CN106635983A - 使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存cik细胞的方法及得到的cik细胞 - Google Patents
使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存cik细胞的方法及得到的cik细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106635983A CN106635983A CN201610911587.0A CN201610911587A CN106635983A CN 106635983 A CN106635983 A CN 106635983A CN 201610911587 A CN201610911587 A CN 201610911587A CN 106635983 A CN106635983 A CN 106635983A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- culture
- frozen
- serum
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法及得到的CIK细胞,该细胞培养方法能够在不引入动物源血清的情况下短时间培养出3*109个淋巴细胞;该细胞冻存方法能最大限度提高冻存目的细胞比例和细胞复苏后活率。该方法为CIK细胞培养、储存和相关临床研究提供便利。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域,尤其是一种使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法及得到的CIK细胞,是一套可标准化生产操作的方法。
背景技术
2000年国际肿瘤生物治疗及基因治疗年会中指出“免疫细胞疗法是现代科技中唯一有可能彻底清除癌症细胞的方法”。梦想照进现实,癌症正在逐渐被我们战胜。细胞免疫疗法是除手术、放疗、化疗以外的第四大癌症治疗模式。但增龄与疾病时刻挑战着我们的免疫系统,储存年轻正常的自体免疫细胞变得十分必要。世界范围的免疫细胞库建设已具有一定规模。
目前主流的冻存方法是直接冻存PBMC或扩增完成后冻存。直接冻存PBMC细胞冻存数量较少,且细胞活力较对数期生长细胞低,加上冻存细胞成分的复杂性,复苏后大量细胞死亡,影响后期培养。扩增完成后冻存细胞工作量较大,且复苏细胞活性不能很好保证。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,提供一种CIK细胞的简便安全的使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法及得到的CIK细胞。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,采用联合包被技术,在CIK细胞培养过程中用多种细胞因子诱导细胞扩增,增强杀伤活性;利用自体血清配置冻存液,并选取对数期生长细胞冻存。
具体地,包括如下步骤:
(1)用含Retronectin和CD3mAb蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被培养瓶,CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜;
(2)采集常规外周血或脐带血,Ficoll-Hypaque密度梯度离心,2000rpm/min,离心25min;
(3)收集步骤(2)中上层血浆,将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体;3000rpm/min,离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管,放置于4℃冰箱备用;
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞,洗两次,获得全部的单核细胞;
(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,重悬细胞并按照细胞接种密度(2-10)*105/ml加入无血清淋巴细胞培养基,补加步骤(3)中备用的自体血清和INF-γ,并将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养;
(6)培养第1天,补加IL-1α、IL-2;
(7)培养第5天,取刚进入对数期生长的CIK细胞,制备单细胞悬液,并对细胞进行计数,细胞计数后以1500rpm/min,离心6min,倒弃上清液;
(8)取步骤(3)中备用的自体血清,与DMSO按比例配置细胞冻存液;
(9)根据计数,调整细胞冻存浓度,加入低温冻存液重悬细胞,并将冻存终细胞悬液分装至冻存管中,按照程序降温冻存细胞。
所述步骤(1)中预包被培养瓶使用0.5-1ug/ml的Retronectin和2-5ug/ml CD3mAb蛋白联合包被。
所述步骤(5)中培养第0天补加INF-γ终浓度为500-1000U/ml,按体积百分比,加入自体血清为培养体系的5%-10%。
所述步骤(6)中培养第一天补加IL-1α终浓度为0.05-0.2U/ml、IL-2终浓度为500-1000U/ml。
所述步骤(8)中细胞冻存液采用自体血清和DMSO按照体积比例9:1配制。
所述步骤(9)中冻存细胞终浓度确定为(1-2)*107/ml。
上述使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法得到的CIK细胞。
本发明的有益效果:本发明培养方法能短时间内扩增出3*109以上的淋巴细胞,其中CIK(CD3+CD56+)比例达到25%以上;该细胞冻存方法够在不引入外源动物血清的情况下保证细胞特性不变,提高冻存复苏细胞活性,保证扩增效率。
附图说明
图1是本发明实施例1细胞流式检测图。
具体实施方式
本发明使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,该细胞培养方法采用联合包被技术,并在CIK细胞培养过程中用多种细胞因子诱导细胞扩增,增强其杀伤活性;细胞冻存方法利用自体血清配置冻存液,并恰当选取对数期生长细胞冻存。
包括如下步骤:
(1)用含Retronectin和CD3mAb蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被培养瓶,CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜;
(2)采集常规外周血或脐带血,Ficoll-Hypaque密度梯度离心,2000rpm/min,离心25min;
(3)收集步骤(2)中上层血浆,将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体;3000rpm/min,离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管,放置于4℃冰箱备用;
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞,洗两次,获得全部的单核细胞;
(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,重悬细胞并按照细胞接种密度(2-10)*105/ml加入无血清淋巴细胞培养基,补加步骤(3)中备用的自体血清和INF-γ,并将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养;
(6)培养第1天,补加IL-1α、IL-2;
(7)培养第5天,取刚进入对数期生长的CIK细胞,制备单细胞悬液,并对细胞进行计数,细胞计数后以1500rpm/min,离心6min,倒弃上清液;
(8)取步骤(3)中备用的自体血清,与DMSO按比例配置细胞冻存液;
(9)根据计数,调整细胞冻存浓度,加入低温冻存液重悬细胞,并将冻存终细胞悬液分装至冻存管中,按照程序降温冻存细胞。
所述步骤(1)中预包被培养瓶使用0.5-1ug/ml的Retronectin和2-5ug/ml CD3mAb蛋白联合包被。
所述步骤(5)中培养第0天补加INF-γ终浓度为500-1000U/ml,按体积百分比,加入自体血清为培养体系的5%-10%。
所述步骤(6)中培养第一天补加IL-1α终浓度为0.05-0.2U/ml、IL-2终浓度为500-1000U/ml。
所述步骤(8)中细胞冻存液采用自体血清和DMSO按照体积比例9:1配制。
所述步骤(9)中冻存细胞终浓度确定为(1-2)*107/ml。
上述使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法得到的CIK细胞。
具体地说,包括如下步骤:
(1)用10ml含Retronectin和CD3mAb蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被一个T175培养瓶,CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜;
(2)取采集常规外周血或脐带血60ml,Ficoll-Hypaque密度梯度离心,2000rpm/min,离心25min;
(3)收集步骤(2)中上层血浆于50ml离心管并编号,将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体;3000rpm/min,离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至新的离心管,并放置于4℃冰箱备用;
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞,洗两次,最终获得(4-10)*107个单核细胞;
(5)取步骤(1)中包被的T175培养瓶,重悬细胞并按照细胞接种密度(2-5)*105/ml加入无血清淋巴细胞培养基(LONZA公司的X-VIVO 15培养基)至T175细胞培养瓶中,并按照培养体系补加上述自体血清和INF-γ,并将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养;
(6)培养第1天,按照培养体系加入IL-1α、IL-2;
(7)培养第5天,取刚进入对数期生长的CIK细胞,制备单细胞悬液,并对细胞进行计数,细胞计数后以1500rpm/min,离心6min,倒弃上清液;
(8)取步骤(3)中备用血清,与DMSO按比例配置细胞冻存液;
(9)根据计数,调整细胞冻存浓度,加入低温冻存液重悬细胞(细胞浓度调整至(1-2)*107/ml),并将冻存终细胞悬液分装至冻存管中,编号并按照程序降温(1℃/min)冻存细胞;
(10)液氮中取需要复苏细胞,迅速解冻,离心洗去冻存液,将细胞按1*106/ml加入无血清淋巴细胞培养基接种细胞于T175培养瓶中,并按照培养体系加入INF-γ、IL-2,放入二氧化碳培养箱培养;
(11)复苏第3天,根据细胞生长状态,补加含IL-2的无血清淋巴细胞培养基使细胞密度控制在1*106/ml,并将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液转移到一个1.8升容量的细胞培养袋中进行培养;
(12)复苏第5天、第7天、第9天、第11天,根据细胞生长状态,补加含IL-2的无血清淋巴细胞培养基,使之一倍于原培养体系或使细胞密度控制在1*106/ml;
(13)复苏第13天,将细胞培养袋中的所有细胞收获,计算细胞总数并通过流式细胞检测方法确定其中CIK细胞的比例。
所述步骤(1)中预包被T175培养瓶使用0.5-1ug/ml的Retronectin和2-5ug/mlCD3mAb蛋白联合包被。
所述步骤(5)中培养第0天补加INF-γ终浓度为500-1000U/ml,加入自体血浆为培养体系的5-10%(体积分数)。
所述步骤(6)中培养第一天使用IL-1α终浓度为0.05-0.2U/ml、IL-2终浓度为500-1000U/ml。
所述步骤(8)中细胞冻存液采用自体血清和DMSO按照体积比例9:1配制。
所述步骤(9)中冻存细胞终浓度确定为(1-2)*107/ml。
所述步骤(10)中复苏细胞按照培养体系加入INF-γ终浓度为500-1000U/ml、IL-2终浓度为500-1000U/ml,并确定复苏细胞接种密度为(5-10)*105/ml。
所述步骤(12)中培养后期加入的淋巴细胞培养基始终含500-1000U/ml的IL-2,并确定补液时间为隔天补液。
所述步骤(13)中,所述CIK细胞的比例是指CD3+CD56+达到25%以上,台盼蓝拒染率≥90%。
上述使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法得到的CIK细胞。
本发明的培养方案中采用无血清淋巴细胞培养基及包被技术,结合细胞因子扩增目的细胞。冻存方案采用培养第五天的细胞,分离出的单核细胞经过刺激培养,不单提高了CIK细胞CD3+CD56+的阳性率,且减少了杂细胞冻存复苏带来的干扰。冻存时间的选择不但使冻存细胞处于对数生长期更适宜冻存,冻存复苏后活率更高,且控制了冻存细胞数量,便于操作,为后期刺激培养提供条件;本发明采用10%的DMSO+90%的自体血清作为冻存液,能够提高细胞膜对水的通透性,保证细胞外结晶水短时间冻住,避免水分渗入对细胞造成损伤,且不引入动物源血清。本方法适用于CIK细胞的长期冻存,与现有直接冻存白膜层细胞比较,显著提高了目的细胞冻存比例,节省了冻存成本,复苏后细胞活性显著高于直接冻存白膜层细胞,实现了CIK细胞的长期保存。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明:
实施例1
(1)用10ml含Retronectin(1ug/ml)和CD3mAb(5ug/ml)蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被一个T175培养瓶,CO2培养箱孵育2小时。
(2)采集常规脐带血约60ml,Ficoll-Hypaque密度梯度离心,2000rpm/min离心25min(离心参数中加速度调整为1、刹车调整为1)。
(3)收集步骤(2)中上层血浆于50ml离心管并编号,将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体。之后,3000rpm/min离心6min除去血浆中析出物,并将上层血清27ml转移至新的离心管,并放置于4℃冰箱备用。
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞,洗两次,最终获得4.6*107个单核细胞。
(5)取包被的T175培养瓶。按照细胞密度3*105/ml加入133ml无血清淋巴细胞培养基至T175细胞培养瓶中,并按照培养体系补加自体血清7.6ml、INF-γ(终浓度500U/ml)。将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养。
(6)培养第1天,加入IL-1α(终浓度0.1U/ml)、IL-2(终浓度500U/ml)。
(7)培养第5天,取刚进入对数期生长的CIK细胞,制备单细胞悬液,并对细胞进行计数。计数结果为:2.9*108。计数后以1500rpm/min,离心6min,倒弃上清液。
(8)取(3)步骤中备用自体血清,按体积10%的DMSO+90%的自体血清配制细胞冻存液15ml,即血清13.5ml+DMSO 1.5ml。
(9)按照冻存细胞终浓度2*107/ml加入14.5ml低温冻存液,并将冻存终细胞悬液分装至2ml冻存管中,每管1.5ml,并按照程序降温(1℃/min)冻存细胞。
(10)冻存一个月后,从液氮中取出步骤(9)中的3管细胞,迅速解冻,并将细胞转移至平衡至室温的15ml淋巴细胞培养基中,1500rpm/min 6min离心洗去冻存液,取20ml淋巴细胞培养基重悬细胞,台盼蓝拒染率94%,回收率85%。将细胞按1*106/ml加入72ml无血清淋巴细胞培养基接种细胞于T175培养瓶中。按照培养体系加入INF-γ(终浓度500U/ml)、IL-2(终浓度500U/ml),放入二氧化碳培养箱培养。
(11)复苏第3天,根据细胞生长状态,补加含IL-2(终浓度500U/ml)的无血清淋巴细胞培养基100ml,并将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液转移到一个1.8升容量的细胞培养袋中进行培养。
(12)复苏第5天、第7天、第9天、第11天,根据细胞生长状态,补加含IL-2的无血清淋巴细胞培养基150ml、300ml、400ml、400ml。
(13)复苏第13天,将细胞培养袋中的所有细胞收获,计算细胞总数为3.8*109,台盼蓝拒染率97%,流式细胞检测方法确定其中CIK细胞(CD3+CD56+)的比例为34%(图1)。
实施例2
(1)用10ml含Retronectin(1ug/ml)和CD3mAb(5ug/ml)蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被一个T175培养瓶,4℃过夜。
(2)取采集的常规外周血约60ml,Ficoll-Hypaque密度梯度离心,2000rpm/min离心25min(离心参数中加速度调整为1、刹车调整为1)。
(3)收集步骤(2)中上层血浆于50ml离心管并编号,将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体。之后,3000rpm/min离心6min除去血浆中析出物,并将上层血清33ml转移至新的离心管,并放置于4℃冰箱备用。
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞,洗两次,最终获得8*107个单核细胞。
(5)取包被的T175培养瓶。按照细胞密度4*105/ml加入180ml无血清淋巴细胞培养基至T175细胞培养瓶中,并按照培养体系补加10ml自体血清、INF-γ(终浓度500U/ml)。将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养。
(6)培养第1天,加入IL-1α(终浓度0.1U/ml)、IL-2(终浓度500U/ml)。
(7)培养第5天,取刚进入对数期生长的CIK细胞,制备单细胞悬液,并对细胞进行计数。计数结果为:3.8*108。计数后以1500rpm/min,离心6min,倒弃上清液。
(8)取(3)步骤中备用自体血清,按体积10%的DMSO+90%的自体血清配制细胞冻存液20ml,即血清18ml+DMSO 2ml。
(9)按照冻存细胞终浓度2*107/ml加入19ml低温冻存液,并将冻存终细胞悬液分装至2ml冻存管中,每管1.5ml,并按照程序降温冻存细胞。
(10)冻存3个月后,从液氮中取出步骤(9)中编号的3管细胞,迅速解冻,并将细胞转移至平衡至室温的15ml淋巴细胞培养基中,1500rpm/min 6min离心洗去冻存液,取20ml淋巴细胞培养基重悬细胞,台盼蓝拒染率91%,回收率88%。将细胞按1*106/ml加入72ml无血清淋巴细胞培养基接种细胞于T175培养瓶中。按照培养体系加入INF-γ(终浓度500U/ml)、IL-2(终浓度500U/ml),放入二氧化碳培养箱培养。
(11)复苏第3天,根据细胞生长状态,补加含IL-2(终浓度500U/ml)的无血清淋巴细胞培养基100ml,并将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液转移到一个1.8升容量的细胞培养袋中进行培养。
(12)复苏第5天、第7天、第9天、第11天,根据细胞生长状态,补加含IL-2的无血清淋巴细胞培养基150ml、300ml、400ml、400ml。
(13)复苏第13天,将细胞培养袋中的所有细胞收获,计算细胞总数为3.2*109,台盼蓝拒染率98%,流式细胞检测方法确定其中CIK细胞(CD3+CD56+)的比例为29%。
本发明立足于免疫细胞CIK细胞的体外大规模诱导方法,其在临床上巨大的应用前景。
综上所述,本发明的内容并不局限在上述的实施例中,相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例,但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (8)
1.一种使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,其特征在于,采用联合包被技术,在CIK细胞培养过程中用多种细胞因子诱导细胞扩增,增强杀伤活性;利用自体血清配置冻存液,并选取对数期生长细胞冻存。
2.根据权利要求1中所述使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)用含Retronectin和CD3mAb蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被培养瓶,CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜;
(2)采集常规外周血或脐带血,Ficoll-Hypaque密度梯度离心,2000rpm/min,离心25min;
(3)收集步骤(2)中上层血浆,将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体;3000rpm/min,离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管,放置于4℃冰箱备用;
(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞,洗两次,获得全部的单核细胞;
(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,重悬细胞并按照细胞接种密度(2-10)*105/ml加入无血清淋巴细胞培养基,补加步骤(3)中备用的自体血清和INF-γ,并将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养;
(6)培养第1天,补加IL-1α、IL-2;
(7)培养第5天,取刚进入对数期生长的CIK细胞,制备单细胞悬液,并对细胞进行计数,细胞计数后以1500rpm/min,离心6min,倒弃上清液;
(8)取步骤(3)中备用的自体血清,与DMSO按比例配置细胞冻存液;
(9)根据计数,调整细胞冻存浓度,加入低温冻存液重悬细胞,并将冻存终细胞悬液分装至冻存管中,按照程序降温冻存细胞。
3.根据权利要求2所述的使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,其特征在于,所述步骤(1)中预包被培养瓶使用0.5-1ug/ml的Retronectin和2-5ug/ml CD3mAb蛋白联合包被。
4.根据权利要求2所述的使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,其特征在于,所述步骤(5)中培养第0天补加INF-γ终浓度为500-1000U/ml,按体积百分比,加入自体血清为培养体系的5%-10%。
5.根据权利要求2所述的使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,其特征在于,所述步骤(6)中培养第一天补加IL-1α终浓度为0.05-0.2U/ml、IL-2终浓度为500-1000U/ml。
6.根据权利要求2所述的使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,其特征在于,所述步骤(8)中细胞冻存液采用自体血清和DMSO按照体积比例9:1配制。
7.根据权利要求2所述的使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,其特征在于,所述步骤(9)中冻存细胞终浓度确定为(1-2)*107/ml。
8.如权利要求1-7任一项所述使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法得到的CIK细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610911587.0A CN106635983A (zh) | 2016-10-19 | 2016-10-19 | 使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存cik细胞的方法及得到的cik细胞 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610911587.0A CN106635983A (zh) | 2016-10-19 | 2016-10-19 | 使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存cik细胞的方法及得到的cik细胞 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106635983A true CN106635983A (zh) | 2017-05-10 |
Family
ID=58856264
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610911587.0A Pending CN106635983A (zh) | 2016-10-19 | 2016-10-19 | 使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存cik细胞的方法及得到的cik细胞 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106635983A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107801711A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-03-16 | 南京盖斯夫医药科技有限公司 | 一种以白术内酯ⅱ为保护成分的cik细胞冻存液 |
CN109402053A (zh) * | 2018-10-17 | 2019-03-01 | 广州元帅生物科技有限公司 | 一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104651307A (zh) * | 2013-11-21 | 2015-05-27 | 孙勇 | 一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术 |
CN105062968A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-18 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 |
CN105624111A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-06-01 | 赵慧慧 | 培养扩增高增殖力、高细胞毒活性dc-cik细胞的培养试剂 |
CN105779390A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-07-20 | 王盛 | 一种免疫增强型capri细胞制备方法 |
CN105831106A (zh) * | 2016-05-10 | 2016-08-10 | 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 | 血液中dc细胞及cik种子细胞的冻存方法及制备的细胞与用途 |
-
2016
- 2016-10-19 CN CN201610911587.0A patent/CN106635983A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104651307A (zh) * | 2013-11-21 | 2015-05-27 | 孙勇 | 一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术 |
CN105062968A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-18 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 |
CN105624111A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-06-01 | 赵慧慧 | 培养扩增高增殖力、高细胞毒活性dc-cik细胞的培养试剂 |
CN105779390A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-07-20 | 王盛 | 一种免疫增强型capri细胞制备方法 |
CN105831106A (zh) * | 2016-05-10 | 2016-08-10 | 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 | 血液中dc细胞及cik种子细胞的冻存方法及制备的细胞与用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
杜微丽: "纤维连接蛋白诱导的CIK细胞的生物学特性和杀瘤活性的实验研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107801711A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-03-16 | 南京盖斯夫医药科技有限公司 | 一种以白术内酯ⅱ为保护成分的cik细胞冻存液 |
CN109402053A (zh) * | 2018-10-17 | 2019-03-01 | 广州元帅生物科技有限公司 | 一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105238754B (zh) | 一种高增殖力和高杀伤力nk细胞的体外培养方法 | |
CN108220239B (zh) | 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用 | |
CN103210903B (zh) | 一种用于保存cik细胞的冻存液及其应用 | |
CN104542576B (zh) | 一种神经干细胞的冻存液及其使用方法 | |
CN102994448A (zh) | 一种体外扩增γδT细胞的方法 | |
CN105238752A (zh) | 一种高效体外扩增自体nk细胞的培养体系及培养方法 | |
CN108004211B (zh) | 一种体外活化扩增自然杀伤细胞的方法 | |
CN102978161A (zh) | Dc-cik细胞分离培养试剂盒及其应用 | |
CN105754941A (zh) | 一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法 | |
CN105296426B (zh) | 一种nk细胞的诱导培养方法 | |
CN102321581A (zh) | 腹水肿瘤细胞致敏dc-cik的制备方法 | |
CN104789527A (zh) | 一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法及其试剂盒产品 | |
CN107475192A (zh) | 一种以记忆干t细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法 | |
CN104593326A (zh) | 一种中药诱导增强型dc-cik细胞的制备方法及其应用 | |
CN105543169A (zh) | 一种人tscm细胞的制备方法及应用 | |
CN103710307A (zh) | Cik细胞培养方法及其应用 | |
CN105462923A (zh) | 一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法 | |
CN106635983A (zh) | 使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存cik细胞的方法及得到的cik细胞 | |
CN104371973B (zh) | 一种免疫细胞的无血清培养基 | |
CN104450613A (zh) | 一种利于自体骨髓间充质干细胞在体外培养的细胞培养基 | |
CN107083362A (zh) | 一种自体nk细胞制备方法及实施该方法的试剂盒 | |
CN105176926A (zh) | 一种体外培养扩增nk细胞的方法 | |
CN106754705A (zh) | 一种nk细胞培养基及体外扩增nk细胞的方法 | |
CN110272871A (zh) | 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用 | |
CN106399245A (zh) | 一种γδT细胞的培养方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170510 |