CN107058222A - 一种nk细胞培养试剂盒及其使用方法和得到的nk细胞 - Google Patents

一种nk细胞培养试剂盒及其使用方法和得到的nk细胞 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞培养试剂盒及其使用方法和得到的NK细胞。试剂盒包含NK试剂套盒和NK耗材套盒，其中耗材套盒包括：单核淋巴细胞分离离心管、一种便捷细胞加样预灌支架、细胞培养袋托盘和细胞培养袋；一试剂套盒包括：预处理因子NK‑A、预处理因子NK‑B、扩增因子NK‑C、扩增因子NK‑D、扩增因子NK‑E和无血清淋巴细胞培养基。本发明利用NK培养试剂盒配合基本实验耗材能短时间内扩增出2*109以上的淋巴细胞，其中NK细胞(CD3‑CD56+)比例达到60％以上，为体外大规模扩增NK细胞和相关研究及临床试验提供便利。

Description

一种NK细胞培养试剂盒及其使用方法和得到的NK细胞
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，尤其是一套可标准化生产操作的NK细胞培养试剂盒及其使用方法和得到的NK细胞。使用该试剂盒和基本实验耗材可短时间内便捷的扩增大量NK细胞,为体外大规模扩增NK细胞和相关研究及临床试验提供便利。
背景技术
2000年国际肿瘤生物治疗及基因治疗年会中指出“免疫细胞疗法是现代科技中唯一有可能彻底清除癌症细胞的方法”。梦想照进现实，癌症正在逐渐被人类战胜。细胞免疫疗法是除手术、放疗、化疗以外的第四大癌症治疗模式。NK细胞作为免疫治疗临床研究中的热点，其诱导和扩增的方法各不相同，且诱导出的细胞数量和质量也参差不齐。没有一套简单、高效、稳定的诱导试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一套简便安全的NK细胞培养试剂盒及其使用方法和得到的NK细胞。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种NK细胞培养试剂盒,试剂盒包含NK试剂套盒和NK耗材套盒：
NK试剂套盒包括：一支10ul预处理因子NK-A、一支40ul预处理因子NK-B、一支40ul扩增因子NK-C、一支500ul扩增因子NK-D、一支500ul扩增因子NK-E和一瓶1000ml无血清淋巴细胞培养基，按质量浓度，各因子的成分如下，溶剂为无血清淋巴细胞培养基；
预处理因子NK-A：
CD16mAb 2-5mg/ml
Retronectin 5-10mg/ml
预处理因子NK-B：
CD16mAb 2-5mg/ml
扩增因子NK-C：
15000IU/ug IL-2 35-60ug/ml
7000IU/ug IL-12 50-100ug/ml
7000IU/ug IL-15 25-50ug/ml
扩增因子NK-D：
15000IU/ug IL-2 35ug-60ug/ml
7000IU/ug IL-15 25ug-50ug/ml
扩增因子NK-E：
15000IU/ug IL-2 35ug-60ug/ml
7000IU/ug IL-12 25-50ug/ml
7000IU/ug IL-15 25-50ug/ml
NK耗材套盒包括：两支单核淋巴细胞分离离心管、一个细胞加样预灌支架、一个细胞培养袋和一个细胞培养袋托盘。
所述单核淋巴细胞分离离心管由聚丙烯离心管和水平固定在聚丙烯离心管中的多孔异形筛板组成，靠近管壁处的多孔异形筛板上有方便加入淋巴细胞分离液的缺口，筛板档网的孔径为20-40μm。
所述聚丙烯离心管为50ml，多孔异形筛板固定于15ml刻度处。
所述细胞加样预灌支架由托板和支架组成，支架包括第一支架板和第二支架板，托板与第一支架板之间、第一支架板和第二支架板之间均采用旋转卡扣式结构连接，第一支架板旋转270°后固定，第二支架板旋转90°固定，使第一支架板垂直于托板上，第二支架板平行托板并相距一定距离，第二支架板为双层隔板，与旋转卡扣相对的一侧带有开口的“U”槽，两层隔板之间预留5mm距离，使注射器空桶托耳能水平推入两层隔板之间。
所述细胞培养袋托盘为四方形，细胞培养袋托盘底部设置有方便气体交换的多个透气孔，细胞培养袋托盘上面四角设置有使多个细胞培养袋托盘重叠放置的水平托耳。
上述NK细胞培养试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)取T-75细胞培养瓶，加入5ml无血清淋巴细胞培养基、一支预处理因子NK-A，包被培养瓶，CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜；
(2)取两支单核淋巴细胞分离离心管,在每支单核淋巴细胞分离离心管中沿预留加样口加入15ml淋巴细胞分离液，在每支离心管中从筛板挡网处加入采集常规外周血或脐带血30ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，2000rpm/min，离心23min；
(3)收集步骤(2)中上层血浆，将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体；3000rpm/min，离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管，放置于4℃冰箱备用；
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞，洗两次，获得全部的单核细胞；
(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,用30ml无血清淋巴细胞培养基重悬细胞并接种细胞，补加一支扩增因子NK-C和步骤(3)中备用的自体血清2ml，将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(6)培养第3天，收集培养的NK细胞,1200rpm/min,离心5min,弃上清；重悬细胞，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(7)培养第5天，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(8)培养第6天，取细胞培养袋，加入一支预处理因子NK-B和20ml淋巴细胞培养基，包被培养袋；CO2培养箱孵育两小时或4℃过夜；
(9)培养第7天，补加120ul扩增因子NK-D、100ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml，并将细胞悬液完全转移至预包被的培养袋中培养；
(10)培养第9天，补加240ul扩增因子NK-D、240ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml；
(11)培养第11天，补加一支扩增因子NK-E、剩余全部无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中剩余全部备用自体血清；
(12)培养第14天，收集细胞。
采用NK细胞培养试剂盒的使用方法得到的NK细胞。
本发明的有益效果:试剂盒采用联合包被技术，在NK细胞培养过程中用多种细胞因子诱导细胞扩增，增强杀伤活性；带有方便的细胞培养工具，使培养简便，稳定。本发明培养方法能在少量血液样本的情况下,短时间内便捷的获得大量的NK细胞，其中NK(CD3-CD56+)比例达到60％以上。
附图说明
图1是本发明单核淋巴细胞分离离心管结构示意图；
图2是本发明细胞加样预灌支架结构示意图；
图3是本发明细胞培养袋托盘结构示意图；
图4是本发明实施例1细胞流式检测图。
具体实施方式
本发明使用NK细胞培养试剂盒及培养NK细胞的方法，该细胞培养方法采用联合包被技术，并在NK细胞培养过程中用多种细胞因子诱导细胞扩增，增强其杀伤活性,其中NK耗材套盒提供了简单便捷的操作工具,下面结合附图和具体实施方式对本试剂盒作进一步详细说明:
本发明的NK细胞培养试剂盒,试剂盒包含NK试剂套盒和NK耗材套盒：
NK试剂套盒包括：一支10ul预处理因子NK-A、一支40ul预处理因子NK-B、一支40ul扩增因子NK-C、一支500ul扩增因子NK-D、一支500ul扩增因子NK-E和一瓶1000ml无血清淋巴细胞培养基，按质量浓度，各因子的成分如下，溶剂为无血清淋巴细胞培养基；
预处理因子NK-A：
CD16mAb 2-5mg/ml
Retronectin 5-10mg/ml
预处理因子NK-B：
CD16mAb 2-5mg/ml
扩增因子NK-C：
15000IU/ug IL-2 35-60ug/ml
7000IU/ug IL-12 50-100ug/ml
7000IU/ug IL-15 25-50ug/ml
扩增因子NK-D：
15000IU/ug IL-2 35ug-60ug/ml
7000IU/ug IL-15 25ug-50ug/ml
扩增因子NK-E：
15000IU/ug IL-2 35ug-60ug/ml
7000IU/ug IL-12 25-50ug/ml
7000IU/ug IL-15 25-50ug/ml
NK耗材套盒包括：两支单核淋巴细胞分离离心管、一个细胞加样预灌支架、一个细胞培养袋和一个细胞培养袋托盘。
如图1所示，所述单核淋巴细胞分离离心管由聚丙烯离心管2和水平固定在聚丙烯离心管中的多孔异形筛板1组成，靠近管壁处的多孔异形筛板1上有方便加入淋巴细胞分离液的缺口3，筛板档网的孔径为20-40μm。
所述聚丙烯离心管2为50ml，多孔异形筛板1固定于15ml刻度处。
如图2所示，所述细胞加样预灌支架由托板4和支架组成，支架包括第一支架板5和第二支架板6，托板4与第一支架板5之间、第一支架板5和第二支架板6之间均采用旋转卡扣式结构连接，第一支架板5旋转270°后固定，第二支架板6旋转90°固定，使第一支架板5垂直于托板4上，第二支架板6平行托板4并相距一定距离，第二支架板6为双层隔板，与旋转卡扣相对的一侧带有开口的“U”槽，两层隔板之间预留5mm距离，使注射器空桶托耳能水平推入两层隔板之间。
如图3所示，所述细胞培养袋托盘为四方形，细胞培养袋托盘底部设置有方便气体交换的多个透气孔7，细胞培养袋托盘上面四角设置有使多个细胞培养袋托盘重叠放置的水平托耳8。可使样本重叠放置，增加培养箱利用率。
上述NK细胞培养试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)取T-75细胞培养瓶，加入5ml无血清淋巴细胞培养基、一支预处理因子NK-A，包被培养瓶，CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜；
(2)取两支单核淋巴细胞分离离心管,在每支单核淋巴细胞分离离心管中沿预留加样口加入15ml淋巴细胞分离液，在每支离心管中从筛板挡网处加入采集常规外周血或脐带血30ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，2000rpm/min，离心23min；
(3)收集步骤(2)中上层血浆，将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体；3000rpm/min，离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管，放置于4℃冰箱备用；
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞，洗两次，获得全部的单核细胞；
(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,用30ml无血清淋巴细胞培养基重悬细胞并接种细胞，补加一支扩增因子NK-C和步骤(3)中备用的自体血清2ml，将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(6)培养第3天，收集培养的NK细胞,1200rpm/min,离心5min,弃上清；重悬细胞，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(7)培养第5天，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(8)培养第6天，取细胞培养袋，加入一支预处理因子NK-B和20ml淋巴细胞培养基，包被培养袋；CO2培养箱孵育两小时或4℃过夜；
(9)培养第7天，补加120ul扩增因子NK-D、100ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml，并将细胞悬液完全转移至预包被的培养袋中培养；
(10)培养第9天，补加240ul扩增因子NK-D、240ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml；
(11)培养第11天，补加一支扩增因子NK-E、剩余全部无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中剩余全部备用自体血清；
(12)培养第14天，收集细胞。计算细胞总数并通过流式细胞检测方法确定其中NK细胞的比例。
采用NK细胞培养试剂盒的使用方法得到的NK细胞。
溶剂为Lonza公司无血清淋巴细胞培养基，其货号为：04-418Q。
所述步骤(12)中，所述NK细胞的比例是指CD3-CD56+的比例。
所述步骤(1)和(8)中采用预包技术，培养瓶采用Retronectin和CD16mAb蛋白联合包被，培养第七天培养袋用CD16mAb包被。
所示步骤(6)中培养第三天更换新的培养体系,新的培养体系中不含有IL-12。更换培养体系较大程度去除了血小板、析出蛋白、死亡细胞碎片和DNA对NK细胞生长的影响；
所示步骤(5)到步骤(11)中细胞扩增因子添加比例和添加时间。细胞因子添加比例及时间能较高的抑制T细胞扩增，提高NK细胞的比例；
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
实施例1
(1)实验前一天取T-75细胞培养瓶，加入5ml无血清淋巴细胞培养基(Lonza公司无血清淋巴细胞培养基，货号为：04-418Q)、一支预处理因子NK-A，包被培养瓶，4℃过夜；
(2)取两支单核淋巴细胞分离离心管,在每支单核淋巴细胞分离离心管中沿预留加样口加入15ml淋巴细胞分离液，在每支离心管中从筛板挡网处加入采集常规外周血30ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，2000rpm/min，离心23min；
(3)收集步骤(2)中上层血浆，将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体；3000rpm/min，离心8min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管，共计26ml,放置于4℃冰箱备用；
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞，洗两次，获得全部的单核细胞,计数为5.2*107；
(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,用30ml无血清淋巴细胞培养基重悬细胞并接种细胞，补加一支扩增因子NK-C和步骤(3)中备用的自体血清2ml，将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(6)培养第3天，收集培养的NK细胞,1200rpm/min,离心5min,弃上清。重悬细胞，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(7)培养第5天，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(8)培养第6天，取细胞培养袋，加入一支预处理因子NK-B和20ml淋巴细胞培养基，包被培养袋。CO2培养箱孵育两小时或4℃过夜。
(9)培养第7天，补加120ul扩增因子NK-D、100ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml，并将细胞悬液完全转移至预包被的培养袋中培养；
(10)培养第9天，补加240ul扩增因子NK-D、240ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml；
(11)培养第11天，补加一支扩增因子NK-E、剩余全部无血清淋巴细胞培养基490ml和步骤(3)中剩余全部备用自体血清3ml；
(12)培养第14天，将细胞培养袋中的所有细胞收获，计算细胞总数为2.9*109，台盼蓝拒染率98％,流式细胞检测方法确定其中NK细胞(CD3-CD56+)的比例为61％(图4)。
实施例2
(1)实验前一天取T-75细胞培养瓶，加入5ml无血清淋巴细胞培养基(Lonza公司无血清淋巴细胞培养基，货号为：04-418Q)、一支预处理因子NK-A，包被培养瓶，4℃过夜；
(2)取两支单核淋巴细胞分离离心管,在每支单核淋巴细胞分离离心管中沿预留加样口加入15ml淋巴细胞分离液，在每支离心管中从筛板挡网处加入采集常规外周血30ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，2000rpm/min，离心23min；
(3)收集步骤(2)中上层血浆，将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体；3000rpm/min，离心8min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管，共计24ml,放置于4℃冰箱备用；
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞，洗两次，获得全部的单核细胞,计数为7*107；
(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,用30ml无血清淋巴细胞培养基重悬细胞并接种细胞，补加一支扩增因子NK-C和步骤(3)中备用的自体血清2ml，将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(6)培养第3天，收集培养的NK细胞,1200rpm/min,离心5min,弃上清。重悬细胞，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(7)培养第5天，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(8)培养第6天，取细胞培养袋，加入一支预处理因子NK-B和20ml淋巴细胞培养基，包被培养袋。CO2培养箱孵育两小时或4℃过夜。
(9)培养第7天，补加120ul扩增因子NK-D、100ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml，并将细胞悬液完全转移至预包被的培养袋中培养；
(10)培养第9天，补加240ul扩增因子NK-D、240ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml；
(11)培养第11天，补加一支扩增因子NK-E、剩余全部无血清淋巴细胞培养基490ml和步骤(3)中剩余全部备用自体血清3ml；
(11)培养第14天，将细胞培养袋中的所有细胞收获，计算细胞总数为3.7*109，台盼蓝拒染率97％。
本发明立足于免疫细胞NK细胞的体外大规模诱导方法，其在临床上巨大的应用前景。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (7)

1.一种NK细胞培养试剂盒,其特征在于，试剂盒包含NK试剂套盒和NK耗材套盒：
NK试剂套盒包括：一支10ul预处理因子NK-A、一支40ul预处理因子NK-B、一支40ul扩增因子NK-C、一支500ul扩增因子NK-D、一支500ul扩增因子NK-E和一瓶1000ml无血清淋巴细胞培养基，按质量浓度，各因子的成分如下，溶剂为无血清淋巴细胞培养基；
预处理因子NK-A：
CD16mAb 2-5mg/ml
Retronectin 5-10mg/ml
预处理因子NK-B：
CD16mAb 2-5mg/ml
扩增因子NK-C：
15000IU/ug IL-2 35-60ug/ml
7000IU/ug IL-12 50-100ug/ml
7000IU/ug IL-15 25-50ug/ml
扩增因子NK-D：
15000IU/ug IL-2 35ug-60ug/ml
7000IU/ug IL-15 25ug-50ug/ml
扩增因子NK-E：
15000IU/ug IL-2 35ug-60ug/ml
7000IU/ug IL-12 25-50ug/ml
7000IU/ug IL-15 25-50ug/ml
NK耗材套盒包括：两支单核淋巴细胞分离离心管、一个细胞加样预灌支架、一个细胞培养袋和一个细胞培养袋托盘。
2.根据权利要求1所述NK细胞培养试剂盒，其特征在于，所述单核淋巴细胞分离离心管由聚丙烯离心管(2)和水平固定在聚丙烯离心管中的多孔异形筛板(1)组成，靠近管壁处的多孔异形筛板(1)上有方便加入淋巴细胞分离液的缺口(3)，筛板档网的孔径为20-40μm。
3.根据权利要求2所述NK细胞培养试剂盒，其特征在于，所述聚丙烯离心管(2)为50ml，多孔异形筛板(1)固定于15ml刻度处。
4.根据权利要求1所述NK细胞培养试剂盒，其特征在于，所述细胞加样预灌支架由托板(4)和支架组成，支架包括第一支架板(5)和第二支架板(6)，托板(4)与第一支架板(5)之间、第一支架板(5)和第二支架板(6)之间均采用旋转卡扣式结构连接，第一支架板(5)旋转270°后固定，第二支架板(6)旋转90°固定，使第一支架板(5)垂直于托板(4)上，第二支架板(6)平行托板(4)并相距一定距离，第二支架板(6)为双层隔板，与旋转卡扣相对的一侧带有开口的“U”槽，两层隔板之间预留5mm距离，使注射器空桶托耳能水平推入两层隔板之间。
5.根据权利要求1所述NK细胞培养试剂盒，其特征在于，所述细胞培养袋托盘为四方形，细胞培养袋托盘底部设置有方便气体交换的多个透气孔(7)，细胞培养袋托盘上面四角设置有使多个细胞培养袋托盘重叠放置的水平托耳(8)。
6.如权利要求1-5任一项所述NK细胞培养试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取T-75细胞培养瓶，加入5ml无血清淋巴细胞培养基、一支预处理因子NK-A，包被培养瓶，CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜；
(2)取两支单核淋巴细胞分离离心管,在每支单核淋巴细胞分离离心管中沿预留加样口加入15ml淋巴细胞分离液，在每支离心管中从筛板挡网处加入采集常规外周血或脐带血30ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，2000rpm/min，离心23min；
(3)收集步骤(2)中上层血浆，将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体；3000rpm/min，离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管，放置于4℃冰箱备用；
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞，洗两次，获得全部的单核细胞；
(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,用30ml无血清淋巴细胞培养基重悬细胞并接种细胞，补加一支扩增因子NK-C和步骤(3)中备用的自体血清2ml，将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
(6)培养第3天，收集培养的NK细胞,1200rpm/min,离心5min,弃上清；重悬细胞，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(7)培养第5天，补加60ul扩增因子NK-D、60ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清3ml；
(8)培养第6天，取细胞培养袋，加入一支预处理因子NK-B和20ml淋巴细胞培养基，包被培养袋；CO2培养箱孵育两小时或4℃过夜；
(9)培养第7天，补加120ul扩增因子NK-D、100ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml，并将细胞悬液完全转移至预包被的培养袋中培养；
(10)培养第9天，补加240ul扩增因子NK-D、240ml无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中备用的自体血清6ml；
(11)培养第11天，补加一支扩增因子NK-E、剩余全部无血清淋巴细胞培养基和步骤(3)中剩余全部备用自体血清；
(12)培养第14天，收集细胞。
7.如权利要求6所述采用NK细胞培养试剂盒的使用方法得到的NK细胞。
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