：取(0.5-2)×10⁹个所述外周血单个核细胞于无菌离心管中离心，第一次重悬细胞，过滤后离心，第二次重悬细胞，加入抗人CD34磁珠孵育，反复重悬并离心细胞，过滤，置于免疫磁珠纯化柱系统中纯化后获得造血干细胞CD34⁺细胞。

5.根据权利要求4所述的造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，所述造血干细胞CD34⁺细胞的纯度大于95％。

6.根据权利要求4所述的造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，获取造血干细胞过程中，重悬细胞采用的是含有人血清白蛋白的DPBS缓冲液。

7.根据权利要求4所述的造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，在第二次重悬细胞之后，加入抗人CD34磁珠之前，还包括加入阻断剂的步骤。

8.根据权利要求4所述的造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，将获得的造血干细胞CD34⁺细胞置于氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中进行培养的步骤包括以下步骤：

将造血干细胞CD34⁺细胞置于无血浆干细胞培养基中，调整细胞的终浓度为(1-10)×10⁴个/mL；再置于氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中培养。

9.根据权利要求8所述的造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，所述无血浆干细胞培养基中添加有0.005-0.020μg/ml的白细胞介素-3、0.005-0.020μg/ml的白细胞介素-6、0.005-0.020μg/ml的干细胞因子、0.015-0.030μg/ml的血小板生成素和0.015-0.030μg/ml的人FMS样酪氨酸激酶3配体。

10.根据权利要求8所述的造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，在氧气体积百分比为0.5％～6％-的环境中培养6-8天。