CN105821001A - 配合淋巴细胞培养基快速诱导大量dc-cik、nk细胞的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种配合淋巴细胞培养基快速诱导大量DC‑CIK、NK细胞的试剂盒及其使用方法，包括DC套盒：10ug干粉DC‑A、5ug干粉DC‑B；CIK套盒：6支干粉CIK‑A(30ug/支)、10ug干粉CIK‑B、20ug干粉CIK‑C；NK套盒：5支干粉NK‑A(50ug/支)、10ug干粉NK‑B、5ug干粉NK‑C。本发明利用DC‑CIK、NK细胞诱导试剂盒能够配合淋巴细胞培养基在最短的时间内诱导扩增出5*109以上的淋巴细胞，其中CIK细胞(CD3+CD56+)比例达到25％以上，NK细胞(CD3‑CD56+)比例达到50％以上。为体外大规模扩增DC‑CIK、NK细胞提供便利的方法，为相关研究及临床实验提供便利。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导DC-CIK、NK细胞的试剂盒及其使用方法，尤其是一种配合淋巴细胞培养基快速诱导大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒及其使用方法。
背景技术
当前免疫细胞因其高效的肿瘤细胞杀伤活性，其无任何副作用的优势已经逐渐被医学界认可。DC-CIK、NK(Cytokine induced killer)细胞作为免疫细胞中最具代表性的两种细胞，其诱导和扩增的方法各不相同，且诱导出的细胞数量和质量也参差不齐。没有一套简单、高效、稳定的诱导试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一套简单、高效、稳定的配合淋巴细胞培养基快速诱导大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒及其使用方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种配合淋巴细胞培养基快速诱导大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒，包括DC套盒：10ug干粉DC-A、5ug干粉DC-B；CIK套盒：6支干粉CIK-A(30ug/支)、10ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C；NK套盒：5支干粉NK-A(50ug/支)、10ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按质量百分比，各种组分的成分如下：
DC套盒：
干粉DC-A：30％-50％白细胞介素-4(4000IU/ug)、50％-70％粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(25000IU/ug)；
干粉DC-B：100％肿瘤坏死因子-α(16000IU/ug)；
CIK套盒：
干粉CIK-A：60％-75％白细胞介素-2(15000IU/ug)、25％-40％氨基酸；
干粉CIK-B：60％-80％CD3单抗、20％-40％干扰素-伽马(28000IU/ug)；
干粉CIK-C：20％-30％CD3单抗、70％-80％CD28单抗；
NK套盒：
干粉NK-A：30％-40％白细胞介素-2(15000IU/ug)、20％-30％白细胞介素-12(7000IU/ug)、30％-50％白细胞介素-15(7000IU/ug)；
干粉NK-B：70％-80％CD16单抗、20％-30％干扰素-伽马(40000IU/ug)；
干粉NK-C：100％CD16单抗。
优选，按质量百分比，DC套盒：干粉DC-A：40％白细胞介素-4(IL-4)、60％粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干粉DC-B：100％肿瘤坏死因子-α(TNF-a)；CIK套盒：干粉CIK-A：70％白细胞介素-2、30％氨基酸；干粉CIK-B：70％CD3单抗、30％干扰素-伽马(IFN-γ)；干粉CIK-C：25％CD3单抗、75％CD28单抗；NK套盒：干粉NK-A：40％白细胞介素-2、30％白细胞介素-12(IL-12)、30％白细胞介素-15(IL-15)；干粉NK-B：70％CD16单抗、30％干扰素-伽马(IFN-γ)；干粉NK-C：100％CD16单抗。
上述的配合淋巴细胞培养基快速诱导出大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)配置细胞诱导培养基备用
DC细胞诱导培养基:150ml淋巴细胞培养基中添加干粉DC-A；
CIK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉CIK-A；
NK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉NK-A；
(2)使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；再使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；
(3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至一个T-175细胞培养瓶中，加入50ml淋巴细胞培养基孵育1-2h后将未贴壁的细胞吸出，贴壁的细胞中加入50ml DC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
(4)将步骤(3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，按照细胞数量比1：1的比例将所有细胞平均加入到分别提前2小时CIK-B预包被T-175细胞培养瓶，以及NK-B预包被的T-175细胞培养瓶中；在预包被CIK-B的培养瓶中加入70ml CIK细胞诱导培养基诱导CIK细胞；在预包被NK-B的培养瓶中加入70ml NK细胞诱导培养基以及终浓度诱导NK细胞；将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(5)培养的第3天，用5ml淋巴细胞培养基溶解1支CIK-A，并取出
1ml补加到CIK细胞诱导体系中继续培养，其余4ml废弃；
(6)培养的第4天，在DC细胞诱导体系中加入50ml DC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；同时NK细胞诱导体系中加入100ml NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(7)培养第5天，在CIK细胞诱导体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(8)培养第6天，在DC细胞诱导体系中加入用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉DC-B，混合均匀后继续培养；
(9)第7天，将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液转移到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中，补加200ml CIK细胞诱导培养基；与此同时将诱导DC细胞诱导体系中的细胞全部收获后加入到上述细胞培养袋中与CIK细胞共培养，并且补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉CIK-C；同时，将NK细胞诱导体系中的细胞悬液加入到另一个1.8升容量细胞培养袋中，在培养体系中加入400ml的NK细胞诱导培养，并补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉NK-C，混合均匀后继续培养；
(10)培养的第9天，在DC-CIK细胞的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(11)培养的第11天，在DC-CIK细胞共培养的培养袋中加入800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞的培养袋中加入1000ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(12)培养的第14天，在DC-CIK细胞培养体系中取出800-1000ml的DC-CIK细胞悬液收获细胞，并加入600ml的CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞培养体系中取出800-1000ml的NK细胞悬液收获细胞，加入600ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养并离心并回收细胞。
(13)第17天，将DC-CIK细胞共培养的培养袋及NK细胞的培养袋中的所有细胞收获，离心并回收细胞，计算细胞总数并通过流式细胞检测方法确定其中CIK细胞的比例和NK细胞的比例。
所述步骤(13)中，所述CIK细胞(CD3+CD56+)的比例达到25％以上，NK细胞(CD3-CD56+)比例达到50％以上。
本发明的有益效果是：配合多种细胞因子及联合培养技术对DC、CIK及NK分别进行诱导培养，并在一定时间点能够稳定的获得一定数量和质量的CIK细胞，细胞总量在5*109以上的淋巴细胞，其中CIK细胞(CD3+CD56+)比例达到25％以上，NK细胞(CD3-CD56+)比例达到50％以上。
附图说明
图1培养第7天的CIK、NK、DC细胞图。
图2培养第7天的DC细胞的流式检测结果图(成熟DC细胞的表面标志物CD1A、CD83、CD86的阳性率分别为75％、79％、89％)。
图3诱导第17天CIK及NK细胞诱导结果图(在各自的培养体系中CIK细胞的比例为26.8％；NK细胞的比例为52.2％，左图为CIK细胞流式检测结果，右图为NK细胞流式检测结果)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的配合淋巴细胞培养基快速诱导大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒，包括DC套盒：10ug干粉DC-A、5ug干粉DC-B；CIK套盒：6支干粉CIK-A(30ug/支)、10ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C；NK套盒：5支干粉NK-A(50ug/支)、10ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按质量百分比，各种组分的成分如下：
DC套盒：
干粉DC-A：30％-50％白细胞介素-4(4000IU/ug)、50％-70％粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(25000IU/ug)；
干粉DC-B：100％肿瘤坏死因子-α(16000IU/ug)；
CIK套盒：
干粉CIK-A：60％-75％白细胞介素-2(15000IU/ug)、25％-40％氨基酸；
干粉CIK-B：60％-80％CD3单抗、20％-40％干扰素-伽马(28000IU/ug)；
干粉CIK-C：20％-30％CD3单抗、70％-80％CD28单抗；
NK套盒：
干粉NK-A：30％-40％白细胞介素-2(15000IU/ug)、20％-30％白细胞介素-12(7000IU/ug)、30％-50％白细胞介素-15(7000IU/ug)；
干粉NK-B：70％-80％CD16单抗、20％-30％干扰素-伽马(40000IU/ug)；
干粉NK-C：100％CD16单抗。
优选，按质量百分比，DC套盒：DC套盒：干粉DC-A：40％白细胞介素-4(IL-4)、60％粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干粉DC-B：100％肿瘤坏死因子-α(TNF-a)；CIK套盒：干粉CIK-A：70％白细胞介素-2、30％氨基酸；干粉CIK-B：70％CD3单抗、30％干扰素-伽马(IFN-γ)；干粉CIK-C：25％CD3单抗、75％CD28单抗；NK套盒：干粉NK-A：40％白细胞介素-2、30％白细胞介素-12(IL-12)、30％白细胞介素-15(IL-15)；干粉NK-B：70％CD16单抗、30％干扰素-伽马(IFN-γ)；干粉NK-C：100％CD16单抗。
上述的配合淋巴细胞培养基快速诱导出大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)配置细胞诱导培养基备用
DC细胞诱导培养基:150ml淋巴细胞培养基中添加干粉DC-A；
CIK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉CIK-A；
NK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉NK-A；
(2)使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；再使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；
(3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至一个T-175细胞培养瓶中，加入50ml淋巴细胞培养基孵育1-2h后将未贴壁的细胞吸出，贴壁的细胞中加入50ml DC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
(4)将步骤(3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，按照细胞数量比1：1的比例将所有细胞平均加入到分别提前2小时CIK-B预包被T-175细胞培养瓶，以及NK-B预包被的T-175细胞培养瓶中；在预包被CIK-B的培养瓶中加入70ml CIK细胞诱导培养基诱导CIK细胞；在预包被NK-B的培养瓶中加入70ml NK细胞诱导培养基以及终浓度诱导NK细胞；将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(5)培养的第3天，用5ml淋巴细胞培养基溶解1支CIK-A，并取出1ml补加到CIK细胞诱导体系中继续培养，其余4ml废弃；
(6)培养的第4天，在DC细胞诱导体系中加入50ml DC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；同时NK细胞诱导体系中加入100ml NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(7)培养第5天，在CIK细胞诱导体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(8)培养第6天，在DC细胞诱导体系中加入用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉DC-B，混合均匀后继续培养；
(9)第7天，将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液转移到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中，补加200ml CIK细胞诱导培养基；与此同时将诱导DC细胞诱导体系中的细胞全部收获后加入到上述细胞培养袋中与CIK细胞共培养，并且补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉CIK-C；同时，将NK细胞诱导体系中的细胞悬液加入到另一个1.8升容量细胞培养袋中，在培养体系中加入400ml的NK细胞诱导培养，并补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉NK-C，混合均匀后继续培养；
(10)培养的第9天，在DC-CIK细胞的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(11)培养的第11天，在DC-CIK细胞共培养的培养袋中加入800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞的培养袋中加入1000ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(12)培养的第14天，在DC-CIK细胞培养体系中取出800-1000ml的DC-CIK细胞悬液收获细胞，并加入600ml的CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞培养体系中取出800-1000ml的NK细胞悬液收获细胞，加入600ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养并离心并回收细胞。
(13)第17天，将DC-CIK细胞共培养的培养袋及NK细胞的培养袋中的所有细胞收获，离心并回收细胞，计算细胞总数并通过流式细胞检测方法确定其中CIK细胞的比例和NK细胞的比例。
所述步骤(13)中，所述CIK细胞的比例是指CD3+CD56+的比例，NK细胞的比例是指CD3-CD56+的比例。
实施例1
如图1、2、3所示，本发明的DC-CIK、NK细胞的试剂盒，包括DC套盒：10ug干粉DC-A、5ug干粉DC-B；CIK套盒：6支干粉CIK-A(30ug/支)、10ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C；NK套盒：5支干粉NK-A(50ug/支)、10ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按质量百分比，各种组分的成分如下：
DC套盒：
干粉DC-A：40％白细胞介素-4(4000IU/ug)、60％粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(25000IU/ug)；
干粉DC-B：100％肿瘤坏死因子-α(16000IU/ug)；
CIK套盒：
干粉CIK-A：70％白细胞介素-2(15000IU/ug)、30％氨基酸；
干粉CIK-B：70％CD3单抗、30％干扰素-伽马(28000IU/ug)；
干粉CIK-C：25％CD3单抗、75％CD28单抗；
NK套盒：
干粉NK-A：40％白细胞介素-2(15000IU/ug)、30％白细胞介素-12(7000IU/ug)、30％白细胞介素-15(7000IU/ug)；
干粉NK-B：70％CD16单抗、30％干扰素-伽马(40000IU/ug)；
干粉NK-C：100％CD16单抗。
具体实施方案：
(1)配置细胞诱导培养基备用
DC细胞诱导培养基:150ml淋巴细胞培养基中添加干粉DC-A；
CIK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉CIK-A；
NK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉NK-A；
(2)使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；再使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；
(3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至一个T-175细胞培养瓶中，加入50ml淋巴细胞培养基孵育1-2h后将未贴壁的细胞吸出，贴壁的细胞中加入50ml DC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
(4)将步骤(3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，按照细胞数量比1：1的比例将所有细胞平均加入到分别提前2小时CIK-B预包被T-175细胞培养瓶，以及NK-B预包被的T-175细胞培养瓶中；在预包被CIK-B的培养瓶中加入70ml CIK细胞诱导培养基诱导CIK细胞；在预包被NK-B的培养瓶中加入70ml NK细胞诱导培养基以及终浓度诱导NK细胞；将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(5)培养的第3天，用5ml淋巴细胞培养基溶解1支CIK-A，并取出
1ml补加到CIK细胞诱导体系中继续培养，其余4ml废弃；
(6)培养的第4天，在DC细胞诱导体系中加入50ml DC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；同时NK细胞诱导体系中加入100ml NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(7)培养第5天，在CIK细胞诱导体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(8)培养第6天，在DC细胞诱导体系中加入用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉DC-B，混合均匀后继续培养；
(9)第7天，将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液转移到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中，补加200ml CIK细胞诱导培养基；与此同时将诱导DC细胞诱导体系中的细胞全部收获后加入到上述细胞培养袋中与CIK细胞共培养，并且补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉CIK-C；同时，将NK细胞诱导体系中的细胞悬液加入到另一个1.8升容量细胞培养袋中，在培养体系中加入400ml的NK细胞诱导培养，并补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉NK-C，混合均匀后继续培养；
(10)培养的第9天，在DC-CIK细胞的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(11)培养的第11天，在DC-CIK细胞共培养的培养袋中加入800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞的培养袋中加入1000ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(12)培养的第14天，在DC-CIK细胞培养体系中取出800-1000ml的DC-CIK细胞悬液收获细胞，并加入600ml的CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞培养体系中取出800-1000ml的NK细胞悬液收获细胞，加入600ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养并离心并回收细胞。
(13)第17天，将DC-CIK细胞共培养的培养袋及NK细胞的培养袋中的所有细胞收获，离心并回收细胞，计算细胞总数为60.2*108，并通过流式细胞检测方法确定其中CIK细胞(CD3+CD56+)的比例为26.8％，NK细胞(CD3-CD56+)的比例为52.2％。
实施例2
本发明的DC-CIK、NK细胞的试剂盒，包括DC套盒：10ug干粉DC-A、5ug干粉DC-B；CIK套盒：6支干粉CIK-A(30ug/支)、10ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C；NK套盒：5支干粉NK-A(50ug/支)、10ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按质量百分比，各种组分的成分如下：
DC套盒：
干粉DC-A：50％白细胞介素-4(4000IU/ug)、50％粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(25000IU/ug)；
干粉DC-B：100％肿瘤坏死因子-α(16000IU/ug)；
CIK套盒：
干粉CIK-A：75％白细胞介素-2(15000IU/ug)、25％氨基酸；
干粉CIK-B：80％CD3单抗、20％干扰素-伽马(28000IU/ug)；
干粉CIK-C：30％CD3单抗、70％CD28单抗；
NK套盒：
干粉NK-A：40％白细胞介素-2(15000IU/ug)、30％白细胞介素-12(7000IU/ug)、30％白细胞介素-15(7000IU/ug)；
干粉NK-B：80％CD16单抗、20％干扰素-伽马(40000IU/ug)；
干粉NK-C：100％CD16单抗。
具体实施方案：
(1)配置细胞诱导培养基备用
DC细胞诱导培养基:150ml淋巴细胞培养基中添加干粉DC-A；
CIK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉CIK-A；
NK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉NK-A；
(2)使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；再使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；
(3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至一个T-175细胞培养瓶中，加入50ml淋巴细胞培养基孵育1-2h后将未贴壁的细胞吸出，贴壁的细胞中加入50ml DC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
(4)将步骤(3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，按照细胞数量比1：1的比例将所有细胞平均加入到分别提前2小时CIK-B预包被T-175细胞培养瓶，以及NK-B预包被的T-175细胞培养瓶中；在预包被CIK-B的培养瓶中加入70ml CIK细胞诱导培养基诱导CIK细胞；在预包被NK-B的培养瓶中加入70ml NK细胞诱导培养基以及终浓度诱导NK细胞；将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(5)培养的第3天，用5ml淋巴细胞培养基溶解1支CIK-A，并取出1ml补加到CIK细胞诱导体系中继续培养，其余4ml废弃；
(6)培养的第4天，在DC细胞诱导体系中加入50ml DC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；同时NK细胞诱导体系中加入100ml NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(7)培养第5天，在CIK细胞诱导体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(8)培养第6天，在DC细胞诱导体系中加入用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉DC-B，混合均匀后继续培养；
(9)第7天，将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液转移到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中，补加200ml CIK细胞诱导培养基；与此同时将诱导DC细胞诱导体系中的细胞全部收获后加入到上述细胞培养袋中与CIK细胞共培养，并且补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉CIK-C；同时，将NK细胞诱导体系中的细胞悬液加入到另一个1.8升容量细胞培养袋中，在培养体系中加入400ml的NK细胞诱导培养，并补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉NK-C，混合均匀后继续培养；
(10)培养的第9天，在DC-CIK细胞的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(11)培养的第11天，在DC-CIK细胞共培养的培养袋中加入800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞的培养袋中加入1000ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(12)培养的第14天，在DC-CIK细胞培养体系中取出800-1000ml的DC-CIK细胞悬液收获细胞，并加入600ml的CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞培养体系中取出800-1000ml的NK细胞悬液收获细胞，加入600ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养并离心并回收细胞；
(13)第17天，将DC-CIK细胞共培养的培养袋及NK细胞的培养袋中的所有细胞收获，离心并回收细胞，计算细胞总数为59.6*108，并通过流式细胞检测方法确定其中CIK细胞(CD3+CD56+)的比例为25.6％，NK细胞(CD3-CD56+)的比例为51.7％。
本发明立足于免疫细胞DC-CIK、NK细胞的体外大规模诱导方法，由于其在临床上巨大的应用前景。本发明涉及的试剂盒必将为有需求的人员提供一种高效、便捷的DC-CIK、NK细胞获得方法。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (4)
1.一种配合淋巴细胞培养基快速诱导大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒，其特征在于，包括DC套盒：10ug干粉DC-A,5ug干粉DC-B；CIK套盒：6支干粉CIK-A、30ug/支,10ug干粉CIK-B，20ug干粉CIK-C；NK套盒：5支干粉NK-A、50ug/支，10ug干粉NK-B，5ug干粉NK-C；
按质量百分比，各种组分的成分如下：
DC套盒：
干粉DC-A：4000IU/ug白细胞介素-4 30％-50％
25000IU/ug粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 50％-70％
干粉DC-B：16000IU/ug肿瘤坏死因子-α
CIK套盒：
干粉CIK-A：15000IU/ug白细胞介素-2 60％-75％
氨基酸 25％-40％
干粉CIK-B：CD3单抗 60％-80％
28000IU/ug干扰素-伽马 20％-40％
干粉CIK-C：CD3单抗 20％-30％
CD28单抗 70％-80％
NK套盒：
干粉NK-A：15000IU/ug白细胞介素-2 30％-40％
7000IU/ug白细胞介素-12 20％-30％
7000IU/ug白细胞介素-15 30％-50％
干粉NK-B：CD16单抗 70％-80％
40000IU/ug干扰素-伽马 20％-30％
干粉NK-C：CD16单抗。
2.根据权利要求1所述的配合淋巴细胞培养基快速诱导大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒，其特征在于，按质量百分比，DC套盒：干粉DC-A：40％白细胞介素-4、60％粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；干粉DC-B：100％肿瘤坏死因子-α；CIK套盒：干粉CIK-A：70％白细胞介素-2、30％氨基酸；干粉CIK-B：70％CD3单抗、30％干扰素-伽马；干粉CIK-C：25％CD3单抗、75％CD28单抗；NK套盒：干粉NK-A：40％白细胞介素-2、30％白细胞介素-12、30％白细胞介素-15；干粉NK-B：70％CD16单抗、30％干扰素-伽马；干粉NK-C：100％CD16单抗。
3.如权利要求1中所述的配合淋巴细胞培养基快速诱导出大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配置细胞诱导培养基备用
DC细胞诱导培养基:150ml淋巴细胞培养基中添加干粉DC-A；
CIK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉CIK-A；
NK细胞诱导培养基：每500ml淋巴细胞培养基中添加1支干粉NK-A；
(2)使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；再使用6毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在1个T-175培养瓶中分别加入5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；
(3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至一个T-175细胞培养瓶中，加入50ml淋巴细胞培养基孵育1-2h后将未贴壁的细胞吸出，贴壁的细胞中加入50ml DC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
(4)将步骤(3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，按照细胞数量比1：1的比例将所有细胞平均加入到分别提前2小时CIK-B预包被T-175细胞培养瓶，以及NK-B预包被的T-175细胞培养瓶中；在预包被CIK-B的培养瓶中加入70ml CIK细胞诱导培养基诱导CIK细胞；在预包被NK-B的培养瓶中加入70ml NK细胞诱导培养基以及终浓度诱导NK细胞；将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(5)培养的第3天，用5ml淋巴细胞培养基溶解1支CIK-A，并取出1ml补加到CIK细胞诱导体系中继续培养，其余4ml废弃；
(6)培养的第4天，在DC细胞诱导体系中加入50ml DC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；同时NK细胞诱导体系中加入100ml NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(7)培养第5天，在CIK细胞诱导体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(8)培养第6天，在DC细胞诱导体系中加入用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉DC-B，混合均匀后继续培养；
(9)第7天，将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液转移到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中，补加200ml CIK细胞诱导培养基；与此同时将诱导DC细胞诱导体系中的细胞全部收获后加入到上述细胞培养袋中与CIK细胞共培养，并且补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉CIK-C；同时，将NK细胞诱导体系中的细胞悬液加入到另一个1.8升容量细胞培养袋中，在培养体系中加入400ml的NK细胞诱导培养，并补加用500ul淋巴细胞培养基溶解的干粉NK-C，混合均匀后继续培养；
(10)培养的第9天，在DC-CIK细胞的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(11)培养的第11天，在DC-CIK细胞共培养的培养袋中加入800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞的培养袋中加入1000ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
(12)培养的第14天，在DC-CIK细胞培养体系中取出800-1000ml的DC-CIK细胞悬液收获细胞，并加入600ml的CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞培养体系中取出800-1000ml的NK细胞悬液收获细胞，加入600ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养并离心并回收细胞。
(13)第17天，将DC-CIK细胞共培养的培养袋及NK细胞的培养袋中的所有细胞收获，离心并回收细胞，计算细胞总数并通过流式细胞检测方法确定其中CIK细胞的比例和NK细胞的比例。
4.根据权利要求3所述的配合淋巴细胞培养基快速诱导大量DC-CIK、NK细胞的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(13)中，所述CIK细胞的比例是指CD3+CD56+达到25％以上，NK细胞的比例是指CD3-CD56+达到50％以上。
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